一种藻红蛋白ace抑制肽的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种藻红蛋白ACE抑制肽的制备方法。步骤为藻红蛋白的提取；加入胃蛋白酶酶解再加入胰蛋白酶酶解；将酶解后的冻干粉溶于纯水，上样于SephadexG-15凝胶柱，收集活性最高峰为藻红蛋白ACE抑制肽组分。将所得组分继续上样于高效液相色谱ZORBAX300SB-C18柱进行分离，以检测该组分中藻红蛋白ACE抑制肽段，同时可实现高纯度的藻红蛋白ACE抑制肽制备。本发明采用胃蛋白酶及胰蛋白酶分步酶解法制备ACE抑制肽，能避免该活性肽经人体摄入后被胃肠道消化液降解而失活，同时缩减了成本，工艺简单，能进行产业化生产。该藻红蛋白ACE抑制肽来源于天然植物蛋白，分子量小，稳定、安全、人体易吸收。
【专利说明】一种藻红蛋白ACE抑制肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白的制备方法，尤其涉及一种藻红蛋白ACE抑制肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]CN 200610097201从燕麦中提取燕麦蛋白，用碱性蛋白酶对其进行酶解，经离子交换色谱、凝胶过滤色谱及反相高效液相色谱分离，制备燕麦蛋白ACE抑制肽。该专利申请采用离子交换色谱进行分离，过柱前需对样品进行脱盐等处理，而洗脱时又将带入大量盐分，后期需再次脱盐，因而操作成本高。
[0003]CN 200310113446从新鲜牛乳中制备酪蛋白，并加入3.5~6%蛋白酶降解该酪蛋白，得到一种乳源ACE抑制肽。该制备工艺所需蛋白酶量大，提高了生产成本。
[0004]CN 201110233734公开一种花生抗氧化肽的制备工艺，利用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶及无花果蛋白酶进行分步酶解。该专利申请利用不同种类的蛋白酶对其进行多步酶解，酶解过程中需多次调节PH以满足各类蛋白酶的最适条件，操作繁琐且会带入大量盐分，不利于规模化生产。
[0005]CN 201010127258公开了利用酶法制备酪蛋白磷酸肽与ACE抑制肽，涉及到多种蛋白酶以复配方式被利用。
[0006]CN201010177329.7公开了采取丙酮浸提法提取鱿鱼肝脏蛋白；再用酶解法降解鱿鱼肝脏蛋白；将得到的鱿鱼肝脏蛋白酶解液进行超滤处理；S^hadex G-50凝胶柱、DEAE阴离子交换柱、Sephadex LH-20得到血管紧张素转换酶抑制肽。该制备工艺涉及超滤、凝胶过滤、离子交换等多项生物技术配合使用，纯化步骤复杂，不利于规模化生产。
[0007]此外，上述发明制备的生物活性肽被人体摄入，经胃肠道消化后很有可能被二次降解而失去活性。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种制备高活性、高纯度及较高得率的有效可行，操作简单、成本低廉的藻红蛋白ACE抑制肽的制备方法。
[0009]为实现上述目的，本发明提供一种藻红蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
藻红蛋白的提取:以新鲜海藻为原料，洗净后烘干，粉碎；破碎细胞；硫酸铵盐析；透析，阴离子交换柱进行线性洗脱，收集A565/A280〉3.0洗脱组分，即为藻红蛋白，冷冻干燥得藻红蛋白粉末避光贮藏；
藻红蛋白的酶解:将藻红蛋白粉末溶解后，调PH值至1.2，预热，加入0.5重量％胃蛋白酶恒温反应后终止反应，再加入0.5重量％胰蛋白酶恒温酶解后终止反应，将最终的酶解产物进行冷冻干燥浓缩，得到冻干粉；
ACE抑制肽的制备:将所得到的冻干粉溶于纯水，上样于Sephadex G_15凝胶柱，以纯水为洗脱液，在波长220 nm下，测定各收集组分的ACE抑制率，将收集组分冷冻干燥进行浓缩，即为藻红蛋白ACE抑制肽组分；用纯水溶解藻红蛋白ACE抑制肽组分后上样于高效液相色谱ZORBAX 300SB-C18柱作进一步分离，收集主峰进行ACE抑制活性测定，以检测该组分中ACE抑制肽段的分布情况，而所收集的活性峰即为高纯度的藻红蛋白ACE抑制肽。
[0010]所述藻红蛋白的提取中，新鲜海藻为新鲜红毛藻或新鲜紫菜。
[0011]所述藻红蛋白的提取为以新鲜海藻为原料，洗净后于30~40 1:进行烘干，粉碎；加入20~30倍体积的蒸馏水制成蛋白悬浮液，于-20 1:和4 °C下反复冻融3~5次，以破碎细胞；组织匀浆20~40 min后，超声破碎10~30 min ;离心后取上清，进行35~50%硫酸铵盐析；将盐析沉淀物于含有50 mmol/L NaCl的20 mmol/L, pH 5.6 PBS缓冲液中透析24 h后,上样于DEAE-Sepharose阴离子交换柱,在弱光条件下用含50 mmol/L NaCl的20 mmol/L, pH 5.6 PBS 和含 200 mmol/L NaCl 的 20 mmol/L NaH2PO4 溶液混合进行线性洗脱，流速为I mL/min;收集A565/A280〉3.0洗脱组分，即为藻红蛋白，冷冻干燥后避光贮藏。
[0012]所述藻红蛋白的酶解为将藻红蛋白粉末溶解于10倍体积纯水，用4 mol/L盐酸调pH值至1.2，37 °C预热5 min,加入0.5重量％胃蛋白酶，37 °〇恒温反应30 min，加入1/2倍体积的0.2 mol/L Na2CO3终止反应；此后，加入0.5重量％胰蛋白酶于37 °C恒温酶解1.5 h，于95 °C灭酶10 min终止反应，将最终的酶解产物进行冷冻干燥浓缩，得到冻干粉。
[0013]所述ACE抑制肽的制备为将所得到的冻干粉溶于纯水，上样于S^hadex G_15凝胶柱，流速为I mL/min，以纯水为洗脱液，在波长220 nm下，测定各收集组分的ACE抑制率，将收集组分冷冻干燥进行浓缩，获得藻红蛋白ACE抑制肽组分；用纯水溶解该藻红蛋白ACE抑制肽组分后上样于高效液相色谱ZORBAX 300SB-C18柱进行分离，收集主峰进行ACE抑制活性测定，以检测藻红蛋白ACE抑制肽组分中ACE抑制肽段的分布情况，而所收集的活性峰即为高纯度的藻红蛋白ACE抑制肽；色谱条件为:流速I mL/min，柱温25 V，检测波长220nm，流动相为含0.03%七氟丁酸的乙腈和含0.04%七氟丁酸的纯水不同比例的混合液；洗脱过程中乙腈比例为:0~5 min,乙腈10% ；5~25 min,乙腈10~20% ；25~65 min,乙腈20 ~30% ；65 ~85 min,乙腈 30 ~40%。
[0014]本发明参照体外模拟胃肠液消化试验的工艺进行自主设计，采用胃蛋白酶及胰蛋白酶酶解制备藻红蛋白ACE抑制肽，从而确保该抑制肽经人体胃肠道不被降解。为简化分离纯化步骤，从藻红蛋白经胃蛋白、胰蛋白酶分步酶解的酶解产物中获得高纯度的ACE抑制肽，第一步采用凝胶过滤层析分离，能有效去除盐分，且收集获得的活性组分经冷冻干燥后可直接包装作为藻红蛋白ACE抑制肽粗品。第二步通过合理选用分离柱填料、优化色谱条件，实现高效液相色谱对藻红蛋白ACE抑制肽的高度纯化。本发明公开的制备藻红蛋白ACE抑制肽的技术参数有效可行，且操作简单。
[0015]本发明的有益效果体现在以下4个方面:
1、采用胃蛋白酶及胰蛋白酶解藻红蛋白，制备ACE抑制肽，能避免该活性肽经人体摄入后被胃肠道消化液降解而失活；
2、采用分步酶解方式，由于两种酶的底物特异性不同，第一步酶解产物能与第二步加入的蛋白酶充分接触而被充分降解，因而最终获得的酶解产物分子量更低。分步酶解法可减少加酶量，降低成本；3、制备步骤中首先采用凝胶过滤层析，以纯水为洗脱液，根据分子量大小对目标肽进行有效分离，并能达到脱盐效果；
4、通过合理选用柱填料、优化洗脱条件，建立凝胶过滤层析联合高效液相色谱的两步简易工艺，可实现藻红蛋白ACE抑制肽的高度纯化，克服现存的纯化工艺繁琐问题。
[0016]本发明制备的藻红蛋白ACE抑制肽具有高活性、高纯度及较高得率等优点。该制备工艺简单，能进行产业化生产。该藻红蛋白ACE抑制肽来源于红毛藻、紫菜等天然植物蛋白，分子量小，具有稳定、安全、人体易吸收等特点，可作为高血压治疗药物或功能性食品进行开发。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是藻红蛋白的ACE抑制活性测定图。
[0018]图2是藻红蛋白分步酶解的Tricine-SDS-PAGE分析图。
[0019]图3是藻红蛋白ACE抑制肽的Sephadex G_15凝胶柱层析图。
【具体实施方式】
[0020]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0021]实施例1:
1)藻红蛋白的提取:以200g红毛藻为原料，洗净后于40 1:进行烘干，粉碎。加入20倍体积的蒸馏水制成海藻悬浮液，于-20 1:和4 °C下反复冻融3次，以破碎细胞。组织匀衆20 min后,超声破碎10 min。离心后取上清,进行35、0%硫酸铵盐析。将盐析沉淀透析后上样于DEAE-Sepharose阴离子交换柱,在弱光条件下用20 mmol/L PBS (pH 5.6，含50mmol/L NaCl)和20 mmol/L NaH2PO4溶液(含200 mmol/L NaCl)混合进行线性洗脱。收集A565/A280〉3.0的洗脱组分，冷冻干燥制成藻红蛋白粉末，避光贮藏。配制不同浓度的藻红蛋白溶液，测定ACE抑制活性。如图1所示，根据公式y = 0.1873x - 0.9168可计算得到藻红蛋白ACE抑制活性IC5tl为266 μ g/mL ；
2)藻红蛋白的酶解:将藻红蛋白粉末溶解于10倍体积纯水，用4mol/L盐酸调pH值至1.2，37 °C预热5 min,加入0.5% (w/w)胃蛋白酶，37 1:恒温反应30 min，加入1/2倍体积的0.2 mol/L Na2CO3终止反应；此后，加入0.5% (w/w)胰蛋白酶于37 1:恒温酶解1.5h，于95 °C灭酶10 min终止反应，将最终的酶解产物进行冷冻干燥，以达到浓缩，并测定其ACE抑制活性。利用SDS-PAGE技术，对胃蛋白酶及胰蛋白酶降解藻红蛋白的情况进行分析，结果见图2。见后面对图2的说明；
3)ACE抑制肽的制备:将步骤(2)冻干粉溶于纯水，上样于S印hadexG_15凝胶柱，流速为0.8 mL/min,以纯水为洗脱液，在波长220 nm下，测定各收集组分的ACE抑制率，将收集组分冷冻干燥进行浓缩，获得藻红蛋白ACE抑制肽组分。(见图3，220nm特征吸光值()；ACE抑制率(-._))，将收集组分冷冻干燥进行浓缩，获得藻红蛋白ACE抑制肽组分。将该冻干组分用纯水溶解该组分后上样于高效液相色谱ZORBAX 300SB-C18柱进行分离，收集主峰测定ACE抑制活性，以检测藻红蛋白ACE抑制肽组分中ACE抑制肽段的分布情况，而所收集的活性峰即为高纯度的藻红蛋白ACE抑制肽。色谱条件为:流速I mL/min，柱温25 V,检测波长220 nm,流动相为含0.03%七氟丁酸的乙腈和含0.04%七氟丁酸的纯水不同比例的混合液；洗脱过程中乙腈比例为:0~5 min,乙腈10% ；5~25 min,乙腈10~20% ；25~65 min,乙腈20~30% ；65~85 min,乙腈30~40% ;收集主峰进行ACE抑制活性测定
本发明提取的藻红蛋白纯度较高，测得A565/A280〉3.0，结果见图2泳道1，藻红蛋白条带分子量在20 kDa左右。其中M为蛋白标准品，泳道I为对照组，即未经酶解的藻红蛋白，泳道2为步骤(2)中0.5%胃蛋白酶(w/w)对藻红蛋白的酶解情况，泳道3为步骤(2)中
0.5%胃蛋白酶及0.5%胰蛋白酶(w/w)分步酶解藻红蛋白的酶解情况，与泳道I进行比较，泳道2和泳道3中藻红蛋白条带消失，说明在该酶解条件下，胃蛋白酶及胰蛋白酶能将藻红蛋白降解成小分子肽类，与未经酶解的藻红蛋白比较，测得步骤(2)中藻红蛋白最终酶解产物的ACE抑制活性提高至IC5tl为187 μ g/mL。经步骤(3)分离纯化，得到高纯度的ACE抑制肽，IC50 为 93 μ g/mL。
[0022]实施例2:
1)藻红蛋白的提取:以200g紫菜为原料，洗净后于40 1:进行烘干，粉碎。加入30倍体积的蒸馏水制成海藻悬浮液，于-20 1:和4 °C下反复冻融5次，以破碎细胞。组织匀浆20 min后，超声破碎20 min。离心后取上清，进行35飞0%硫酸铵盐析。将盐析沉淀透析后上样于DEAE-Sepharose阴离子交换柱,在弱光条件下用20 mmol/L PBS (pH 5.6，含50mmol/L NaCl)和20 mmol/L NaH2PO4溶液(含200 mmol/L NaCl)混合进行线性洗脱，流速为I mL/min。收集A565/A280〉3.0的洗脱组分，冷冻干燥制成藻红蛋白粉末，避光贮藏。配制不同浓度的藻红蛋白溶液，测定ACE抑制活性；
2)藻红蛋白的酶解:将藻红蛋白粉末溶解于10倍体积纯水，用4mol/L盐酸调pH值至1.2，37 °C预热5 min,加入0.5% (w/w)胃蛋白酶，37 1:恒温反应30 min，加入1/2倍体积的0.2 mol/L Na2CO3终止反应；此后，加入0.5% (w/w)胰蛋白酶于37 1:恒温酶解1.5h，于95 °C灭酶10 min终止反应，将最终的酶解产物进行冷冻干燥，以达到浓缩，并测定其ACE抑制活性。利用SDS-PAGE技术，对胃蛋白酶及胰蛋白酶降解藻红蛋白的情况进行分析。结果表明，紫菜藻红蛋白能充分被胃蛋白酶及胰蛋白酶降解；
3)ACE抑制肽的制备:将步骤(2)冻干粉溶于纯水，上样于S^hadex G-15凝胶柱，流速为I mL/min，以纯水为洗脱液，在波长220 nm下，测定各收集组分的ACE抑制率，将收集组分冷冻干燥进行浓缩，获得藻红蛋白ACE抑制肽组分。将该冻干组分用纯水溶解该组分后上样于高效液相色谱ZORBAX 300SB-C18柱进行分离，收集主峰测定ACE抑制活性，以检测藻红蛋白ACE抑制肽组分中ACE抑制肽段的分布情况，而所收集的活性峰即为高纯度的藻红蛋白ACE抑制肽。色谱条件为:流速I mL/min，柱温25 °C，检测波长220 nm，流动相为含0.03%七氟丁酸的乙腈和含0.04%七氟丁酸的纯水不同比例的混合液；洗脱过程中乙臆比例为:0~5 min,乙臆10% ；5~25 min,乙臆10~20% ；25~65 min,乙臆20~30% ；65~85 min,乙腈30~40% ;收集主峰进行ACE抑制活性测定。
[0023]实施例3:
I)藻红蛋白的提取:以I kg红毛藻为原料，洗净后于40 1:进行烘干，粉碎。加入20倍体积的蒸馏水制成海藻悬浮液，于-20 1:和4 °C下反复冻融5次，以破碎细胞。组织匀衆40 min后,超声破碎30 min。离心后取上清,进行35~50%硫酸铵盐析。将盐析沉淀透析后上样于DEAE-S印harose阴离子交换柱，在弱光条件下用20 mmol/L PBS (pH 5.6，含50 mmol/L NaCl)和 20 mmol/L NaH2PO4 溶液(含 200 mmol/L NaCl)混合进行线性洗脱,流速为I mL/min。收集A565/A280〉3.0的洗脱组分，冷冻干燥制成藻红蛋白粉末，避光贮藏。配制不同浓度的藻红蛋白溶液，测定ACE抑制活性；
2)藻红蛋白的酶解:将藻红蛋白粉末溶解于10倍体积纯水，用4mol/L盐酸调pH值至1.2，37 °C预热5 min,加入0.5% (w/w)胃蛋白酶，37 1:恒温反应30 min，加入1/2倍体积的0.2 mol/L Na2CO3终止反应；此后，加入0.5% (w/w)胰蛋白酶于37 1:恒温酶解1.5h，于95 °C灭酶10 min终止反应，将最终的酶解产物进行冷冻干燥，以达到浓缩，并测定其ACE抑制活性。利用SDS-PAGE技术，对胃蛋白酶及胰蛋白酶降解藻红蛋白的情况进行分析。结果表明，藻红蛋白经胃蛋白酶及胰蛋白酶的酶解情况与实施例1步骤(2)结果一致；
3)ACE抑制肽的制备:将步骤(2)冻干粉溶于纯水，上样于S印hadexG_15凝胶柱，流速为I mL/min，以纯水为洗脱液，在波长220 nm下，测定各收集组分的ACE抑制率，将收集组分冷冻干燥进行浓缩，获得藻红蛋白ACE抑制肽组分。图3 (220nm特征吸光值()；ACE抑制率(-.-))为藻红蛋白酶解产物的S印hadex G-15层析图谱，从图中可知220nm吸光值最高峰与ACE抑制活性峰重叠，将该峰进行收集，冷冻干燥后即为藻红蛋白ACE抑制肽组分。用纯水溶解该组分后上样于高效液相色谱ZORBAX 300SB-C18柱进行分离，收集主峰测定ACE抑制活性，以检测藻红蛋白ACE抑制肽组分中ACE抑制肽段的分布情况，而所收集的活性峰即为高纯度的藻红蛋白ACE抑制肽。色谱条件为:流速I mL/min，柱温25 °C，检测波长220 nm,流动相为含0.03%七氟丁酸的乙腈和含0.04%七氟丁酸的纯水不同比例的混合液；洗脱过程中乙腈比例为:0~5 min,乙腈10% ；5~25 min,乙腈10~20% ；25~65min,乙腈20~30% ；65~85 min,乙腈30~40% ;收集主峰进行ACE抑制活性测定。
[0024]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【权利要求】
1.一种藻红蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤， 藻红蛋白的提取:以新鲜海藻为原料，洗净后烘干，粉碎；破碎细胞；硫酸铵盐析；透析，阴离子交换柱进行线性洗脱，收集A565/A280〉3.0洗脱组分，即为藻红蛋白，冷冻干燥得藻红蛋白粉末避光贮藏； 藻红蛋白的酶解:将藻红蛋白粉末溶解后，调PH值至1.2，预热，加入0.5重量％胃蛋白酶恒温反应后终止反应，再加入0.5重量％胰蛋白酶恒温酶解后终止反应，将最终的酶解产物进行冷冻干燥浓缩，得到冻干粉； ACE抑制肽的制备:将所得到的冻干粉溶于纯水，上样于Sephadex G_15凝胶柱，以纯水为洗脱液，在波长220 nm下，测定各收集组分的ACE抑制率，将收集组分冷冻干燥进行浓缩，即为藻红蛋白ACE抑制肽组分；用纯水溶解藻红蛋白ACE抑制肽组分后上样于高效液相色谱ZORBAX 300SB-C18柱作进一步分离，收集主峰进行ACE抑制活性测定，以检测该组分中ACE抑制肽段的分布情况，而所收集的活性峰即为高纯度的藻红蛋白ACE抑制肽。
2.权利要求1所述藻红蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，所述藻红蛋白的提取中，新鲜海藻为新鲜红毛藻或新鲜紫菜。
3.权利要求1所述藻红蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，所述藻红蛋白的提取为以新鲜海藻为原料，洗净后于30~40 1:进行烘干，粉碎；加入20~30倍体积的蒸馏水制成蛋白悬浮液，于-20 1:和4 °C下反复冻融3~5次，以破碎细胞；组织匀浆20~40 min后，超声破碎10~30 min ;离心后取上清，进行35~50%硫酸铵盐析；将盐析沉淀物于含有50 mmol/T, NaCl 的20 mmol/T,, pH 5.6 PBS缓冲液中透析24 h后，上样于DEAE-Sepharose阴离子交换柱，在弱光条 件下用含50 mmol/L NaCl的20 mmol/L, pH 5.6 PBS和含200mmol/L NaCl的20 mmol/L NaH2PO4溶液混合进行线性洗脱，流速为I mL/min ;收集A565/A280> 3.0洗脱组分，即为藻红蛋白，冷冻干燥后避光贮藏。
4.权利要求1所述藻红蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，所述藻红蛋白的酶解为将藻红蛋白粉末溶解于10倍体积纯水，用4 11101/1盐酸调？!1值至1.2，37 °C预热5 min,加入0.5重量％胃蛋白酶，37 °C恒温反应30 min，加入1/2倍体积的0.2 mol/L Na2CO3终止反应；此后，加入0.5重量％胰蛋白酶于37 1:恒温酶解1.5 h，于95 °C灭酶10 min终止反应，将最终的酶解产物进行冷冻干燥浓缩，得到冻干粉。
5.权利要求1所述藻红蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，所述ACE抑制肽的制备为将所得到的冻干粉溶于纯水，上样于Sephadex G-15凝胶柱，流速为I mL/min，以纯水为洗脱液，在波长220 nm下，测定各收集组分的ACE抑制率，将收集组分冷冻干燥进行浓缩，获得藻红蛋白ACE抑制肽组分；用纯水溶解该藻红蛋白ACE抑制肽组分后上样于高效液相色谱ZORBAX 300SB-C18柱进行分离，收集主峰进行ACE抑制活性测定，以检测藻红蛋白ACE抑制肽组分中ACE抑制肽段的分布情况，而所收集的活性峰即为高纯度的藻红蛋白ACE抑制肽；色谱条件为:流速I mL/min，柱温25 °C，检测波长220 nm,流动相为含0.03%七氟丁酸的乙腈和含0.04%七氟丁酸的纯水不同比例的混合液；洗脱过程中乙腈比例为:0~5min,乙臆 10% ；5 ~25 min,乙臆 10 ~20% ；25 ~65 min,乙臆 20 ~30% ；65 ~85 min,乙腈30~40%ο
【文档编号】C07K14/405GK104131055SQ201410251613
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】曹敏杰, 伍强, 蔡秋凤, 付晓苹, 翁凌, 刘光明 申请人:集美大学