专利名称：酶解法生产肝素钠的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肝素钠的生产方法，特别是一种利用生物发酵工艺生产肝素钠的方法。
肝素钠是一种生物医药中间体，具有抗凝血和防止血栓形成的作用，对肾病患者的渗血，急性心肌梗塞等方面临床价值极高。该物质在动物小肠特别是猪小肠粘膜中含量较多，传统的生产工艺是在动物小肠中加入胰浆进行水解提取，水解3小时后过滤，滤液采用离子交换树脂吸附，洗涤后采用氯化钠解吸，洗脱液中加入乙醇，肝素钠在乙醇中沉淀，经洗涤干燥后的肝素钠产品。该方法生产周期长，水解不完全，收率低，生产1亿国际单位肝素钠粗品需2800-3000根猪小肠粘膜，所得产品纯度低，每毫克粗品含肝素钠至多为80效价/毫克；且在生产过程中树脂再生困难，产生的废水严重污染环境。
本发明的目的是提供一种新的酶解法生产肝素钠的工艺，该法克服了常规方法的上述问题，应用此方法可在短时间内生产出纯度较高的肝素钠产品。
本发明的目的由以下技术方案来达到，本发明是一种生物催化法生产肝素钠的方法，依次包括以下几个生产步骤(1)按照1∶2.3-4重量比向猪小肠粘膜中加入水，加入氢氧化钠调节pH值至9-10，升温至50-55℃，并按每公斤小肠1.5克的比例加入2709蛋白酶，保温搅拌45分钟后，按猪小肠粘膜重量每公斤加入0.12-0.15千克粗盐，升温至60-70℃；(2)催化反应所得产物用150-180目棉布筛过滤，分离除去杂质蛋白质，得到过滤液；(3)在每公斤猪小肠粘膜获得的滤液中加入0.1-0.13公斤D204强碱性阴离子交换树脂，反应2-3小时，分离母液得到离子交换后的树脂；(4)以完全浸没离子交换后的树脂为量，分别用浓度为每升0.04-0.06摩尔的氯化钠、每升0.4-0.6摩尔的氯化钠溶液洗涤搅拌15-20分钟，分离母液，得到洗涤后的树脂；(5)分两次以完全浸没洗涤后的树脂为量，加入每升3-4摩尔的氯化钠反应20-30分钟，分离树脂，收集合并两次反应液体产物；(6)用每升2摩尔的氢氧化钠溶液调节上述反应液体产物的pH值至11-12，升温至60-80℃，用150-180目多层棉布筛过滤，滤液在搅拌下加入重量浓度为85-95％的乙醇，调节液体比重为乙醇比重计计量35-45度，室温下静置2-4小时，分离液体，得到沉淀物；(7)按重量比1∶2比例，将沉淀物用重量浓度95-99％的乙醇脱水2-3次，60-80℃温度下干燥即得肝素钠。
在上述发明方案中，猪小肠粘膜酶解后，加入食盐，升高温度能促使小肠粘膜中的动物蛋白凝聚，使酶解后生成的肝素钠易于进行离子交换；采用稀氯化钠溶液洗涤后的强碱性离子交换树脂采用高浓度氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液中的肝素钠在酒精溶液中产生沉淀，洗涤干燥后的等成品肝素钠。
本发明的目的还可以通过以下方案进一步达到按上述方法控制催化发应的pH值控制在9.5，在此条件下酶的催化活性最高。
本发明的目的还可以通过以下方案进一步达到过滤液体反应产物采用170-180目多层棉布筛，采用该方法能使动物蛋白彻底分离。
本发明的目的还可以通过以下方案进一步达到沉淀肝素钠产物时，液体比重控制在用乙醇比重计测量为40度，在此条件下肝素钠沉淀较为完全。
采用2709蛋白酶作为催化剂从猪小肠粘膜中提取肝素钠，适应肝素钠酶解过程所需的强碱性、低温度条件，每根小肠只需加入1.5克，30分钟即可水解完全；水解结束后，只需调节pH至9-10，加温到65℃，就能使杂质蛋白凝固析出，较原生产工艺降低了30℃，节约了能源。为解决离子交换中树脂受杂质蛋白质干扰而影响产品质量及树脂的使用寿命，采用了多层棉布筛过滤对提取液进行过滤分离；提取液中的杂质蛋白可被彻底分离，大大提高了离子交换树脂的离子交换性能，所需树脂为原工艺的50％，且树脂寿命可延长使用两年，既节约了大量清洗树脂用水又节约了生产时间；由于吸附树脂用量减少了一半，后道工序中的乙醇、氯化钠用量都为原工艺的一半。和原生产工艺比较，采用此工艺生产一亿国际单位肝素钠成本降低了1/3，时间减少了2/3。
以下实施例详细说明了本发明。
实施例1(1)200公斤猪小肠粘膜加入800公斤水，加入氢氧化钠调节pH值至9，升温至50℃，加入300公斤2709蛋白酶(天津酶制剂厂生产)，保温搅拌45分钟后，加入30千克粗盐，升温至60℃，促使动物蛋白凝聚；(2)催化反应产物用150目棉布筛过滤，分离除去杂质蛋白质，得到过滤液；(3)在滤液中投入26公斤D204强碱性阴离子交换树脂(杭州正光化工厂)反应2小时，分离母液得到离子交换后的树脂；(4)以完全浸没离子交换后的树脂为量，分别用浓度为每升0.04摩尔的氯化钠、每升0.4摩尔的氯化钠溶液洗涤搅拌15分钟，分离母液，得到洗涤后的树脂；(5)分两次以完全浸没洗涤后的树脂为量，加入每升3摩尔的氯化钠反应20分钟，分离树脂，收集合并两次反应液体产物；(6)用每升2摩尔的氢氧化钠溶液调节上述反应液体产物的pH值至11，升温至60℃，用150目多层棉布筛过滤，滤液在搅拌下加入重量浓度为85％的乙醇，调节液体比重为乙醇比重计计量35度，室温下静置2小时，分离液体，得到沉淀物；(7)按重量比1∶2比例，将沉淀物用重量浓度95％的乙醇脱水2次，60℃温度下干燥，得肝素钠180克，产品纯度80.4效价/毫克。
实施例2(1)250公斤猪小肠粘膜加入750公斤水，加入氢氧化钠调节pH值至9.5，升温至53℃，加入375公斤2709蛋白酶(天津酶制剂厂生产)，保温搅拌45分钟后，加入33千克粗盐，升温至65℃，促使动物蛋白凝聚；(2)催化反应产物用170目棉布筛过滤，分离除去杂质蛋白质，得到过滤液；(3)在滤液中投入27公斤D204强碱性阴离子交换树脂(杭州正光化工厂)反应2.5小时，分离母液得到离子交换后的树脂；
(4)以完全浸没离子交换后的树脂为量，分别用浓度为每升0.04摩尔的氯化钠、每升0.4摩尔的氯化钠溶液洗涤搅拌17分钟，分离母液，得到洗涤后的树脂；(5)分两次以完全浸没洗涤后的树脂为量，加入每升3摩尔的氯化钠反应25分钟，分离树脂，收集合并两次反应液体产物；(6)用每升2摩尔的氢氧化钠溶液调节上述反应液体产物的pH值至11，升温至70℃，用150目多层棉布筛过滤，滤液在搅拌下加入重量浓度为90％的乙醇，调节液体比重为乙醇比重计计量40度，室温下静置3小时，分离液体，得到沉淀物；(7)按重量比1∶2比例，将沉淀物用重量浓度97％的乙醇脱水3次，70℃温度下干燥，得肝素钠180克，产品纯度80.4效价/毫克。
实施例3(1)300公斤猪小肠粘膜加入700公斤水，加入氢氧化钠调节pH值至10，升温至55℃，加入450公斤2709蛋白酶(天津酶制剂厂生产)，保温搅拌45分钟后，加入35千克粗盐，升温至70℃，促使动物蛋白凝聚；(2)催化反应产物用180目棉布筛过滤，分离除去杂质蛋白质，得到过滤液；(3)在滤液中投入30公斤D204强碱性阴离子交换树脂(杭州正光化工厂)反应3小时，分离母液得到离子交换后的树脂；(4)以完全浸没离子交换后的树脂为量，分别用浓度为每升0.06摩尔的氯化钠、每升0.6摩尔的氯化钠溶液洗涤搅拌20分钟，分离母液，得到洗涤后的树脂；(5)分两次以完全浸没洗涤后的树脂为量，加入每升4摩尔的氯化钠反应30分钟，分离树脂，收集合并两次反应液体产物；(6)用每升2摩尔的氢氧化钠溶液调节上述反应液体产物的pH值至12，升温至80℃，用180目多层棉布筛过滤，滤液在搅拌下加入重量浓度为95％的乙醇，调节液体比重为乙醇比重计计量40度，室温下静置4小时，分离液体，得到沉淀物；(7)按重量比1∶2比例，将沉淀物用重量浓度99％的乙醇脱水3次，80℃温度下干燥，得肝素钠190克，产品纯度81.0效价/毫克。
权利要求
1.一种生物催化法生产肝素钠的方法，其特征在于所采用的催化剂为2709蛋白酶，且生产过程依次包括以下几个步骤(1)按照1∶2.3-4重量比向猪小肠粘膜中加入水，加入氢氧化钠调节pH值至9-10，升温至50-55℃，并按每公斤小肠1.5克的比例加入2709蛋白酶，保温搅拌45分钟后，按猪小肠粘膜重量每公斤加入0.12-0.15千克粗盐，升温至60-70℃；(2)催化反应产物用150-180目棉布筛过滤，分离除去杂质蛋白质，得到过滤液；(3)在每公斤猪小肠粘膜获得的滤液中加入0.1-0.13公斤D204强碱性阴离子交换树脂，反应2-3小时，分离母液得到离子交换后的树脂；(4)以完全浸没离子交换后的树脂为量，分别用浓度为每升0.04-0.06摩尔的氯化钠、每升0.4-0.6摩尔的氯化钠溶液洗涤搅拌15-20分钟，分离母液，得到洗涤后的树脂；(5)分两次以完全浸没洗涤后的树脂为量，加入每升3-4摩尔的氯化钠反应20-30分钟，分离树脂，收集合并两次反应液体产物；(6)用每升2摩尔的氢氧化钠溶液调节上述反应液体产物的pH值至11-12，升温至60-80℃，用150-180目多层棉布筛过滤，滤液在搅拌下加入重量浓度为85-95％的乙醇，调节液体比重为乙醇比重计计量35-45度，室温下静置2-4小时，分离液体，得到沉淀物；(7)按重量比1∶2比例，将沉淀物用重量浓度95-99％的乙醇脱水2-3次，60-80℃温度下干燥即得肝素钠。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于催化发应的pH值控制在9.5。
3.按照权利要求1的方法，其特征在于过滤液体反应产物采用170-180目多层棉布筛。
4.按照权利要求1的方法，其特征在于沉淀肝素钠产物时，液体比重控制在用乙醇比重计测量为40度。
全文摘要
本发明公开了一种利用生物发酵工艺生产肝素钠的方法。该方法采用2709蛋白酶作为催化剂,D204强碱性阴离子交换树脂作为离子交换树脂,并采用150－180目多层布筛进行过滤,有效克服了原生产工艺生产周期长、水解不完全、收率低、所得产品纯度低、产生的废水严重污染环境等缺陷,采用此工艺生产1亿国际单位肝素钠只需猪小肠粘膜1800－2000根,产品纯度达80效价/毫克以上。
文档编号C08B37/00GK1308088SQ01108278
公开日2001年8月15日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者樊永金 申请人:灌云县金瑞生物制品有限公司