一种来源于鳀鱼蒸煮废弃液的抗菌肽及其分离方法
【专利摘要】本发明涉及一种来源于鳀鱼蒸煮废弃液的抗菌肽及其分离方法，应用食品级酶制剂对鲲鱼蒸煮废弃液浓缩物进行酶解，采用模拟细胞膜平衡透析联用高效液相色谱法对其中的抗菌肽进行分离，分析纯化所得肽的氨基酸序列并验证其活性。结果表明该抗菌肽为十肽，其氨基酸序列为GLSRLFTALK。该肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等七种指示菌均有抑菌活性。GLSRLFTALK由酶水解获得，具有安全性高、抗菌性强的特点，在医药、食品和饲料行业具有潜在利用价值。该方法利用抗菌肽的模拟细胞膜结合特性，实现了靶向性分离，克服了常规肽分离的步骤多、耗时长的缺点。该发明以鱼类加工废水为原料，减少了环境污染，增加了产品附加值。
【专利说明】一种来源于鍉鱼蒸煮废弃液的抗菌肽及其分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种来源于鲲鱼蒸煮废弃液的抗菌肽及其分离方法，属于食品生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]鲲鱼是一种集群性中上层小型低值海鱼，广泛分布于我国黄海、东海海域，富含蛋白质和油脂，具有较高的营养价值。其体内含较多蛋白水解酶，捕捞后极易发生自溶腐烂，因此俗称“离水烂”、“烂船丁”。鍉鱼捕捞后需立即进行蒸煮处理，后续再加工成传统鲲鱼干制品一海蜒。其蒸煮废弃液中含蛋白质、氨基酸、核苷酸等营养和风味物质，具有极大的开发利用前景。然而，目前针对鲲鱼蒸煮废弃液的加工利用较少，主要处置方式是直接排放丢弃，造成资源浪费和环境污染。将鍉鱼蒸煮废弃液进行回收并高值化利用，对充分开发海洋资源、实现现代海产品高值化加工及解决环境污染问题具有重要意义。
[0003]传统抗生素的非理性使用导致的多重耐药菌的出现，已成为全球公共卫生难题。抗菌肽作为抗生素家族的一个新成员，能特异性作用于病原菌，对宿主无毒或毒性小。其具有广谱抗菌活性，对细菌、真菌甚至某些癌细胞、病毒也有抑制活性。且因其独特的抗菌机制，抗菌肽不易产生耐药性。大量相关研究表明，抗菌肽有望成为高效、安全的新型抗菌剂，在医药、食品、化妆品、饲料等行业中具有极大的应用潜力。
[0004]抗菌肽的制备方法目前主要包括直接提取法、基因工程法、化学合成法和蛋白酶解法。因蛋白酶解法具有反应条件温和、过程易于控制，原料方便易得、安全性高等优点，被研究者认为可能是批量生产抗菌肽最有前途的方法之一。但蛋白酶解产物组分复杂，传统的活性单肽分离方法常采用多步色谱结合活性鉴定的方法，即在每步分离过程中都要验证每个组分的活性，步骤繁琐、耗时长、成本高。已有研究表明，基于抗菌肽与细胞膜的亲和作用采用细胞膜亲和色谱法快速筛选抗菌肽是可行的(一种快速准确发现、鉴定及制备蛋白质水解物源抗菌肽的方法，专利申请号201110406867.3)。然而，细胞膜亲和色谱法中的细胞膜需固定于特定载体上以制备成相应的固定相，与载体的结合在空间上会一定程度干扰细胞膜与目标肽的结合，因而在实际应用中受到一定程度的限制。传统的平衡透析是研究小分子与生物大分子结合平衡的一种经典方法，生物大分子与其潜在结合目标物共同置于透析袋中，当两者之间建立一种结合平衡状态时，与生物大分子结合的小分子被束缚于透析袋中，而未结合的小分子可以自由通过透析袋。目前尚未见采用平衡透析法分离抗菌的相关报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种来源于鍉鱼蒸煮废弃液的抗菌肽，该抗菌肽可应用于医药、食品、化妆品和饲料行业中。
[0006]本发明所要解决的第二个技术问题是针对上述【背景技术】提供一种来源于鲲鱼蒸煮废弃液的抗菌肽的分离方法。[0007]本发明为解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为:该来源于鲲鱼蒸煮废弃液的抗菌肽，其特征在于其为十肽化合物，其氨基酸序列为GLSRLFTALK(Gly-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Thr-Ala-Leu-Lys)，质谱技术检测出其分子离子峰 m/zll05.67Da[M+H]+。
[0008]本发明为解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为:一种来源于鲲鱼蒸煮废弃液的抗菌肽的分离方法，其特征在于包括以下步骤:
[0009]I)鲲鱼蒸煮废弃液经旋蒸浓缩至原体积的1/10~1/20，采用蛋白酶(0.02~
0.04g酶/g粗蛋白)于温度55~65°C条件下水解4~6h，酶解结束后，90~100°C煮沸灭酶8~lOmin，随后将其快速冷却至室温；8000~lOOOOg，20~30min离心取上清，置于_86°C超低温冰箱中预冻，预冻4~6h后进行真空冷冻干燥(-55~-45 °C，0.03~0.2mBar)，冻干后于-18~-20°C保存留用；
[0010]2)将步骤I)得到的鲲鱼蒸煮废弃液浓缩后水解产物采用超纯水配成10~25mg/ml水溶液，采用高效液相凝胶渗透色谱法测定其相对分子量分布；
[0011]3)将细菌培养至对数期，离心取菌体，重悬于Tris-HCl缓冲液(10~25mM，PH7.5)中，采用氯仿-甲醇(I: 2，V/V)溶液提取其细胞膜脂，氯仿相悬蒸成膜后经Tris-HCl缓冲液(10~25mM，pH7.2)水化，超声处理至透明，制备细菌模拟细胞膜悬液；
[0012]4)将步骤3)中得到的细菌模拟细胞膜悬液(50~60mg/ml)和步骤I)中得到的鲲鱼蒸煮废弃液浓缩后水解产物(10~25mg/ml)等体积置于透析袋中，于Tris-HCl缓冲液(10~25mM，pH7.2)中进行透析；以细菌模拟细胞膜悬液(50~60mg/ml)和Tris-HCl缓冲液(10~25mM，pH7.2)等体积置于相同透析袋中进行透析为对照；
[0013]5)将步骤4)中得到的样品平衡透析液和对照平衡透析液经反相高效液相色谱技术进行分析，收集制备两者的差异峰，并以金黄色葡萄球菌为指示菌验证其抗菌能力，对抗菌活性最强的组分采用质谱技术分析其氨基酸序列。
[0014]步骤4)中所述透析袋的截留分子量的选择需根据步骤2)所测得的水解产物的分子量分布来确定，透析袋的截留分子量需大于水解产物的最大分子量。
[0015]作为优选，步骤I)中所述的蛋白酶为复合蛋白酶Protamex,酶活力> 90U/mg,其水解条件为PH6.5，温度55±2°C，水解时间6h。
[0016]作为优选，步骤2)中所述的高效液相凝胶渗透色谱法的色谱条件为:凝胶柱为丁5敁6120005歡1^柱，300父7.5_;流动相:乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1 (V/V);洗脱速度:0.5ml/min ;柱温:30°C ;紫外检测波长:220nm。步骤5)中所述的反相高效液相色谱法的色谱条件为:色谱柱为Waters symmetry C18, 250X4.6mm ;流动相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；洗脱程序:0~26min内乙腈浓度从10%增加至80%，洗脱速度0.5ml/min ;紫外检测波长:215nm。
[0017]与现有技术相比，本发明方法的优势体现在:
[0018]1、本专利技术是以食品加工副产物为原料，可实现变废为宝的增值化效应。
[0019]2、本专利技术以模拟细胞膜平衡透析技术为核心技术，模拟细胞膜在分离体系中不受任何束缚，克服了传统细胞膜色谱法中膜与载体的结合干扰其与目标肽结合的缺点，能最大程度的反应抗菌肽与细菌磷脂膜之间的相互作用。该法简化了抗菌肽的靶向性分离步骤，降低了生产成本。
[0020]3、通过抑菌试验证实，本专利产品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌、痢疾志贺菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌均有抑菌活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是鍉鱼蒸煮废弃液浓缩后水解产物的分子量分布图。
[0022]图2是鲲鱼蒸煮废弃液浓缩后水解产物与模拟细胞膜互作样品平衡透析液和对照平衡透析液的RP-HPLC比较图谱。
[0023]图3是GLSRLFTALK的氨基酸分析质谱图。
图4是来源于鍉鱼蒸煮废弃液的抗菌肽分离工艺流程图。
【具体实施方式】
[0024]以下结合附图实施例进一步阐述本发明。
[0025]I)鲍鱼蒸煮废弃液经旋蒸浓缩至原体积的1/10,采用复合蛋白酶Protamex (0.02酶/g粗蛋白)于PH6.5、温度55±2°C条件下水解6h，酶解结束后，100°C煮沸灭酶IOmin，随后将其快速冷却至室温；8000g，20min离心取上清，置于_86°C超低温冰箱中预冻6h，之后进行真空冷冻干燥(_55°C，0.2mBar)，冻干后得鍉鱼蒸煮废弃液浓缩后水解产物，于-20°C保存留用；
[0026]
[0027]
[0028]
[0029]2)将鲲鱼蒸煮废弃液浓缩后水解产物采用超纯水配成10mg/ml水溶液，采用高效液相凝胶渗透色谱法测定其相对分子量分布(图1)，测得其最大分子量为21687Da。其色谱条件为:凝胶柱为了5敁61200051乂1^柱，300\7.5mm;流动相:乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1 (V/V);洗脱速度:0.5ml/min ;柱温:30°C ;紫外检测波长:220nm ；
[0030]3)将金黄色葡萄球菌培养至对数期，离心取菌体，重悬于Tris-HCl缓冲液(25mM，pH7.5)中，采用氯仿-甲醇(I: 2，V/V)溶液提取其细胞膜脂，氯仿相悬蒸成膜后经Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.2)水化，超声处理至透明，制备金黄色葡萄球菌模拟细胞膜悬液；
[0031]4)将金黄色葡萄球菌模拟细胞膜悬液(60mg/ml)和鍉鱼蒸煮废弃液浓缩后水解产物(25mg/ml)等体积置于截留分子量为25000的透析袋中，于Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.2)中进行透析；以金黄色葡萄球菌模拟细胞膜悬液(60mg/ml)和Tris-HCl缓冲液(IOmM, pH7.2)等体积置于截留分子量为25000的透析袋中进行透析为对照样；
[0032]5)将样品平衡透析液和对照平衡透析液经反相高效液相色谱技术进行分析，其色谱条件为:色谱柱为Waters symmetry C18, 250 X 4.6mm ;流动相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；洗脱程序:0~26min内乙腈浓度从10%增加至80%，洗脱速度0.5ml/min ;紫外检测波长:215nm。收集制备两者的差异峰(图2)，并以金黄色葡萄球菌为指示菌验证其抗菌能力；
[0033]6)对抗菌活性最强的组分采用质谱技术分析其氨基酸序列，测得其氨基酸序列为 GLSRLFTALK (Gly-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Thr-Ala-Leu-Lys),其分子离子峰 m/z 1105.67Da[M+H].(图 3)。[0034]7) 分别以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌、痢疾志贺菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌为指示菌，对GLSRLFTALK进行抑菌活性检测，结果表明该肽对以上细菌均有抑菌活性，最小抑菌浓度在16~256μ g/ml之间，说明其具有较强的抑菌活性和较宽的抑菌谱。
【权利要求】
1.一种来源于鲲鱼蒸煮废弃液的抗菌肽，其特征在于该抗菌肽为十肽化合物，其氨基酸序列为 GLSRLFTALK (Gly-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Thr-Ala-Leu-Lys),质谱技术检测出其分子离子峰m/zll05.67Da[M+H]+，此抗菌肽序列为一种新的抗菌肽序列。
2.一种来源于鲲鱼蒸煮废弃液的抗菌肽的分离方法，其特征在于，采用模拟细胞膜平衡透析联用高效液相色谱法对鲲鱼蒸煮废弃液浓缩后的水解产物进行靶向性分离，收集抗菌活性最强的组分，得到目标单肽。具体步骤为: 1)鲲鱼蒸煮废弃液经旋蒸浓缩至原体积的1/10~1/20，采用蛋白酶(0.02~0.04g酶/g粗蛋白)于温度55~65°C条件下水解4~6h，酶解结束后，90~100°C煮沸灭酶8~IOmin,随后将其快速冷却至室温；8000~lOOOOg，20~30min离心取上清，置于_86°C超低温冰箱中预冻，预冻4~6h后进行真空冷冻干燥(-55~-45 °C, 0.03~0.2mBar),冻干后于-18~-20°C保存留用； 2)将步骤I)得到的鍉鱼蒸煮废弃液浓缩后水解产物采用超纯水配成10~25mg/ml水溶液，采用高效液相凝胶渗透色谱法测定其相对分子量分布； 3)将细菌培养至对数期，离心取菌体，重悬于Tris-HCl缓冲液(10~25mM，pH7.5)中，采用氯仿-甲醇(I: 2，V/V)溶液提取其细胞膜脂，氯仿相悬蒸成膜后经Tris-HCl缓冲液(10~25mM，pH7.2)水化，超声处理至透明，制备细菌模拟细胞膜悬液； 4)将步骤3)中得到的细菌模拟细胞膜悬液(50~60mg/ml)和步骤I)中得到的鲲鱼蒸煮废弃液浓缩后水解产物(10~25mg/ml)等体积置于透析袋中，于Tris-HCl缓冲液(10~25mM，pH7.2)中进行透析；以细菌模拟细胞膜悬液(50~60mg/ml)和Tris-HCl缓冲液(10~25mM，pH7.2)等体积置于相同透析袋中进行透析为对照； 5)将步骤4)中得到的样品平衡透析液和对照平衡透析液经反相高效液相色谱技术进行分析，收集制备两者的差异峰，并以金黄色葡萄球菌为指示菌验证其抗菌能力，对抗菌活性最强的组分采用质谱技术分析其氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌、痢疾志贺菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌均有抑菌活性。
4.根据权利要求2所述的抗菌肽的分离方法，其特征在于所述鲲鱼蒸煮废弃液为黄海鱼昆鱼(Engraulis japonicus)蒸煮废弃液。
【文档编号】C07K1/14GK103936832SQ201410162659
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】张晖, 唐文婷, 齐希光, 王立, 钱海峰 申请人:江南大学