专利名称：一种通过可控接枝聚合制备糖基化有序多孔膜的方法
技术领域：
本发明涉及有序多孔膜的制备方法，具体涉及一种通过可控接枝聚合 制备糖基化有序多孔膜的方法。
背景技术：
近年来，微米、亚微米及纳米级有序多孔材料因其在催化剂负载、气 体传感器件、光电器件、细胞培养基材、分离或吸附介质等诸多领域的应 用前景而受到广泛关注。目前已经开发了 一系列制备有序多孔材料的方 法，如石板印刷法、刻蚀法、模板法、自组装法以及水辅助法等，其中水 辅助法制备有序多孔膜具有工艺简单、实验条件温和以及膜结构规整可控 等优点。
公开号为JP2002347107A的日本专利公开了 一种通过水辅助法制备 两亲性聚合物有序多孔膜的方法，该有序多孔膜可用作显示器件；公开号 为CN1869109A的中国专利申请中公开了一种在剥离衬底上浇铸聚合物 溶液，制备蜂窝状有序多孔复合薄膜的方法，极大地提高了多孔膜的机械 性能。但是上述两种有序多孔膜均不具有生物识别功能，限制了其在生物 医药领域的应用。
广泛存在于自然界中的糖与生物分子(如蛋白质)的识别作用和生命 活动息息相关，许多至关重要的生理过程如受精、免疫应答、细胞生长增 殖和分化等等都通过糖与蛋白质的特异性识别作用来完成。糖基化有序多 孔膜兼具糖类的优异生物相容性和特异性识別功能以及有序化表面，可广 泛应用于生物传感器、细胞培养、蛋白质选择性吸附分离等领域。目前，糖基化有序多孔膜的制备方法局限于通过含糖聚合物高湿度下直接浇铸
成月^ (参见J Nishida， et al. Preparation of self-organized micro-patterned polymer films having cell adhesive ligands， Polymer Journal, 2002， 34， 166-174)，这种方法制备的有序多孔膜的表面糖基分布和密度不可控。众 所周知，糖与生物分子的识别作用极大地依赖于糖基的分布与密度，因此 现有方法不利于糖生物功能的实现，存在明显不足。
公开号为CN101284914A的中国专利申请中公开了 一种糖基化有序 多孔膜的制备方法，是将含糖嵌段共聚物溶于溶剂中得到聚合物溶液，再 于相对湿度为50-90%,温度为5 5(TC下浇铸成膜，得到糖基化有序多 孔膜，可用于蛋白质的检测。该糖基化有序多孔膜虽然具有在特定区域内 糖基高度富集的有序表面，能充分发挥糖基识别蛋白质的集簇效应，显著 提高蛋白质的检测灵敏度，但不能根据需要控制有序多孔膜的表面糖基密 度。
发明内容
本发明提供了 一种通过可控接枝聚合制备糖基化有序多孔膜的方法， 所制备的有序多孔膜具有糖基分布及密度可控的特点，在蛋白质检测和细 胞培养等方面具有很好的应用前景。
一种通过可控接枝聚合制备糖基化有序多孔膜的方法，包括以下步
骤
(1) 将含羟基的苯乙烯嵌段共聚物溶于二硫化碳中，得到重量百分 比为0.5 ~ 15%的聚合物溶液；
(2) 将步骤(1)得到的聚合物溶液在相对湿度为50~90%、温度为 5 5(TC的环境中浇铸成膜，得到孔径为0.2~20微米的有序多孔膜；
(3) 将步骤(2)得到的有序多孔膜、正庚烷和三乙胺混合，0。C下 滴入溴异丁酰溴，反应5~24小时，将有序多孔膜取出经洗涤、干燥至恒
5重，得到表面固定化溴基团的有序多孔膜；
其中，以面积为4cn^的有序多孔膜计，正庚烷的用量为5~50mL， 三乙胺的用量为0.5~5mL，溴异丁酰溴的用量为0.3~3mL;
(4)将步骤(3)得到的表面固定化溴基团的有序多孔膜、曱醇、糖 烯单体、溴化亚铜、溴化铜和五甲基二乙基三胺在氮气氛围中密封，25 ~ 5(TC水浴中进行表面引发原子转移自由基聚合反应1-24小时，将膜取出 经洗涤、千燥至恒重，得到糖基化有序多孔膜，糖基接枝率为5~50克/ 平方米膜；
其中，以面积为4cn^的有序多孔膜计，甲醇的用量为5~20mL，糖 烯单体的用量为0.1 ~2g,溴化亚铜的用量为5~25mg，溴化铜的用量为 0~5mg,五甲基二乙基三胺的用量为7 40^L。
所述含羟基的苯乙烯嵌段共聚物优选苯乙烯/甲基丙烯酸羟乙酯嵌段 共聚物，其中曱基丙烯酸羟乙酯的摩尔百分含量为0.5 ~ 30%,嵌段共聚 物分子量为1 ~20万。
以苯乙烯/甲基丙烯酸羟乙酯嵌段共聚物为基材，采用水辅助法成膜， 在水滴诱导作用下，亲水嵌段曱基丙烯酸羟乙酯向孔周围迁移，得到孔内 羟基高密度富集的有序多孔 膜。
所述糖烯单体为带有双键的含糖单体，能够通过表面引发原子转移自 由基聚合实现在多孔膜表面的可控接枝；由于甲基丙烯酸类单体具有聚合 活性高、反应速率快的优点，故优选曱基丙烯酸葡萄糖氧基乙酯、曱基丙 烯酸甘露糖氧基乙酯或曱基丙烯酸半乳糖氧基乙酯，其中不同种类的糖侧 基可以实现对特定蛋白质的选择性识别作用。
由于接枝聚合的引发位点富集在膜孔内部，所制备的含糖聚合物主要 分布在孔内；多孔膜表面的糖基密度可以通过调节聚合时间、糖烯单体用 量及溴化铜用量进行控制，聚合时间越长，糖烯单体用量越多，溴化铜用 量越少，多孔膜表面的糖基密度越高。所述的糖基化有序多孔膜可用于蛋白质分离检测和细胞培养。
本发明中糖基接枝率采用如下称重法计算
糖基接枝率用Y表示
<formula>formula see original document page 7</formula>
Y的单位为克/平方米，其中，Wo为表面固定化溴基团的有序多孔 膜的重量，W,为得到的糖基化有序多孔膜的重量，S为表面固定化溴基团 的有序多孔膜的面积。
本发明具有如下优点
与现有制备糖基化有序多孔膜的方法相比，本发明通过表面引发原子 转移自由基聚合方法能够实现糖烯单体定向可控接枝聚合，得到含糖聚合 物链长可控并富集在孔内的有序多孔膜，采用的工艺设备简单，操作简便， 反应条件温和，得到的有序多孔膜的孔结构规整，表面糖基分布及密度可控。
糖与蛋白质之间存在一一对应的识别能力，通过不同种类的糖烯单体 的接枝聚合制备的糖基化有序多孔膜，可以实现对特定蛋白质的选择性吸 附和检测；该糖基化有序多孔膜不仅可以为糖与蛋白质相互作用的研究提 供一个良好的载体，同时还能作为细胞培养材料。
本发明适用于制备多种糖的糖基化有序多孔膜，在蛋白质分离检测和 细胞培养等方面具有良好的应用前景。
图1为实施例2中苯乙烯/甲基丙烯酸羟乙酯嵌段共聚物有序多孔膜的 扫描电镜照片；
图2为实施例2中接枝曱基丙烯酸甘露糖氧基乙酯的糖基化有序多孔 膜的扫描电镜照片；
图3为实施例3中接枝甲基丙烯酸半乳糖氧基乙酯的糖基化有序多孔膜的扫描电镜照片。
具体实施方式
实施例1
将嵌段共聚物分子量为1万、曱基丙烯酸羟乙酯的摩尔百分含量为
0.5%的苯乙烯/曱基丙烯酸羟乙酯嵌段共聚物溶于二硫化碳，配成重量百 分浓度为15%的聚合物溶液。
取0.1mL上述聚合物溶液涂覆到清洁玻璃表面，在相对湿度50%、 5 。C下成膜，获得面积约为4cr^的有序多孔膜；用扫描电子显微镜观察该 有序多孔膜，微孔直径为0,2微米。
将上述有序多孔膜、5 mL正庚烷和0.5 mL三乙胺置于烧瓶中，O'C下 滴入0.3 mL溴异丁酰溴，反应5小时，将有序多孔膜取出用曱醇和水洗 涤3次，干燥至恒重，得到表面固定化溴基团的有序多孔膜。
然后将上述表面固定化溴基团的有序多孔膜、5 mL曱醇、0.1 g曱基 丙烯酸葡萄糖氧基乙酯、5mg溴化亚铜、5mg溴化铜和7^L五曱基二乙 基三胺置于烧^f瓦，通氮气15分钟，密封，25'C水浴中进行表面引发原子 转移自由基聚合反应1小时，将膜取出依次用曱醇和去离子水洗涤3次， 干燥至恒重，得到糖基化有序多孔膜，糖基接枝率为5克/平方米膜。
实施例2
将嵌段共聚物分子量为20万、曱基丙烯酸羟乙酯的摩尔百分含量为 10%的苯乙烯/曱基丙烯酸羟乙酯嵌段共聚物溶于二石克化碳，配成重量百分 浓度为5%的聚合物溶液。
取O.lmL上述聚合物溶液涂覆到清洁玻璃表面，在相对湿度90%、 50 。C下成膜，获得面积约为4cn^的有序多孔膜；用扫描电子显微镜观察该 有序多孔膜，微孔直径为2.5微米。将上述有序多孔膜、50mL正庚烷和5mL三乙胺置于烧瓶中，O'C下 滴入3mL溴异丁酰溴，反应12小时，将有序多孔膜取出用甲醇和水洗涤 3次，干燥至恒重，得到表面固定化溴基团的有序多孔膜。
然后将上述表面固定化溴基团的有序多孔膜、10mL曱醇、2g曱基丙 烯酸甘露糖氧基乙酯、5mg溴化亚铜和40nL五曱基二乙基三胺置于烧瓶， 通氮气15分钟，密封，40。C水浴中进行表面引发原子转移自由基聚合反 应24小时，将膜取出依次用甲醇和去离子水洗涤3次，千燥至恒重，得 到糖基化有序多孔膜，糖基接枝率为50克/平方米膜。
实施例3
将嵌段共聚物分子量为5万、曱基丙烯酸羟乙酯的摩尔百分含量为 10%的苯乙烯/曱基丙烯酸羟乙酯嵌段共聚物溶于二硫化碳，配成重量百分 浓度为5%的聚合物溶液。
取O.lmL上述聚合物溶液涂覆到清洁玻璃表面，在相对湿度卯％、 50 'C下成膜，获得面积约为4cn^的有序多孔膜；用扫描电子显^鼓镜观察该 有序多孔膜，微孔直径为2.5微米。
将上述有序多孔膜、20 mL正庚烷和1.5 mL三乙胺置于烧瓶中，0°C 下滴入lmL溴异丁酰溴，反应24小时，将有序多孔膜取出用曱醇和水洗 涤3次，干燥至恒重，得到表面固定化溴基团的有序多孔膜。
然后将上述表面固定化溴基团的有序多孔膜、20mL甲醇、lg甲基丙 烯酸半乳糖氧基乙酯、25mg溴化亚铜、5mg溴化铜和40nL五曱基二乙 基三胺置于烧瓶，通氮气15分钟，密封，25。C水浴中进行表面引发原子 转移自由基聚合反应24小时，将膜取出依次用甲醇和去离子水洗涤3次， 干燥至恒重，得到糖基化有序多孔膜，糖基接枝率为20克/平方米膜。实施例4
将嵌段共聚物分子量为1万、曱基丙烯酸羟乙酯的摩尔百分含量为 0.5%的苯乙烯/曱基丙烯酸羟乙酯嵌段共聚物溶于二硫化碳，配成重量百 分浓度为5%的聚合物溶液。
取0.1mL上述聚合物溶液涂覆到清洁玻璃表面，在相对湿度90%、 25 。C下成膜，获得面积约为4cr^的有序多孔膜；用扫描电子显微镜观察该 有序多孔膜，微孔直径为2微米。
将上述有序多孔膜、50mL正庚烷和3mL三乙胺置于烧瓶中，O'C下 滴入1.5mL溴异丁酰溴，反应24小时，将有序多孔膜取出用曱醇和水洗 涤3次，干燥至恒重，得到表面固定化溴基团的有序多孔膜。
然后将上述表面固定化溴基团的有序多孔膜、5mL曱醇、2g曱基丙 烯酸葡萄糖氧基乙酯、25mg溴化亚铜、1 mg溴化铜和40^L五曱基二乙 基三胺置于烧瓶，通氮气15分钟，密封，25。C水浴中进行表面引发原子 转移自由基聚合反应10小时，将膜取出依次用曱醇和去离子水洗涤3次， 干燥至恒重，得到糖基化有序多孔膜，糖基接枝率为42克/平方米膜。
实施例5
将嵌段共聚物分子量为2万、甲基丙烯酸羟乙酯的摩尔百分含量为 30%的苯乙烯/曱基丙烯酸羟乙酯嵌段共聚物溶于二硫化碳，配成重量百分 浓度为5%的聚合物溶液。
取O.lmL上述聚合物溶液涂覆到清洁玻璃表面，在相对湿度90%、 25 t:下成膜，获得面积约为4cri^的有序多孔膜；用扫描电子显微镜观察该 有序多孔膜，微孔直径为2.5微米。
将上述有序多孔膜、5mL正庚烷和lmL三乙胺置于烧瓶中，0。C下滴 入0.6mL溴异丁酰溴，反应24小时，将有序多孔膜取出用曱醇和水洗涤 3次，干燥至恒重，得到表面固定化溴基团的有序多孔膜。然后将上述表面固定化溴基团的有序多孔膜、5mL曱醇、2g甲基丙 烯酸甘露糖氧基乙酯、20mg溴化亚铜、3mg溴化铜和40pL五曱基二乙 基三胺置于烧瓶，通氮气15分钟，密封，25。C水浴中进行表面引发原子 转移自由基聚合反应2小时，将膜取出依次用曱醇和去离子水洗涤3次， 干燥至恒重，得到糖基化有序多孔膜，糖基接枝率为35克/平方米膜。
实施例6
将嵌段共聚物分子量为5万、甲基丙烯酸羟乙酯的摩尔百分含量为 10%的苯乙烯/甲基丙烯酸羟乙酯嵌段共聚物溶于二硫化碳，配成重量百分 浓度为5%的聚合物溶液。
取O.lmL上述聚合物溶液涂覆到清洁玻璃表面，在相对湿度70%、 25 。C下成膜，获得面积约为4cn^的有序多孔膜；用扫描电子显微镜观察该 有序多孔膜，微孔直径为2.8微米。
将上述有序多孔膜、10mL正庚烷和lmL三乙胺置于烧瓶中，0。C下 滴入0.6mL溴异丁酰溴，反应24小时，将有序多孔膜取出用甲醇和水洗 涤3次，干燥至恒重，得到表面固定化溴基团的有序多孔膜。
然后将上述表面固定化溴基团的有序多孔膜、5mL甲醇、0.5g甲基丙 烯酸半乳糖氧基乙酯、5mg溴化亚铜、3mg溴化铜和25pL五曱基二乙基 三胺置于烧并瓦，通氮气15分钟，密封，25。C水浴中进行表面引发原子转 移自由基聚合反应24小时，将膜取出依次用曱醇和去离子水洗涤3次， 干燥至恒重，得到糖基化有序多孔膜，糖基接枝率为25克/平方米膜。
应用例1
将实施例1制备的面积约为4cm2的葡萄糖糖基化有序多孔膜浸入 lmL花生凝聚素/荧光标记伴刀豆球蛋白(PNA/FL-ConA)溶液中，其中 花生凝聚素的浓度为(Ug/L,伴刀豆球蛋白的浓度为0.1g/L， 25。C下恒温IO分钟，取出葡萄糖糖基化有序多孔膜，测得荧光强度相对值为28;将 实施例1制备的葡萄糖糖基化有序多孔膜浸入lmL荧光标记花生凝聚素/ 伴刀豆球蛋白(FL-PNA/ConA)溶液中，其中花生凝聚素的浓度为0.1g/L, 伴刀豆球蛋白的浓度为0.1 g/L, 25。C下恒温10分钟，取出葡萄糖糖基化 有序多孔膜，测得荧光强度相对值为4。
荧光强度的差别说明葡萄糖糖基化多孔膜可检测溶液中的伴刀豆球 蛋白。
应用例2
将实施例2制备的面积约为4cm2的甘露糖糖基化有序多孔膜浸入 lmL荒麻毒蛋白/焚光标记苦参凝聚素(RCA/FL-SFA)溶液中，其中蓖麻 毒蛋白的浓度为0.1g/L,苦参凝聚素的浓度为(Ug/L,25。C下恒温IO分钟， 取出甘露糖糖基化有序多孔膜，测得荧光强度相对值为150;将实施例2 制备的甘露糖糖基化有序多孔膜浸入lmL荧光标记蓖麻毒蛋白/苦参凝聚 素(FL-RCA/SFA)溶液中，其中蓖麻毒蛋白的浓度为0.1g/L,苦参凝聚 素的浓度为0.1g/L， 25。C下恒温10分钟，取出甘露糖糖基化有序多孔膜， 测得焚光强度相对值为6。
荧光强度的差别说明甘露糖糖基化有序多孔膜可检测溶液中的苦参 凝聚素。
应用例3
将实施例3制备的面积约为4cm2的半乳糖糖基化有序多孔膜浸入 lmL扁豆凝聚素/焚光标记蓖麻毒蛋白(LCA/FL-RCA)溶液中，其中扁豆 凝聚素的浓度为0.1g/L,蓖麻毒蛋白的浓度为0.1g/L，25。C下恒温IO分钟， 取出半乳糖糖基化有序多孔膜，测得荧光强度相对值为55;将实施例3 制备的半乳糖糖基化有序多孔膜浸入lmL荧光标记扁豆凝聚素/蓖麻毒蛋白(FL-LCA/RCA)溶液中，其中扁豆凝聚素的浓度为O.lg/L,蓖麻毒蛋 白的浓度为0.1g/L， 25。C下恒温10分钟，取出半乳糖糖基化有序多孔膜， 测得荧光强度相对值为7。
荧光强度的差别说明半乳糖糖基化有序多孔膜可检测溶液中的蓖麻 毒蛋白。
应用例4
将实施例4制备的面积约为4cm2的葡萄糖糖基化有序多孔膜浸入 lmL花生凝聚素/荧光标记伴刀豆球蛋白(PNA/FL-ConA)溶液中，其中 花生凝聚素的浓度为O.lg/L,伴刀豆球蛋白的浓度为0.1g/L， 25。C下恒温 IO分钟，取出葡萄糖糖基化有序多孔膜，测得荧光强度相对值为88;将 实施例4制备的葡萄糖糖基化有序多孔膜浸入lmL荧光标记花生凝聚素/ 伴刀豆球蛋白(FL-PNA/ConA)溶液中，其中花生凝聚素的浓度为0.1g/L， 伴刀豆球蛋白的浓度为O.lg/L, 25。C下恒温10分钟，取出葡萄糖糖基化 有序多孔膜，测得荧光强度相对值为4。
荧光强度的差别说明葡萄糖糖基化有序多孔膜可检测溶液中的伴刀 豆球蛋白。
应用例5
将实施例5制备的面积约为4cm2的甘露糖糖基化有序多孔膜浸入 lmL蓖麻毒蛋白/荧光标记苦参凝聚素(RCA/FL-SFA)溶液中，其中蓖麻 毒蛋白的浓度为0.1g/L，苦参凝聚素的浓度为0.1g/L，25。C下恒温IO分钟， 取出甘露糖糖基化有序多孔膜，测得荧光强度相对值为78;将实施例5 制备的甘露糖糖基化有序多孔膜浸入lmL荧光标记蓖麻毒蛋白/苦参凝聚 素(FL-RCA/SFA)溶液中，其中蓖麻毒蛋白的浓度为0.1g/L，苦参凝聚 素的浓度为0.1g/L， 25。C下恒温10分钟，取出甘露糖糖基化有序多孔膜，测得荧光强度相对值为6。
荧光强度的差别说明甘露糖糖基化有序多孔膜可检测溶液中的苦参
应用例6
将实施例6制备的面积约为4cm2的半乳糖糖基化有序多孔膜浸入 lmL扁豆凝聚素/荧光标记蓖麻毒蛋白(LCA/FL-RCA)溶液中，其中扁豆 凝聚素的浓度为0.1g/L,蓖麻毒蛋白的浓度为0.1g/L，25。C下恒温IO分钟， 取出半乳糖糖基化有序多孔膜，测得荧光强度相对值为65;将实施例6 制备的半乳糖糖基化有序多孔膜浸入lmL荧光标记扁豆凝聚素/蓖麻毒蛋 白(FL-LCA/RCA)溶液中，其中扁豆凝聚素的浓度为O.lg/L,蓖麻毒蛋 白的浓度为0.1g/L， 25。C下恒温10分钟，取出半乳糖糖基化有序多孔膜， 测得焚光强度相对值为5。
荧光强度的差别说明半乳糖糖基化有序多孔膜可检测溶液中的蓖麻 毒蛋白。
权利要求
1、一种通过可控接枝聚合制备糖基化有序多孔膜的方法，包括以下步骤(1)将含羟基的苯乙烯嵌段共聚物溶于二硫化碳中，得到重量百分比为0.5～15％的聚合物溶液；(2)将步骤(1)得到的聚合物溶液在相对湿度为50～90％、温度为5～50℃的环境中浇铸成膜，得到孔径为0.2～20微米的有序多孔膜；(3)将步骤(2)得到的有序多孔膜、正庚烷和三乙胺混合，0℃下滴入溴异丁酰溴，反应5～24小时，将有序多孔膜取出经洗涤、干燥至恒重，得到表面固定化溴基团的有序多孔膜；其中，以面积为4cm2的有序多孔膜计，正庚烷的用量为5～50mL，三乙胺的用量为0.5～5mL，溴异丁酰溴的用量为0.3～3mL；(4)将步骤(3)得到的表面固定化溴基团的有序多孔膜、甲醇、糖烯单体、溴化亚铜、溴化铜和五甲基二乙基三胺在氮气氛围中密封，25～50℃水浴中进行表面引发原子转移自由基聚合反应1～24小时，将膜取出经洗涤、干燥至恒重，得到糖基化有序多孔膜，糖基接枝率为5～50克/平方米膜；其中，以面积为4cm2的有序多孔膜计，甲醇的用量为5～20mL，糖烯单体的用量为0.1～2g，溴化亚铜的用量为5～25mg，溴化铜的用量为0～5mg，五甲基二乙基三胺的用量为7～40μL。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的含羟基的苯乙 烯嵌段共聚物为苯乙烯/曱基丙烯酸羟乙酯嵌段共聚物；其中，曱基丙烯酸 羟乙酯的摩尔百分含量为0.5~30%,嵌段共聚物分子量为1~20万。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的糖烯单体为甲 基丙烯酸葡萄糖氧基乙酯、曱基丙烯酸甘露糖氧基乙酯或曱基丙烯酸半乳糖氧基乙酯。
4、根据权利要求1 3任一项所述的方法制备的糖基化有序多孔膜在 蛋白质检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种通过可控接枝聚合制备糖基化有序多孔膜的方法，以含羟基的苯乙烯嵌段共聚物为基材，采用水辅助法制备有序多孔膜，通过表面引发原子转移自由基聚合反应，在催化剂存在下引发表面原子转移自由基接枝聚合，得到糖基化有序多孔膜。本发明方法简单、工艺条件温和、生产成本低，所制备的糖基化有序多孔膜具有糖基分布及密度可控的特点，可用于蛋白质检测和细胞培养等领域。
文档编号C08J9/00GK101555324SQ20091009880
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月18日 优先权日2009年5月18日
发明者万灵书, 徐志康, 柯蓓蓓 申请人:浙江大学