专利名称：一种在植物中表达抗微生物的阳离子多肽技术的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域。具体地讲，本发明涉及抗微生物阳离子多肽(cationic peptide)及其表达载体和起动子，在植物中的转染和表达，转基因植物的选择和再生，转基因植物对其细菌与真菌性病原菌的抗性。
经济植物病原细菌和真菌导致数千万元的损失。在发展中国家约有40％的作物减产直接与植物病原细菌和真菌有关。植物基因工程技术使外原抗病基因能整合进植物基因组中。转基因的技术已在某些抗虫和抗病植物中取得了成功。但是在已有的转基因植物中，其抗病性是很有限的，缺乏广谱性。表达抗微生物的阳离子多肽可以引入广谱抗病性基因进植物中，增加植物对细菌的抗性。
阳离子多肽来自于昆虫，脊椎和无脊椎动物及植物中。根据其结构，分为α-螺旋，β-折叠及同时具α螺旋和β折叠等几大类。这些多肽具有广谱的微生物活性，可以抗格兰氏阳性和阴性细菌、寄生虫，甚至病毒。通过计算机模拟进行结构修饰及不同阳离子多肽的杂交，可以创造比天然更有活力的阳离子多肽。表达这些多肽在植物不仅可以提高植物的抗性，同时尝试用植物作为工厂，生产新一代抗微生物的阳离子多肽类抗生素。
本发明目的是:
(1)在植物中表达几种特殊的阳离子多肽，增强植物对细菌性和真菌性病害的抗性；(2)利用植物作为工厂，生产新一代抗生素；(3)转基因的中草药植物中表达抗菌肽，以提高中草药产量，改进和提高中草药的药性。
发明的实施方案本发明提供了抗微生物的多肽基因及其在特别的表达载体上的克隆位置。一般来讲，这些载体系包含阳离子多肽的基因或以它们的前体形式扦入到各种起动子控制的植物表达载体上。将这些载体上的目的基因通过农杆菌或基因枪转入植物中，转基因的植物首先在愈伤组织阶段，通过体外抗病选择，然后再生成植株，再直接体内检测整株植物对植物病原性细菌或真菌的抗性。最后，植物生长成熟，收获整株植物或部份植物如块茎、块根等。
抗微生物多肽基因的选择我们选择了3种抗微生物的阳离子多肽及一种阳离子多肽的前体形式，如下表所示a.CEMA顺序为KWKLFKKIGIGAVLKVLTTGLPALKLTKb.Pro-CEMA其Pro顺序为EPLQARAEVAAAPEQIAADIPEVVVSLAWDESLAPKHPGSRKNc.Dermaseptin BAMWKDVLKKIGTVALHAGKAALGAVADTISQ
d.Temporin AFLPLIGRVLSGIL植物表达载体的构建如下列描述所示，含抗微生物的基因的植物表达栽体的构建(1)pSAI4去掉PBI121上的CaMV 35S起动子和β-glucuronidase，插入HindIII-EcoRI DNA片段。该片段含2×35S起动子，一个AMV RNA4翻译增强子，CEMA基因和NOS-ter顺序，插入并克隆于pBI121中。
(2)pRSPC4，pSSPC4，pPINC40.65kb起动子片段从pSAI4中去掉，插入HindIII-Xbal片段。这些HindIII-Xbal片段是分别来自于pRSP221(根特异性表达的起动子)，pSSP221(种子特异性表达起动子)和pRT210(伤愈应急反应的起动子)。
(3)pDPC121和pDPC221前者含pro-CEMA基因顺序，在pBI121载体上，具2×35S起动子，用于致癌农杆菌为中介转染的表达。后者含pro-CEMA DNA顺序在pBI121载体上，用于基因枪直接转导入植物细胞中。
(4)pD5B1217和pD5B2212，pTA1217，pTA2217用XbaI和SstI分别从pBI121和pBI221上去掉1.8Kb的Gus基因，扦入Dermaseptin B(DSB)gene顺序(pDSB1217，pDSB2212)或Temporin A基因顺序(pTA1217，pTA2217)。
(5)pDDSB1212Dermaseptin B基因构造在pBI121载体上，含有2×35S起动子和AMV RNA4增强子。
(6)pPDSB1217，pSDSB1212，pRTA1217用XbaI和SstI分别消化pRSP121或pSSP221，插入从pDSB1217(DSB gene约120bp)或pTA1217(Temporin A gene，约60bp)来的XbaI-SstI片段。
(7)pRDSB1217去掉在pRDSB1217上约0.6kb HindIII-XbaI起动子片段，扦入从pRT210上来的约1kb的HindIII-XbaI片段，含应急反应的起动子顺序(Wound-inducible promoter)。
(8)pDTA1217，pSTA1217和pPTA1217去掉pTA1217载体上0.8kb的CaMV35Spromoter。如扦入从pBI525来的2XCaMV35SPromoter，一个AMV RNA4增强子构成pDTA1217；如扦入从pSSP121来的1.16kb的种子特异性表达的起动子顺序构成pSTA1217。如扦入从pRT210来的受伤应急反应的起动子构成pPTA1217。
(9)pSUPC4pBI121上去掉CaMV 35S起动子和β-glucuronidase，构造超级起动子在CEMA之前。
(10)pSUPD1217pBI121上去掉CaMV 35S起动子和β-glucuronidase，构造超级起动子在Dermaseptin B之前。
(11)pSUPTpBI121上去掉CaMV 35S起动子和β-glucuronidase，构造超级起动子在Temporin A之前。
(12)pRSUPC4pBI121上去掉CaMV 35S起动子和β-glucuronidase，构造逆转性超级起动子在CEMA之前。
(13)pRSUPD1217pBI121上去掉CaMV 35S起动子和β-glucuronidase，构造逆转性超级起动子在Dermaseptin B之前。
(14)pRSUPTpBI121上去掉CaMV 35S起动子和β-glucuronidase，构造逆转性超级起动子在Temporin A之前。
(15)pHSUP1pBI121上去掉CaMV 35S起动子和β-glucuronidase，构造超级起动子在有6个Histidine-tagged的Dermaseptin B之前。
(16)pHRSUP1pBI121上去掉CaMV 35S起动子和β-glucuronidase，构造超级起动子在有6个Histidine-tagged的Dermaseptin B之前。
(17)pTerm3pBI121上去掉CaMV 35S起动子和β-glucuronidase，构造双倍的-CaMV 35S+AMVRNA4-CEMA，双倍的CaMV 35S+AMV RNA4-Dermaseptin B，双倍的CaMV 35S+AMVRNA4-temporin A在此载体上。
所有上述基因载体都通过限制性核酸内切酶消化，PCR放大和DNA序列分析证实。
农杆菌转染植物组织利用农杆菌转染植物按Block M.D.(1998，Theor Appl Genet 76767-774)描述的方法进行。
早期体外选择抗植物病原菌的植株在愈伤组织阶段，在培养愈伤组织的培养基中直接加入植物病原菌，选择能抗这些病原菌的愈伤组织再把它们诱导成植株。
抗微生物多肽基因整合进植物中利用PCR或Rt-PCR方法，可检测抗微生物的基因是否整于植物中，并且在植物中表达。
转基因植物的再生转基因植物的诱导再生方法如Block M.D.(1998，Theor Appl Genet 76767-774)描述所示。
实施例质粒载体pSAI4构建如图所示。
来自于pR78h proCEMA载体的CEMA基因被克隆在pBI524上，然后最终克隆在pBI121上，命名于pSAI4(
图1A)。
5′-末端primer顺序为CAA GGA AAA ACG GTC TAG AGC ATA TGA AAT GGA AAC，含XbaI位点。
3′-末端primer顺序为GAA CTC GAG CAG CGA GCT CTT ACT TAG TTA GCT TC，含BamHI位点。
图1B显示CecropinA，melittin和CEMA的顺序，阳离子氨基酸是粗体字母，阴离子氨基酸在字母下面划线。
权利要求
1.本发明是一种转基因植物的技术，权利要求三种抗微生物的阳离子多肽(CEMADemaseptin B和Temporin A)及CEMA的前体pro-CEMA在植物中表达的载体构造，及其起动子。
2.如权利要求1所述的三种阳离子多肽和CEMA的前体形式，其多肽顺序为a.CEMA顺序为KWKLFKKIGIGAVLKVLTTGLPALKLTKb.Pro-CEMA其Pro顺序为EPLQARAEVAAAPEQIAADIPEVVVSLAWDESLAPKHPGSRKNc.Dermaseptin BAMWKDVLKKIGTVALHAGKAALGAVADTISQd.Temporin AFLPLIGRVLSGIL
3.基因表达的载体为pBI121及pBI221，其起动子有整株植物中表达或组织特异性表达的起动子。a.整株植物表达的起动子有(a)CaMA 35S promoter(b)2X CaMV 35S+AMV RNA4 translation enhance element(c)超级起动子(Super promoter)(d)逆转性的超级起动子b.组织特异性表达的起动子有(a)种子特异表达的起动子(b)根特异性表达的起动子(c)受伤应急反应的起动子
4.愈伤组织的抗植物病原性体外选择即愈伤组织可在体外接种病原性细菌或真菌，选择其抗病性愈伤组织。
5.上述三种基因在土豆、烟草、西红柿、油菜、水稻、棉花、甘兰、萝卜、小麦、大豆及其它各种植物中的表达。
6.转基因的植物对植物病原性细菌和真菌具良好的抗性。
7.利用上述转基因植物作为工厂生产新一代抗菌素。
全文摘要
构建转基因的植物表达载体,含有三种抗微生物的阳离子多肽。植物组织通过农杆菌导入这些基因,并在愈伤组织期可以作体外选择抗植物病原菌(细菌和真菌)的愈伤组织;选择这些愈伤组织可以再生植株,并直接体内检测其抗真菌和细菌的能力;这些抗病转基因系生长成熟,收获整株植物或部分植物如块茎、块根等。
文档编号C07K7/08GK1249310SQ98112269
公开日2000年4月5日 申请日期1998年9月28日 优先权日1998年9月28日
发明者周国庆 申请人:周国庆