专利名称：葡聚糖－血红蛋白共轭物作为血液代用品的制作方法
技术领域：
本发明涉及血液代用品，及其制备方法。更具体地说，本发明涉及用作哺乳动物的血液代用品的改进的多糖-血红蛋白共轭物以及这种共轭物的制备方法。
背景技术：
近年来，寻找安全的血液代用品快速增加。这种需要经常超过了可从人供体获得的血液的供应。此外，世界上许多地区，全血供应可能是危险的。因此，需要开发血液代用品。
血液最重要的功能之一是从肺携带氧支持组织呼吸。血红蛋白(Hb)在开发临床血液代用品中是一种吸引人的氧载体，原因是它属于广泛溶解性的呼吸色素，摄取和释放氧，并且首先是其运输大量氧的能力。然而，游离Hb本身作为血液代用品的一个根本缺陷在于其相对小的分子大小(为64.5kD)和因此高的肾排泄速度(EXC)，从而导致从循环中快速清除。因此，为了防止Hb的肾排泄并延长其血浆半衰期，已采用与载体聚合物的共价共轭。这些共轭物被称之为血红蛋白基氧载体(HBOC)。这些聚合物的实例包括葡聚糖和葡聚糖的生物聚合物衍生物、菊粉、羟乙基淀粉、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(S.P.Tsai和J.T.-F.Wong，葡聚糖-血红蛋白，其中Winslow，R.N.、Vandegriff，K.D.和Intaglietta，M.[编辑]，1997血液代用品的优点Industrial Opportunities and Medical Challenges，Birlchauser，Boston；将这些文献的内容通过引用加入本文)。
氧传送的效率是由总血液流量和体积、氧含量、红细胞或血红蛋白质量、氧亲和力和氧消耗的速度决定的。氧含量、传送和利用之间的关系最好通过Fick等式列举。因此显而易见，单位体积可以运载和传送最大量氧同时保持优异流变特性的血液代用品将是理想的。
葡聚糖-血红蛋白(DxHb)是一种已作为血液代用品提出的共轭物。水溶性、在广泛分子大小的可用性、和没有显著毒性或组织向性的组合，在可生物降解聚合物中赋予了葡聚糖成为优异的药物载体。葡聚糖(Dx)与血红蛋白(Hb)共价共轭增加了Hb的有效大小，并因此减少了其通过肾脏系统的排泄速度(EXC)。
已提出了该共轭物溶液的粘度的稳定方法，并进行了与狗和猕猴中的DxHb交换输血(Tam等，1976，Tam等，1978，Wong 1988)。然而，迄今还没有研究该共轭物的流动性。在美国专利US 4,064,118和4,650,786中提供了DxHb共轭物的实例，将这些文献的内容通过引用加入本文。其中’118专利教导一种可用作血液代用品或血液膨胀剂的组合物，它是将血红蛋白(Hb)与分子量为约5kD-2000kD的葡聚糖(Dx)偶联制备的。该DxHb共轭物的分子量是70-2000kD。然而已发现，与血红蛋白相比，根据美国专利US 4,064,118的产品趋于显示对氧或多或少较大的亲和力，但是保留了血红蛋白的主要氧运输和释放能力。
美国专利US 4,650,786公开了一种氧亲和力降低的改进的葡聚糖-血红蛋白复合物。该DxHb复合物的分子量是70-2000kD。
与DxHb复合物，或改进的DxHb复合物相伴的问题之一是，贮藏时共轭物溶液的粘度增加，由此使该溶液不适宜施用。上面问题的解决方法描述在美国专利US 4,900,816，将其内容通过引用加入本文。已显示葡聚糖部分的活化位置可以被封闭，并且贮藏时的粘度得以稳定，没有影响该血红蛋白复合物的氧运输性能。美国专利US4,900,816教导一种分子量为约70kD-约2000kD的化合物，包含血红蛋白残基、降低氧亲和力的配体、多糖(例如葡聚糖)、共价连接的化学桥接基团和封闭活化基团。
正如上面所述的，血液代用品的一个重要特性是其流变特性-就代用品而言为了成为生理可接受的，其粘度不要高至阻碍血液流动。尽管红细胞的凝聚是造成血液粘度增加，尤其是在较低剪切速度下，的一个重要因素，但是红细胞凝聚的实际机理仍然未完全阐明。红细胞的凝聚可以通过各种方式引起。一般说来，粘度和RBC凝聚都随免疫球蛋白的浓度增加而增加；然而，两者之间的精确关系显然是很复杂的。因此重要的是表征DxHb在其开发为血液代用品时的可能的物理-化学性能。
正如下面所述的，在本发明中，合成了各种DxHb制品，并且通过测定这些溶液的粘度及其凝聚趋势来测定其流变性能，该凝聚趋势是以红血球沉淀速度(ESR)试验(Dintenfass 1985，将其内容通过引用加入本文)来评估的。高分子以一定“临界浓度”存在于血浆中可能会诱导红细胞(RBC)凝聚并依次增加血液粘度，尤其是在低剪切速度下。
血液在低剪切区域，特别是在静脉循环中的流动，因其红血球凝聚的增强而大大降低，该红血球凝聚增加血液粘度并通过形成沉淀物而阻碍毛细管流动(Dintenfass 1981)。红细胞，RBC，凝聚是高分子在相邻红血球表面之间桥接的结果。当未包封的血红蛋白-基血液代用品被输入循环时，这些高分子还会与红血球相互作用并诱导RBC凝聚，ESR是受这种凝聚影响的一种最早的血液流变学参数。依次，根本感兴趣的是测定血红蛋白-基血液代用品在其设计和开发过程中的ESR强化效果。
已知分子大小是通过高分子桥接机理强化ESR的一个关键性决定物。20kD的葡聚糖不诱导RBC凝聚，因此ESR没有升高，但是大于40kD的葡聚糖完全能够提高ESR(Chien和Jan 1973；将其内容通过引用加入本文)。前面的研究显示，大于220kD的高分子结合的血红蛋白将诱导RBC凝聚，这样可以增加低剪切速度的血液粘度并影响RBC在循环中的分布(Tsai和Wong 1996；将其内容通过引用加入本文)。
本发明提供了一种具有导致低EXC和ESR水平的分子量的DxHb共轭物，因此提供了一种有效的血液代用品或血浆膨胀剂。
发明概述在一个实施方式中，本发明提供了一种载氧化合物，包含一种与多糖共价相连的血红蛋白的共轭物，该共轭物具有约50kD-约500kD的平均分子量。
在另一实施方式中，本发明提供了一种载氧化合物的制备方法，该化合物包含与多糖共价相连的血红蛋白的共轭物，该方法包括1)将多糖与溴化合物反应以在多糖上提供溴基，由此提供一活化多糖；2)用第一过滤器将该活化多糖过滤；3)将该活化多糖与血红蛋白反应由此提供一偶联的葡聚糖-血红蛋白分子；4)用第二过滤器将该葡聚糖-血红蛋白分子过滤。
附图简述参照附图，通过以下详细描述，本发明的优选实施方式的这些和其它特征将变得显而易见，其中
图1描述了由两个开始大小，10kD(DxT10)和20kD(DxT20)的葡聚糖分子合成的葡聚糖-血红蛋白的红血球沉淀速度(ESR)和排泄速度(EXC)的大小依赖性。
图2描述了用标准蛋白校准凝胶过滤柱，SuperdexTM 200、26/600。
图3描述了用FPLC和MiniDawn激光检测器测定的四个最优选DxHb制品的分子量分布。
图4和5描述了实施例5的试验结果。
优选实施方式的描述本文所用的术语“血红蛋白”将理解为包含由任何哺乳动物的红细胞获得的血红蛋白。尽管主要涉及人血红蛋白，但是本发明同样适用于由其它动物获得的血红蛋白并包括牛和猪血红蛋白。
在一个优选实施方式中，本发明提供了一种载体多糖-血红蛋白共轭物，更优选一种用作血液代用品或HBOC的改进的葡聚糖-血红蛋白(DxHb)共轭物。正如下面进一步讨论的，该DxHb共轭物，根据本发明的一个优选实施方式，具有约50kD-约500kD，更优选约89kD-116kD的分子量(MW)。由于Hb的大小通常是恒定的事实，因此该分子大小范围主要是以Hb和Dx分子之间的共轭量为基础的。已发现这种范围的共轭物大小使得分子在大小上比Hb足够大，以便这种分子的EXC速度不高，同时也提供在大小上足够小的分子，以便这种分子的ESR也不高。正如下面进一步所述的，与EXC速度有关的术语“高”是1％，对ESR而言是20mm/hr。本发明还提供了这种共轭物的生产方法。本文所含的实施例仅仅是为了描述目的提供的，并不意味着限制本发明的范围，这一点对本领域技术人员将是显而易见的。
1.无基质的人血红蛋白(SFH)的制备通过溶解红细胞并释放用于本发明方法的血红蛋白生产一种纯血红蛋白溶液。然后对这些制品加工除去溶液中的基质以避免肾损害。根据本发明的优选实施方式，通过Winslow和Chapman(Meth.Enzymol.，1994，2313-16)所述的标准过滤工艺制备一高纯度的血红蛋白溶液，，将该文献的内容通过引用加入本文。
2.通过烷基化法活化葡聚糖正如上面讨论的，多糖与血红蛋白共价共轭增加了其有效大小，因此防止了其肾排泄。本发明的多糖具有确定的生物相容性并且能够与血红蛋白结合。本发明的优选多糖是葡聚糖。
本发明的葡聚糖可以具有10kD(称之为葡聚糖T10)-20kD(称之为葡聚糖T20)的平均分子量。应指出的是可商购获得的葡聚糖通过其平均分子量分类并且葡聚糖分子的大小变化是固有的。推测当使用10kD葡聚糖时DxHb存在较高的肾以及非肾排泄。因此，根据本发明的优选实施方式，葡聚糖最优选的开始大小是20kD。
为了将葡聚糖改性为能够与血红蛋白反应，它必须被“活化”，优选通过烷基化反应。具体地说，该葡聚糖在碱性pH下与溴化氰(CNBr)反应，接着与二氨基乙烷反应。将所得氨基乙基氨基-葡聚糖透析。该透析步骤用于洗涤掉小的反应分子或反应过的残余物质，例如二氨基乙烷。
这之后，在中性pH下将氨基乙基氨基-葡聚糖用溴代-乙酰溴酰基化，接着相对水进行透析并冷冻干燥。葡聚糖活化的该方法由S.C.Tam、J.Blumenstein和J.T.F.Wong详细描述在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1976，732128-2131；将其内容通过引用加入本文。
两个试验，茚三酮和硝酸银试验，用于监控透析结束。具体地说，对来自透析步骤的滤液进行这些试验，由此通过S.Moore和W.H.Stein(J.Biol.Chem.，1948，176367-388；将其内容通过引用加入本文)所述的茚三酮试验检测氨基的存在。进行硝酸银试验以检测溴基的存在，如下面讨论的。下面还将进一步描述这两个试验。
3.葡聚糖-血红蛋白共轭物的制备通过向称之为N-溴-乙酰氨基-乙基氨基-葡聚糖(DxBr)的活化的葡聚糖中加入无基质的血红蛋白进行血红蛋白与葡聚糖偶联的最终步骤。该偶联反应包括除去活化葡聚糖(DxBr)的-Br基和除去血红蛋白的巯基(-SH)的氢原子，使Dx-与HbS-结合从而获得DxHb。溴代-氨基乙基氨基-葡聚糖(DxBr)和Hb之间的连接是在β-93半胱氨酸(共价连接的位置)通过自由-SH介导的。在偶联反应的过程中，-Br从DxBr分离并变成自由Br离子，它后来被透析掉。可以使用硝酸银试验(下面进一步描述)测定Br离子的存在。
葡聚糖与血红蛋白的共轭是按照S.C.Tam、J.Blumenstein和J.T.F.Wong(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1976，732128-2131，将其内容通过引用加入本文)进行的。根据本发明的优选实施方式，该共轭反应是通过将DxBr和无基质的血红蛋白混合入含有0.33％ DxBr和1％无基质的血红蛋白溶液的水溶液中进行的。Hb和DxBr的这种浓度确保3∶1重量或1∶1摩尔质量比的DxHb偶联。然而，获得这些比例的反应物的其它最初浓度对本领域技术人员将是显而易见的。
溴代-葡聚糖(DxBr)与高浓度的血红蛋白溶液的偶联(即共轭)试验使得交联度较高，由此使得所得共轭物的摩尔重量较高。因此，为了具有较高比例的相对小的DxHb分子，优选使用较低(即1％)浓度的Hb进行该偶联反应。然而，应理解的是可以进行DxBr与或者比1％浓度高或者比其低的血红蛋白的偶联。
在具有碳酸氢钠缓冲剂的pH为9.5的溶液中进行该偶联反应。溶液混合物首先用0.22μm过滤器杀菌并按照H.Xue和J.T.F.Wong(Meth.Enzymol，1994，231308-322，将其内容通过引用加入本文)所述的方法在4℃下将该偶联反应进行过夜。将该偶联反应进行约10-16小时，最优选16小时。较长的偶联时间，由于交联度较高，因此获得较高平均分子量的DxHb。
然后将β-巯基丙酸加入与DxBr上的任何残余溴基反应，由此使偶联反应停止。而且，随着这加入也使交联反应停止，由此防止了溶液粘度的任何进一步升高(S.P.Tsai和J.T.F.Wong，在Winslow，R.W.、Vandegriff，K.D.和Intaglietta，M.(编辑)，Advances inBlood Substitutes，1997，Birkhauser，Boston，将其内容通过引用加入本文)。然后将该溶液经过相对磷酸盐缓冲液的透析以清除任何残余的反应物和反应副产物。
因此，获得上面共轭的烷基化方法可以汇总如下(如Blumenstein等，Experimental Transfusion of Dextran-Hemoglobin，(1978)中所述；将其内容通过引用加入本文)1)2)
3)4)4.DxHb分馏和ESR、EXC和MW之间的关系在发现通过过大DxHb分子强化ESR之后加入分馏步骤。为了确定分子大小、ESR和EXC之间的关系，该DxHb优选由具有至少两个开始平均大小10kD(DxT10)和20kD(DxT20)的葡聚糖分子合成。所得共轭物，DxT10Hb和DxT20Hb，使用Waters 650E先进蛋白质提纯系统进行分馏。更具体地说，该分馏是在HiloadTM26/60 SuperdexTM200预备级凝胶过滤柱(Pharmacia)上进行的。使用10mM磷酸盐缓冲溶液，pH7.4，作为洗脱缓冲液并且洗脱流速是0.5ml/min。所用样品是8ml的8％ DxHb。使用ISCO Retriever II收集馏份(馏份收集8分钟，即每一馏份4ml)。如下所述测定馏份的ESR和EXC。然而，由于由柱分馏步骤获得的样品量不够ESR和EXC试验，因此将几次馏份汇集并用Centriprep 30(Amicon)浓缩，以便有足够样品(每一大小的)进行这两种试验。还测定每一馏份的平均MW。尽管上面提到的分馏步骤描述涉及到DxHb，但是本领域技术人员应理解的是，这种分馏步骤也可以对DxBr前体分子进行。在这种情况下，使用上述方法将DxBr馏出物与Hb共轭，从而获得所需大小范围的DxHb馏份。下面描述按照本发明优选实施方式进行的测定的细节。
4.1.ESR测定红血球沉淀速度(ESR)是一种定量红细胞凝聚的方式。这种凝聚通常是因高分子的存在引起的。为了该测定，优选通过将6.0％试验溶液与等体积的刚抽出的柠檬酸化大鼠全血制备样品。ESR测定应在抽出鲜血之后的3-4小时内进行，这是因为悬液稳定性的潜在变化和长时间静置下红细胞的红血球变形性。当使用取自大鼠的血液时发现这一点。根据厂商Clay Adams，Division of Becton Dickison andCompany，Parisippany，N.J.，07054 USA提供的说明进行ESR测定。以垂直位置将溶液在可重复使用的Clay Adams Wintrobe Blood沉淀管(115mm长，具有3.0mm孔)中于ESR支架(ChaseInstruments)上室温(约20-22℃)下保持60分钟。该方法在本文通常称之为“Wintrobe法”并且该方法的描述提供于″Introductionto Medical Laboratory Technology″，Baker和Silverstein(编辑)，第5版第605-606页，Butterworths，将其内容通过引用加入本文。
将这些沉淀管以1mm间隔划刻度。就一些制品而言，沉淀和上清液之间没有清楚的边界，但是在ESR管的上面部分观察到渐渐的颜色变化。就这些制品而言，ESR以一个范围(例如1-18mm/hr，表2)表示。可接受的ESR呈现为20mm/hr。
应指出的是ESR的其它测定方法对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，代替上面所述的Wintrobe法，也可以使用″Introduction to Medical Laboratory Technology″，Baker和Silverstein(编辑)，第5版，第606-607页，Butterworths中所述的Westergren法，将其内容通过引用加入本文。这些方法将获得不同的ESR值，然而，在本情况下将得出相同结论。
4.2.EXC测定进行排泄速度(EXC)试验以测定本发明的DxHb共轭物的肾排泄程度。为了测定EXC，将DxHb共轭物的试验溶液输注入平均重量为约300-350g的麻醉的雄性Sprague-Dawley大鼠的颈静脉中。通过D.L.Drabkin和J.H.Austin，(J.Biol.Chem.，1935，11251-65，将其内容通过引用加入本文)所述的方法测定大鼠尿样中的血红蛋白的浓度来评价排泄速度。尽管该EXC值优选是0，但是可接受的值可以是小于1％。在该水平以上，发现大鼠的尿呈微红色。
4.3.分子量测定使用凝胶过滤色谱法测定DxHb共轭物的分子量，其中分子从柱洗脱以降低分子量。当DxHb分子在凝胶过滤柱上分馏时，检测器监控其停留时间。将Fast Protein Liquid Chromatography(FPLC)用于本发明的DxHb共轭物的分子量测定，然而也可以使用高效液相色谱法(HPLC)。为了描述本发明的目的，使用Waters 650E AdvancedProtein Purification System测定分子量。在该系统中串联使用以下两个柱1)TSK-Gel GMPWXL(7.8x300)；和2)PharmaciaSuperose 6 HR10/30。洗脱缓冲液由10mM Tris-HCl、0.05％叠氮化钠组成，pH8.0，所用流速是0.4ml/min。在该优选实施方式中，使用可用于DxHb的MW测定的检测器检验洗脱液的组成。例如，可以将Wyatt Technology MiniDAWN激光检测器或紫外线检测器用于本目的。在该优选实施方式中，将以下3个检测器串联使用Waters440 UV Detector A280；Wyatt Technology MiniDAWN检测器和Waters 410差示折射仪。下表1列出了生产的各种DxHb的峰分子量值。而且，使用上述系统获得以下分子量数据
通过将讨论的分子的Ve/Vo比与已知分子量的蛋白质标准的Ve/Vo相比确定各种馏份的分子量(Ve是洗脱体积，Vo是空隙体积)。给定柱的空隙体积是以洗脱大分子如Blue Dextran等所需的洗脱液的体积为基础的。然后通过将蛋白质标准的已知分子量的对数相对它们各自的Ve/Vo值绘图制备校准曲线。
应指出的是测定的分子量值可以根据所用设备/方法而改变。例如，S.P.Tsai和J.F.T.Wong(Artificial Cells Blood Subst.Immob.Biotech.，1996，24513-523)报道测定血红蛋白的分子量时反常。根据该报道，Hb分子，由于其致密，发现圆形分子结构和形状通过FPLC系统测定具有仅46kD的MW测定，而其理论值是64.5kD。如上所述，使用MiniDAWN激光法测定Hb的分子量发现是66+/-7kD，范围是58-73kD，这非常接近理论值。而且，葡聚糖，由于其直链结构，使用凝胶过滤获得一分子量读数，即比其理论值高。当测定用于本发明DxHb共轭物的MW限制时应考虑到这一事实。为此，为了获得更精确结果而使用上述激光检测器。例如，使用这种激光检测器，发现测定的Hb的分子量与其理论值接近。
4.4.ESR和EXC对DxHb共轭物的大小依赖性在如上所述的洗脱体积的峰值下测定的ESR、EXC和MW数据提供于表1并描述在图1中。
表1.ESR和EXC对由两个开始大小(10kD和20kD)的萄聚糖分子合成的DxHb共轭物的大小依赖性
正如上面所讨论的，血红蛋白本身快速排泄的问题显然是由于其相对低的分子量的结果。为了增加血红蛋白的分子量从而能够适当的保留，将其与例如葡聚糖等的多糖偶联。理想地，如果血红蛋白以作为血液代用品的DxHb共轭物的形式施用的话不应观察到血红蛋白的肾排泄。然而，优选排泄速度低于约1％，更优选低于约0.2％(S.C.Tam和J.T.F.Wong，大鼠中无基质的血红蛋白的肾功能的损害，J.Lab.Clin.Med，1988，111189-193；将其内容通过引用加入本文)。
同样正如上面讨论的，尽管较高分子量导致EXC降低，但是这种较大分子量会导致ESR的增加。根据本发明的优选实施方式，ESR应小于约20mm/hr，更优选ESR应小于约1mm/hr。
在使用凝胶过滤色谱法将本发明的DxHb共轭物以分子量为基础分馏并测定收集的馏份对ESR的影响之后，发现峰分子量小于约500kD的DxHb馏份在高达20mm/hr的可接受限度下未提高ESR。另一方面，大于约50kD的峰分子量的DxHb共轭物导致EXC值在0-1％的可接受的范围内。根据本发明的优选实施方式，这些结果定义了获得所需水平的ESC和ESR的DxHb共轭物分子量的可接受范围是约50kD-约500kD。
5.选择最佳分馏步骤以获得优选的Dxhb共轭物一旦测定了DxHb共轭物的上面所需的分子量范围，就开始搜索最佳分馏步骤。确定最佳分馏步骤所考虑的一个因素是使DxHb产品的产率最大化。高产率的最终产品避免了DxHb的任何不必要的浪费。
使用几个方法达到获得最佳分子大小的最终DxHb产品的目标。这些方法包括乙醇沉淀、开始葡聚糖的选择、以及过滤。在活化步骤之前和之后，以及在共轭步骤之前和之后，将Dx、DxBr和DxHb分馏，从而筛选较好的生产步骤。对各种DxHb制品的所用步骤和所得ESR和EXC列于下表2。
表2.通过各种方法获得的DxHb共轭物的红血球沉淀速度和排泄速度
其中1)“DxT10”和“DxT20”是指葡聚糖(Dx)分子的开始大小；即平均分子量分别为10或20kD。
2)“活化”意思是Dx通过如上所述的烷基化活化。
3)“偶联”是指DxBr与Hb如上所述的共轭、或偶联。
4)“＜100kD”或“＞500kD”等是指在DxBr或DxHb的过滤步骤期间所用的过滤器的截留值。而且，符号“＜”和“＞”分别是指滤液和保留物各自的值。例如，“＜100kD”是指过滤器提供仅含分子量小于100kD的那些分子的滤液。类似地，“＞500kD”是指过滤器提供具有分子量大于500kD的分子的保留物。
*ND＝未检出**所有Dx样品(即T10、T20、T20P)都是从Pharmacia BiotechAB获得的。
***A/G＝A/G Technology Corp.，Needham，MA，USA****乙醇ppt＝乙醇沉淀(下面将进一步讨论)偶联反应之后所用的截留值较大(例如500kD)的过滤器有助于去除过大的DxHb共轭物(大于约500kD的那些-优选产品的上限)。共轭之后所用的中间过滤器(例如50kD、70kD)用于除去小于优选产品的下限(约50kD)的分子。小过滤器(例如10kD)的实际功能与共轭反应之后进行的透析方法的相同，即除去任何残余反应物(例如巯基丙酸等)。
乙醇沉淀的功能是在活化步骤之前去除过大的葡聚糖分子。乙醇以逐步方式加入。例如，在制品#55-59(表2)中乙醇从最初浓度的0％开始至高至最终浓度55％慢慢加入。结果，一些过大的葡聚糖分子沉淀、成颗粒并再次溶解用于后面的活化。
从表2所列的选择几个DxHb制品作为最优选的。这些制品在表2中以编号13、14和16加以鉴定。所选制品的选择是以所需的ESR和EXC值以及产品的产率为基础。
如上所述测定这些制品的峰分子量并描述于图3中。如图3所示，优选制品，两个批次的制品#14和两个批次的制品#16，的峰MW分析为102、96、93、89kD。此外，尽管图3中没有显示，但是制品#13的平均MW分析为116kD。这些数据定义了本发明的最优选DxHb制品的平均MW的最优选范围。
因此，根据本发明，DxHb共轭物的优选大小范围是约50kD-约500kD，最优选范围是约89kD-约116kD。合成这些制品的最佳步骤包括将开始大小为20kD的葡聚糖活化，将活化的DxBr通过500kD或300kD过滤器过滤，将过滤的产物与无基质的血红蛋白偶联，将所得DxHb通过500kD过滤器过滤以去除任何过大的共轭物。生产本发明的DxHb共轭物的最优选步骤还包括将所得共轭物通过80kD过滤器以去除可能潜在增加EXC值的任何过小的共轭物的最终步骤。
下表3呈现了与表2类似的DxHb共轭物制品的数据。然而，表3包括涉及不同共轭物的附加的进一步制备和分析信息。表3中的数据还显示了各个批次的分子量分布。
表3Dx-Hb的制备步骤和分析结果
注-(1)DxHb的偶联显示相当于Hb浓度的％值。例如，就批次5.5而言，DxHb偶联是用1％Hb和0.33％DxBr进行的。
-(2)最终DxHb分馏步骤的常规产率，显示生产的Dx-Hb的％组分。
-(3)表3包括通过ESR值分类的数据并显示ESR值如上面定义的可接受的“截留”。
以下实施例用于描述本发明的优选实施方式，无论如何不打算限制本发明。
实施例1无基质的人血红蛋白(SFH)的制备根据上面所述的方法制备本发明的SFH。旧人血是由香港红十字输血站供应的。将15单位(约4.5升)全血，A、AB或O型，汇集并与4.5L的10mM PBS(磷酸盐缓冲液-10mM磷酸钠缓冲液和154mMNaCl的混合物)，pH7.4混合于一10-升玻璃瓶中。红细胞(RBC)用7体积的冷缓冲液洗涤，用安装于FlexStrandTM(A/G TechnologyCorp.，Needham，MA)上的0.65μm(CFP-6-D-6A)中空纤维过滤器以约10L的恒定体积渗滤。然后将RBC用低渗10mM磷酸盐缓冲液于与0.1μm膜筒(CFP-1-E-6A，A/G Technology Corp)相同的pH下慢慢溶解。该体积的RBC微粒用高达5体积的缓冲液充分洗涤。然后将滤液通过500kD过滤器(UFP-500-E5A，A/G Technology Corp.)渗滤以确保无基质，然后通过10kD膜盒(UFP-10-E-9A，A/GTechnology Corp.)循环浓缩至20g/dL。溶液用10mM PBS，pH7.4渗滤，它是最后贮藏的缓冲液。将最终血红蛋白溶液通过串联的预过滤器和0.22μm过滤器(293mm，Millipore)进一步确定它无菌。将该无基质的血红蛋白溶液装瓶并于4℃下贮藏。
实施例2通过烷基化方法将葡聚糖活化根据本发明的优选实施方式通过烷基化方法将葡聚糖活化的描述包括小规模和中试规模活化。小规模的葡聚糖活化可以获得仅以有限量生产DxHb，它仅足够研究目的，而中试规模的葡聚糖活化步骤可较大量地用于接下来共轭DxHb的工业设施。
a)小规模活化将溶于3mL乙腈的0.3g溴化氰(CNBr)(Riedel-de Haen)加入到95mL的2％葡聚糖(平均MW 20kD，Pharmacia)，并进行5分钟的活化。活化期间，通过连续加入1M NaOH将pH保持在10.8。之后，用2M HCl将其降至2.0-2.5。然后，将2mL二氨基乙烷(Sigma)与附加的HCl一起加入以防止pH超过9.5。在4℃下搅拌过夜之后，将混合物相对蒸馏水充分透析。优选通过用茚三酮法测定透析液证实透析结束。因此获得氨基乙基氨基-葡聚糖。然后将固体Na2HPO4加入混合物中至浓度为0.1M和pH7.0，并在2小时内加入3mL的溴代乙酰溴(Fluka)，在剧烈搅拌下结束并通过加入1M NaOH将pH保持在7.0。然后将混合物再次相对蒸馏水透析。优选通过用硝酸银溶液测定透析液证实透析结束。透析之后，将产物N-溴乙酰基-氨基乙基氨基-葡聚糖(DxBr)冷冻干燥并贮藏在冰箱中，备用。
b)中试规模活化将28g CNBr(Riedel-de Haen)溶于50mL乙腈中，然后加入到4.0L的3.5％葡聚糖(Pharmacia)中。通过持续5-10分钟连续加入6M NaOH(约50mL)将溶液的pH保持在10.8。之后，加入约50mL的6N HCl将pH降至约2.0。然后，将210mL二氨基乙烷(Sigma)与6N HCl(约500mL)一起加入以保持pH低于9.5。在4℃下搅拌过夜之后，用Millipore Pellicon Cassette FilterAcrylic Holder和3个叠卡PTGC 0005盒(Millipore)以约8L/min的流速将混合物相对40L蒸馏水充分透析。使用带有易装卸泵头(7529-80型，MasterFlex)的Cole-Parmer蠕动泵(7549-40型)保持葡聚糖溶液循环。循环体积保持在3-4L。为了监控透析结束，然后将滤液经受如下所述的茚三酮试验。
接下来，在剧烈搅拌下2小时内慢慢加入180mL溴代-乙酰溴(Fluka)，这期间通过加入6M NaOH将溶液保持在中性pH。然后，用Pellicon盒相对蒸馏水(约50L)将混合物充分透析。通过使滤液经受如下所述的硝酸银试验证实透析结束。将活化的溴代葡聚糖冷冻干燥并贮藏在-20℃。
c)茚三酮试验首先，如前面Moore，S.和Stein，W.H.(J.Biol.Chem.，1948，176367-388；加入本文作为参考)所述的制备茚三酮溶液。简言之，通过将1.0L的4.0M醋酸钠pH5.5与3.0L乙二醇一甲酯(Sigma)混合制备茚三酮溶液。混合物用氮气冒泡1小时。然后，加入80g茚三酮(Sigma)和7.5mL的21％三氯化钛溶液(Sigma)。将该茚三酮溶液保持在氮气下。
为了进行试验，将1.0mL茚三酮溶液与1.0mL DxBr溶液混合并使混合物在100℃下反应15分钟。可以通过加入2.0mL的50％乙醇稳定的蓝色显示阳性结果。在570nm下分光光度地获得定量分析。使用乙胺校准。将导致无色溶液的氨基的缺少显示反应彻底。
可以进行较简单的茚三酮试验以获得定量结果，其中将1.0g茚三酮(Sigma)溶于50mL蒸馏水中。将一半mL的该茚三酮溶液与等体积的DxBr溶液混合。如果存在任何残余氨基，那么混合物将变为黄色。
d)硝酸银试验使用硝酸银(AgNO3)(Nalcalai Tesque)溶液进行该试验。首先通过碱水解释放溴基。向每个0.5mL DxBr样品中加入3滴1MNaOH并将溶液于37℃下培养30分钟。接着，加入3滴浓硝酸，之后加入另3滴1％AgNO3。如果存在溴离子，将获得溴化银白色沉淀，并且溶液将变为乳白色。在上述实际试验中，没有白色沉淀，说明在DxBr溶液中没有溴基。
实施例3葡聚糖-血红蛋白共轭物的制备根据本发明，优选通过将16.7g的DxBr溶于5L(0.33％DxBr)的1％无基质的血红蛋白溶液中进行该共轭反应。加入碳酸氢钠缓冲液至最终浓度为0.1M并用1M NaOH将其pH调整至9.5。首先将溶液混合物通过0.22μm过滤器(Millipore)杀菌，搅拌并使该偶联反应在4℃下进行高达16小时。加入16mM β-巯基丙酸(Sigma，用NaOH将pH调整至0.5)以与任何残余溴基反应并使偶联反应停止。将溶液相对10mM磷酸盐缓冲液pH7.4经受透析，60分钟之后清除任何残余反应物如β-巯基丙酸、溴基等。将常规透析袋用于小试验管规模，而将10kD过滤器盒(UFP-10-E-9A，A/G Technol.)用于中试规模的透析。
实施例4分子量测定过滤柱的校准使用凝胶过滤色谱法测定本发明的DxHb制品的分子量的优选步骤概括在Technical Bulletin No.GF-3，Sigma Chemical Company，1987年10月。使用SuperdexTM200，26/600凝胶过滤柱(Pharmacia)。在测定本发明的DxHb共轭物的MW之前柱用标准蛋白质校准。所用标准蛋白质如下细胞色素c(MW 12.4kD)、碳酸酐酶(MW 29kD)、白蛋白(MW 66kD)、醇脱氢酶(MW 150kD)、β-淀粉酶(MW200kD)、铁蛋白(MW 440kD)。校准曲线示于图2，其中就每一蛋白质标准将分子量相对Ve/Vo绘图。由于每一馏份可以含有不同MW值的DxHb，因此测定每一馏份的平均分子量。
实施例5在豚鼠内开发出血模型方法将6个正常、健康的豚鼠用于出血条件的优化从而开发有用的出血模型，进而研究对存活的影响和向组织输送氧的评价。在试验之前将豚鼠圈养至少1周。随欲望供应食物和水。
用腹膜内(i.p.)注射戊巴比妥将这些动物麻醉，由于已知豚鼠具有较窄的呼吸道因此避免用醚。将颈静脉和颈动脉插套管灌注对照或试验溶液并且用分别与电子放大器和10mV记录器连接的压强传感器测定血压。持续头10分钟以30％、50％、70％、90％和100％的最大出血使动物流血，然后以约0.2-0.5ml的较小体积保持血压较低。如下计算流出的血液体积血液总体积(TBV)＝体重(g)×8％最大流血(MBO)＝TBV×60％10-分钟流血(10BO)＝MBO×不同百分比放血并保持约25mmHg的低血压持续90分钟之后，抽取0.2ml血液用血清乳酸酯试剂盒(Sigma)测定乳酸酯。Sigma诊断试剂盒上所述的步骤如下。简言之，将血液与等体积的TCA溶液混合，静置几分钟之后离心。将上清液贮藏用于后面的乳酸酯试验。将血管包扎，并将伤口用氨苄青霉素冲洗并缝合。然后监控动物并记录存活和体重数据。生活超过7天的动物分为“存活者”。
结果与讨论获得以下存活结果和90-分钟血液乳酸酯水平
图4和5描述了10-分钟流血体积对血容量减少性休克动物的长期存活的影响以及存活结果与90-分钟乳酸酯水平之间的关系。一般说来，出血越快，乳酸酯水平越高，暗示动物厌氧呼吸并且动物处于血容量减少性休克的状态。而且，乳酸酯水平越高，长期存活越低。试验之后存活者可以存活超过2个月并且观察到重量渐渐增加。相反，如果动物没有恢复，将连续失重并且最终在头几天内死掉。
实施例6豚鼠在其它致命出血之后用葡聚糖-血红蛋白溶液复生方法将体重为350-550g的可商购获得的豚鼠绝食过夜(16小时)，然后用戊巴比妥(Sigma)通过腹膜内注射麻醉。通过后趾收缩反应评价麻醉量并通过进一步给予戊巴比妥注射连续保持足够的反应。将颈动脉插套管放血并用与电子放大器和10mV图表记录器相连的压强传感器测定动脉血压。将颈静脉插套管以灌注液体。
在头10分钟内通过颈动脉放血与70％的MBO相当的体积，这期间血压从85mmHg变为30mmHg。接着，在以下的80分钟内偶尔放血0.2-0.5ml以保持血压在25-30mmHg。在90分钟时，在60分钟内在肾透析液中注入放血体积的对照缓冲液、血红蛋白(Hb)或分馏的葡聚糖-血红蛋白(Dx-Hb)。由于在试验期间放血技术不一致可能使乳酸酯水平太低或者过高，因此仅包括90-分钟乳酸酯水平在50-90mg/dl之间的那些。
结果和讨论
所用DxHb共轭物的描述
DDB2由DDB用＜500K A/G盒获得。
本领域技术人员应理解的是本发明的DxHb共轭物可用于各种目的并且可以各种方式使用。主要的是本发明的共轭物可用作血液代用品或血液膨胀剂。例如，这些DxHb共轭物可用作血液代用品以防止出血性休克(在外伤病房)或用于血液透析。
尽管参照一些特定实施方式描述了本发明，但是在不背离本发明精神和其附加权利要求书所概括的范围的情况下，其各种改变对本领域的技术人员来说将是显而易见的。
参考文献以下列出了上面讨论的一些参考文献。将以下内容通过引用加入本文。
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权利要求
1.一种载氧化合物，包含一种与多糖共价相连的血红蛋白的共轭物，所述共轭物具有约50kD-约500kD的平均分子量。
2.权利要求1的化合物，其中使用Wintrobe法，所述化合物获得低于20mm/hr的红血球沉淀速度(ESR)，并且肾排泄速度(EXC)低于1％。
3.权利要求1的化合物，其中所述多糖是葡聚糖。
4.权利要求3的化合物，其中所述共轭物具有约89kD-约116kD的平均分子量。
5.权利要求2的化合物，其中使用Wintrobe法，所述化合物获得低于1mm/hr的红ESR，并且肾EXC低于0.2％。
6.一种载氧化合物的制备方法，所述化合物包含与多糖共价相连的血红蛋白的共轭物，所述方法包括1)将多糖与溴化合物反应以在所述多糖上提供溴基，由此提供一活化多糖；2)用第一过滤器将所述活化多糖过滤；3)将所述活化多糖与血红蛋白反应由此提供一偶联的葡聚糖-血红蛋白分子；4)用第二过滤器将所述葡聚糖-血红蛋白分子过滤。
7.权利要求6的方法，其中所述多糖是葡聚糖。
8.权利要求7的方法，其中所述葡聚糖具有20kD的平均分子量。
9.权利要求6的方法，其中所述第一过滤器具有使保留物具有大于500kD的分子量的孔径。
10.权利要求9的方法，其中所述第一过滤器具有使保留物具有大于300kD的分子量的孔径。
11.权利要求6的方法，其中所述血红蛋白是无基质的血红蛋白。
12.权利要求6的方法，其中所述第二过滤器具有使保留物具有大于500kD的分子量的孔径。
13.权利要求6的方法，还包括在步骤4之后通过第三过滤器将葡聚糖-血红蛋白过滤的步骤。
14.权利要求13的方法，所述第三过滤器具有使滤液具有大于80kD的分子量的孔径。
全文摘要
一种具有50kD－500kD的平均分子量的血红蛋白(Hb)－葡聚糖(Dx)共轭物提供了获得可接受的红血球沉淀速度(ESR)和排泄速度(EXC)的血液代用品。本发明的DxHb共轭物可作为血液代用品用于各种目的。
文档编号C08B37/02GK1668643SQ01817437
公开日2005年9月14日 申请日期2001年9月19日 优先权日2000年9月19日
发明者蔡常彬, 王子晖 申请人:右旋-血液公司