胶原蛋白-整联蛋白α2β1相互作用的多肽抑制剂及筛选方法
【专利摘要】本发明公开胶原蛋白-整联蛋白α2β1相互作用的多肽抑制剂及筛选方法；首次提出的胶原蛋白-整联蛋白α2β1相互作用的多肽抑制剂为：LWWNSYY、LRWNSPY和LYWNSGY。根据分子力学-泊松-波尔兹曼溶剂可及表面积分析方法，解析胶原蛋白短肽与血小板表面的整联蛋白α2β1相互作用，获得具有亲和作用的关键残基，藉此构建胶原蛋白与整联蛋白α2β1相互作用的多肽抑制剂库，利用分子对接、均方根偏差比较和分子动力学模拟筛选多肽，获得与胶原蛋白具有高亲和性的多肽抑制剂。通过等温滴定量热实验和血小板吸附实验证实所得多肽抑制剂能够抑制胶原蛋白与整联蛋白α2β1间的结合，是潜在的高效血栓抑制剂。
【专利说明】胶原蛋白-整联蛋白α 2β 1相互作用的多肽抑制剂及筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及胶原蛋白-整联蛋白a 2β I相互作用的多肽抑制剂的理性设计流程构建并获得新型多肽抑制剂，属于生物技术中的计算机模拟和蛋白质界面行为研究领域。
【背景技术】
[0002]血栓形成是由于血管壁发生病变,使血管内皮下组织物暴露于血浆中，诱发血液凝集并造成血管阻塞的过程，导致器官、组织的缺血性坏死，引发心血管疾病，如中风和心肌梗死。据世界卫生组织统计，每年死于心血管疾病的人数远高于癌症，居各类死因之首。其中，由于心肌梗死、脑梗死导致的死亡和残疾占据极大比例，对国家的经济和社会发展造成极大负面影响。因此，开发疗效显著、副作用小的血栓防治药物已经成为医学界研究的热点，具有重要意义。
[0003]血栓症是由多种因素共同调节的复杂过程，包括血小板在破损血管壁处的初始粘附、血小板的稳定吸附、以及血小板聚集三个重要过程。目前，市面上的药物多为针对血小板聚集过程的抗血小板凝集药物，例如，阿司匹林(Aspirin)、利多格雷(Ridogrel )、噻氯匹啶(Ticlopidine)等。这类药物的作用机理为不可逆抑制血小板胞内的关键酶活，从而使血小板处于静息状 态，以达到抑制血栓形成的目的，但同时也破坏人体的正常凝血与抗凝血的平衡，存在引发大规模出血的风险，有着较大的副作用。目前有研究报道，整联蛋白α2β1的过量表达将导致血栓的形成，而抑制其表达仅会轻微延长出血时间，并不会导致严重的出血不止的问题。因此，通过抑制血小板稳定粘附过程中整联蛋白α 2β I与胶原蛋白的结合来抑制血栓的形成，有助于减小大规模出血的风险。
[0004]整联蛋白是一种位于细胞表面的跨膜蛋白，可以通过与胞外基质的相互作用，达到调控细胞转移、吸附和信号传递的作用。其中，整联蛋白α 2β I在血栓形成过程中对于血小板在胶原蛋白表面的稳定粘附起到十分重要的作用。Emsely等人通过晶体衍射对a 2Α结构域的微观结构进行探究。结果表明，整联蛋白α 2β I与胶原蛋白结合区域为a 2Α结构域，其位于整联蛋白α2β1的a亚基中的β螺旋(β-propeller)结构的第二与第三个β折叠(β-sheet)之间，以5个反向平行的β折叠的片层结构为中心，周围围绕着7个a螺旋((1-化1^)结构，其中的残基附54、￥157和!1258都在整联蛋白与胶原蛋白结合中起到关键作用。
[0005]整联蛋白α 2β I的配体I型胶原蛋白由两条a I链和一条a 2链组成，其中三条a链交联形成三螺旋结构，此结构被证实广泛存在于动脉粥样硬化的患者引起血管梗死的斑块中。目前，GFOGER (O:羟基脯氨酸)氨基酸序列是被证明是I型胶原蛋白上结合整联蛋白α 2β I亲和性最高的位点，序列中的谷氨酸能与a 2Α结构域的金属离子结合位点(Metal ion-dependent adhesion site, MIDAS)嵌合的金属结合,进而与 MIDAS 核心处的氨基残基D151、S153、S155、T221和D254形成正八面体结构；而精氨酸能与MIDAS位点处的D219通过氢键作用结合。此外，胶原蛋白上的苯丙氨酸能通过其疏水作用与整联蛋白疏水区域结合。
[0006]由此可见，前人的研究工作主要阐明胶原蛋白上整联蛋白α2β1的特异性结合区域以及二者相互作用时相关联的氨基酸残基。但是，在胶原蛋白与整联蛋白结合界面上，并非所有氨基酸残基都对二者的结合起到促进作用，对结合产生决定性作用的关键残基以及关键作用力和调控因素尚需深入研究。因此，从分子水平揭示血栓形成过程中胶原蛋白与整联蛋白α 2β I结合的关键作用力和调控因素并藉此开发新型抑制剂对于抗血栓药物的开发有着重要意义和广阔的应用前景。
[0007]分子动力学(MD)模拟广泛应用于蛋白质界面行为的研究，尤其是分子之间的结合过程研究。常用的分子动力学模拟软件主要有GROMACS、NAMD, AMBER和CHARMM等。通过分子动力学模拟结合分子力学-泊松-波尔兹曼溶剂可及表面积分析方法不仅可以获得模拟体系的各种性质，包括构象、能量、动力学性质以及配基-目标蛋白质之间的相互作用力等，还能清晰阐述结合界面上的氨基酸残基对于结合是有利还是不利，并评估各氨基酸的相对贡献和重要程度。[0008]分子对接是两个分子之间通过几何匹配和能量匹配而相互识别的过程。分子对接计算是把配基分子放在目标蛋白结合位点处，按照几何互补、能量互补和化学环境互补的原则来评价配基与目标蛋白的结合好坏，并给出两个分子的最佳结合构象。就其原理而言，分子对接是一种基于受体的直接设计方法。近年来随着蛋白晶体结构信息的快速增长以及小分子数据库的不断更新，分子对接已经成为基于结构设计中的最重要的方法。常用软件有 DOCK、Autodock 和 FlexX 等。
[0009]采用理性设计方法，通过设计合理的组合策略可以降低成本。例如，在前期采用诸如分子对接等的计算速度快但精度有限的方法初步筛选，其后采用MD模拟等计算量大但更精确的方法筛选，而在后期则采用比较耗时且成本高的实验方法验证。
【发明内容】
[0010]本发明目的在于提出针对胶原蛋白-整联蛋白a 2β I相互作用的新型多肽抑制剂的理性设计与筛选，所得多肽抑制剂是首次提出并经验证是有效的。
[0011]本发明首次提出的胶原蛋白-整联蛋白α2β1相互作用的多肽抑制剂为:LffffNSYY、LRffNSPY 和 LYWNSGY。
[0012]本发明的的胶原蛋白-整联蛋白a 2 β I相互作用的多肽抑制剂筛选方法是，针对胶原蛋白与整联蛋白α 2β I相互作用的新型多肽抑制剂的肽库构建，序列为LXXNSXY，其中X代表20种常见氨基酸的任种。
[0013]利用分子力学-泊松-波尔兹曼溶剂可及表面积自由能计算和分解方法确定整联蛋白α2β I中与胶原蛋白结合的关键残基为Y157、N154、S155和L220。
[0014]多肽库构建依据为整联蛋白a 2 β I中4个关键残基:Υ157、Ν154、S155和L220。
[0015]在肽库的范围内，利用氨基酸定位法构建候选多肽分子库。
[0016]通过分子对接筛选、均方根偏差比较以及分子动力学模拟复筛，构建针对胶原蛋白与整联蛋白α 2β I相互作用的新型多肽抑制剂的筛选。
[0017]利用Vina分子对接软件将多肽抑制剂库中的多肽抑制剂依次与胶原蛋白片段进行对接，选取结合自由能低于-6.5 kcal/mol的多肽抑制剂，共计177个。[0018]利用GR0MACS分子模拟软件自带的g_rms程序计算Vina对接得到的177个多肽抑制剂与整联蛋白α2β I中相应的关键残基之间的均方根偏差，选择25个多肽抑制剂进行下一步的研究。
[0019]根据结合位点和原始结合模型比对对25个多肽抑制剂继续筛选，选取结合位点相似的8个多肽抑制剂进行下一步MD模拟研究。
[0020]筛选得到的8个多肽抑制剂与胶原蛋白片段进行MD模拟，再次筛选多肽抑制剂，得到在模拟时间尺度内能与胶原蛋白片段稳定结合的多肽抑制剂，结合概率Pbind分布在
0.50~1.00的范围内；筛选出LffffNSYY、LRffNSPY和LYWNSGY的结合能较小而结合概率较大的高效多肽抑制剂。
[0021]本发明首次提出的胶原蛋白-整联蛋白α2β1相互作用的多肽抑制剂为:LffffNSYY、LRWNSPY和LYWNSGY。根据分子力学-泊松-波尔兹曼溶剂可及表面积分析方法，解析胶原蛋白短肽(GpO)2GFOGER (GPO)3与血小板表面的整联蛋白α 2β I相互作用细节，获得整联蛋白α2β I中与胶原蛋白短肽具有较高亲和作用的关键残基，藉此构建胶原蛋白与整联蛋白α 2β I相互作用的多肽抑制剂库，利用分子对接、均方根偏差比较和分子动力学模拟筛选候选多肽，获得与胶原蛋白具有高亲和性的多肽抑制剂。随后通过等温滴定量热实验和血小板吸附实验证实所得多肽抑制剂能够抑制胶原蛋白与整联蛋白α2β1间的结合，是潜在的高效血栓抑制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1胶原蛋白-整联蛋白α 2 β I相互作用的多肽抑制剂的理性设计流程图
[0023]图2等温滴定量热实验的热力学参数图
[0024]图3血小板吸附实验效果图。添加不同样品的血小板溶液吸光值(600 nm)的测
定
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图对本发明作详细描述，该实施例是用于解释、而不以任何方式限制本发明。
[0026]本发明针对胶原蛋白-整联蛋白α 2 β I相互作用的新型多肽抑制剂的肽库构建，构建依据为整联蛋白α2β I中4个关键残基:Υ157、Ν154、S155和L220 ;其特征序列为LXXNSXY，其中X代表20种常见氨基酸的任一一种。
[0027]本发明的新型多肽抑制剂；理性设计方法的应用，是在上述肽库的基础上，利用氨基酸定位法构建候选多肽抑制剂库:
[0028]
【权利要求】
1.胶原蛋白-整联蛋白α2β I相互作用的多肽抑制剂其特征为:LffffNSYY、LRWNSPY和LYffNSGY0
2.权利要求1的胶原蛋白-整联蛋白α2βI相互作用的多肽抑制剂筛选方法，其特征是针对胶原蛋白与整联蛋白α2β I相互作用的新型多肽抑制剂的肽库构建，序列为LXXNSXY，其中X代表20种常见氨基酸的任一一种。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是利用分子力学-泊松-波尔兹曼溶剂可及表面积自由能计算和分解方法确定整联蛋白α2β1中与胶原蛋白结合的关键残基为Υ157、N154、S155 和 L220。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是多肽库构建依据为整联蛋白α2β1中4个关键残基: Y157、N154、S155和 L220。
5.如权利要求2或4所述的方法，其特征是:在肽库的范围内，利用氨基酸定位法构建候选多肽分子库。
6.如权利要求2所述的方法，其特征是通过分子对接筛选、均方根偏差比较以及分子动力学模拟复筛，构建针对胶原蛋白与整联蛋白α2β I相互作用的新型多肽抑制剂的筛选。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是利用Vina分子对接软件将多肽抑制剂库中的多肽抑制剂依次与胶原蛋白片段进行对接，选取结合自由能低于-6.5 kcal/mol的多肽抑制剂，共计177个。
8.如权利要求6所述的方法，其特征是利用GR0MACS分子模拟软件自带的g_rms程序计算Vina对接得到的177个多肽抑制剂与整联蛋白α 2β I中相应的关键残基之间的均方根偏差，选择25个多肽抑制剂进行研究。
9.如权利要求6所述的方法，其特征是根据结合位点和原始结合模型比对对25个多肽抑制剂继续筛选，选取结合位点相似的8个多肽抑制剂进行MD模拟研究。
10.如权利要求6所述的方法，其特征是筛选得到的8个多肽抑制剂与胶原蛋白片段进行MD模拟，再次筛选多肽抑制剂，得到在模拟时间尺度内能与胶原蛋白片段稳定结合的多肽抑制剂，结合概率Pbind分布在0.50~1.00的范围内；筛选出LffffNSYY、LRffNSPY和LYWNSGY的结合能小而结合概率大的高效多肽抑制剂。
【文档编号】C07K7/06GK103951731SQ201410151205
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】孙彦, 张麟, 张超 申请人:天津大学