专利名称：快速沉淀分离肝素钠中多硫酸软骨素的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及将多硫酸软骨素从肝素钠中分离出去的方法。
背景技术：
肝素钠来源于猪小肠粘膜，是一种含有硫酸基的酸性粘多糖，是典型的抗凝血药，能阻止血液的凝结过程，防止血栓的形成。因为肝素钠在α-球蛋白参与下，能抑制凝血酶 原转变成凝血酶。肝素钠还具有澄清血浆脂质，降低胆固醇和增强抗癌药物的效用等作用。 临床广泛用作外科手术前后防止血栓形成和栓塞，输血时预防血液凝固和作为保存新鲜血 液的抗凝剂，广泛用于预防血栓疾病、治疗心机梗塞和肾病患者的渗血治疗，还可以用于清 除小儿肾病形成的尿毒症。肝素软膏在皮肤病的治疗与化妆美容中也广泛应用。我国是肝 素钠产量最大的国家，国际市场的肝素钠产品原料70%以上均来自中国。随着需求的增加， 肝素钠的价格这几年一路攀升，因此有些肝素钠中被人为的加入多硫酸软骨素。多硫酸软 骨素是一种类肝素物质，具有与肝素钠一样的抗凝血性质，其结构性质与肝素钠基本相似， 经检测与肝素钠的区别在于1、肝素钠是右旋结构，多硫酸软骨素是左旋结构；2、多硫酸 软骨素的绝对分子量比肝素钠的大；3、核磁检测其峰值比肝素钠后出现。2008年2月，美国因注射肝素钠出现4例死亡，多例不良反应的医疗事故，成为震 惊世界的“肝素钠事件”。经有关专家分析，上述事故可能是因为肝素钠中含有多硫酸软骨 素有关联。我国政府十分重视并关注事态发展，国家药监局召开专门会议，要求加强管理， 一律召回含有多硫酸软骨素的肝素钠。从肝素钠中分离多硫酸软骨素，迄今为止，除了有机溶剂萃取分离法外，未见其它 有关分离技术的报道。而有机溶剂萃取分离法存在以下缺陷一是由于多硫酸软骨素与肝 素钠同属多糖类物质，对乙醇、丙酮等有机溶剂的溶解性非常低，因此有机溶剂萃取法分离 效果不好，特别是肝素钠中多硫酸软骨素较高时分离效果更不明显。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速沉淀分离肝素钠中多硫酸软骨素的方 法，利用多硫酸软骨素的绝对分子量比肝素钠大的特点，在酒精中多硫酸软骨素比肝素钠 沉淀快，而肝素钠仍然留在上清酒精中，从而实现多硫酸软骨素与肝素钠的分离。为了实现上述技术问题，本发明采取以下技术方案予以实现快速沉淀分离肝素钠中多硫酸软骨素的方法，包括下列步骤(1)溶解在搅拌状态下，将粗品肝素钠加入反应釜内的水中，粗品肝素钠与水的 重量比为1 9-20，升温至55°C 士5°C，搅拌4-6小时，使肝素钠完全溶解；(2)过滤过滤，收集滤液。(3)树脂吸附将滤液泵入处理好的吸附柱，流出的液体循环泵入吸附；(4)清洗待流出液效价检测恒定后，停止吸附；用水清洗干净树脂；再用3-5倍 树脂体积的1. 0-1. 5mol/L盐水清洗树脂；
(5)洗脱配制2-3倍树脂体积的3-4mol/L盐水洗脱树脂，收集洗脱液；(6) 一次醇沉将洗脱液泵入醇沉罐，按体积的1-1. 5倍加入重量浓度为95%、或95%以上的酒精，搅拌约半小时，静置约12小时，收集肝素钠沉淀；(7)氧化将肝素钠沉淀按10000-20000IU/L溶解于0. 5-0. 7mol/L氯化钠溶液 中，用碱调PH10-12，再按体积的2-3%加入双氧水，在30-40°C下，氧化8-12小时；(8)快速沉淀氧化结束后，降温至10-20°C，将PH调至5-6，澄清过滤，收集滤液； 搅拌下缓慢加入酒精至溶液中酒精的重量浓度为30-38%，再搅拌30分钟，静置；用搅拌棒 试探罐底，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精转移至另一沉淀罐，收集沉淀；再静置，用搅 拌棒试探罐底，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精转移至另一沉淀罐，再收集沉淀物；如 此重复，直至连续静止4小时罐底没有沉淀，再向溶液中补加酒精至溶液中酒精的重量浓 度为45-50%，静止沉淀10-12小时，将肝素钠完全沉淀；分别将每次收集的沉淀物送检测，不含多硫酸软骨素的沉淀物合并后进入下一工 序；(9)脱水烘干将步骤⑶的沉淀物加入酒精中，搅拌捣碎，溶液中的酒精重量浓 度在85%以上，静止12小时，真空抽滤，得到的固体物在70-80°C真空干燥，即得到不含多 硫酸软骨素的肝素钠。步骤(8)所述的将沉淀物取样烘干检测，吸光度0D260应小于0. 1，若不合格，应重 复氧化和快速沉淀这两道工序过程，如合格才能进入下一工序。与现有技术相比，本发明的优点是本发明采用离子交换法去除大量杂质，结合双氧水氧化法，大大提高肝素钠的色 泽、效价，再用酒精快速沉淀法分离肝素钠中的多硫酸软骨素，保证肝素钠的收率达到85% 以上，效价在180u/mg以上，各项指标完全符合USP、EP标准。本发明快速沉淀法分离多硫酸软骨素比报道的丙酮萃取法效果更加显著，因为多 硫酸软骨素与肝素钠同属多糖类物质，对乙醇、丙酮等有机溶剂的溶解性非常低，因此有机 溶剂萃取法分离效果不好，特别是肝素钠中多硫酸软骨素较高时分离效果更不明显。而快 速沉淀法是根据多硫酸软骨素绝对分子量比肝素钠大、结构上又有差异等特点设计的，本 发明操作简单、分离效果显著。经分离后的肝素钠符合注射级肝素钠原料质量要求。
图1为分离前含有多硫酸软骨素的肝素钠核磁图谱；图2为分离后的肝素钠核磁图谱；图3为多硫酸软骨素核磁图谱。图1中峰①为肝素钠，峰②为多硫酸软骨素峰③为硫酸皮肤素。图2中峰①为肝 素钠。图3中峰②为多硫酸软骨素。如图1所示，没有分离前含多硫酸软骨素的肝素钠核磁图谱中，多硫酸软骨素峰 非常明显，显示含量较高。如图2所示，分离后的肝素钠核磁图谱中，已没有图1、图3所示 的相应峰值位置的峰，说明本发明的快速沉淀法不仅能够分离除去肝素钠中的多硫酸软骨 素，而且除去了其他杂质。
具体实施例方式(1)溶解开启水阀，向反应釜内加入1500L饮用水，边搅拌边将150亿总效价粗品肝素钠(粗品肝素钠效价为100IU/毫克，粗品肝素钠与水的重量比为1 10)加入反应 釜中，开启蒸汽，升温至55°c 士5°C，搅拌5小时，使肝素钠完全溶解；(2)过滤100目滤网过滤，少量水清洗滤渣，收集滤液和洗液(两者合并)；(3)树脂吸附将滤液泵入处理好的共有3000L阴离子交换树脂吸附柱，控制流速 50L/h，流出液接入桶内循环泵入吸附24小时；(4)清洗待流出液效价检测恒定后，停止吸附。吸附残液排空。用水清洗干净树 月旨，再配制10000L1. Omol/L盐水清洗树脂；(5)洗脱配制10000L的3mol/L盐水洗脱树脂，洗脱液收集；(6) 一次醇沉将洗脱液泵入醇沉罐，加入12000L重量浓度为95%的酒精，搅拌半 小时，静置12小时，收集肝素钠沉淀；(7)氧化将肝素钠沉淀加入3000L饮用水中，搅拌使其溶解完全，接着加入氯化 钠lOOKg，混合均勻后用重量浓度为20%的氢氧化钠调PH至11，再加入重量浓度为20%的 双氧水80L，并保持在35°C的温度下，氧化10小时；(8)快速沉淀氧化结束后，降温至15°C，用盐酸将PH调至5. 5，澄清过滤，收集滤 液；搅拌下缓慢加入重量浓度为95%的酒精，使溶液中酒精的重量浓度为35%，再搅拌30 分钟，静置；用搅拌棒试探罐底，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精转移至另一沉淀罐，收 集沉淀；再静置，用搅拌棒试探罐底，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精转移至另一沉淀 罐，再收集沉淀物；如此重复，直至连续静止4小时罐底没有沉淀，再向溶液中补加重量浓 度为95%的酒精至溶液中酒精的重量浓度为47%，静止沉淀11小时，将肝素钠完全沉淀； 分别将每次收集的沉淀物送QA检测，不含多硫酸软骨素的沉淀物合并后进入下一工序；(9)脱水烘干将步骤(8)的沉淀物加入酒精中，搅拌捣碎，溶液中的酒精重量浓 度在85%以上，静止12小时，真空抽滤，得到的固体物在55°C真空干燥，得到不含多硫酸软 骨素的肝素钠72. 8Kg，效价180IU/mg，其它指标均符合美国药典、欧洲药典标准。(10)粉碎包装将步骤(9)的产品取出，进行120目粉碎，并称重包装，同时取样 送检。
权利要求
快速沉淀分离肝素钠中多硫酸软骨素的方法，其特征在于包括下列步骤(1)溶解在搅拌状态下，将粗品肝素钠加入反应釜内的水中，升温至55℃±5℃，搅拌4-6小时，使肝素钠完全溶解；(2)过滤过滤，收集滤液。(3)树脂吸附将滤液泵入处理好的吸附柱，流出的液体循环泵入吸附；(4)清洗待流出液效价检测恒定后，停止吸附；用水清洗干净树脂；再用3-5倍树脂体积的1.0-1.5mol/L盐水清洗树脂；(5)洗脱配制2-3倍树脂体积的3-4mol/L盐水洗脱树脂，收集洗脱液；(6)一次醇沉将洗脱液泵入醇沉罐，按体积的1-1.5倍加入重量浓度为95％、或95％以上的酒精，搅拌半小时，静置12小时，收集肝素钠沉淀；(7)氧化将肝素钠沉淀按10000-20000IU/L溶解于0.5-0.7mol/L氯化钠溶液中，用碱调PH10-12，再按体积的2-3％加入双氧水，在30-40℃下，氧化8-12小时；(8)快速沉淀氧化结束后，降温至10-20℃，将PH调至5-6，澄清过滤，收集滤液；搅拌下缓慢加入酒精至溶液中酒精的重量浓度为30-38％，再搅拌30分钟，静置；用搅拌棒试探罐底，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精转移至另一沉淀罐，收集沉淀；再静置，用搅拌棒试探罐底，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精转移至另一沉淀罐，再收集沉淀物；如此重复，直至连续静止4小时罐底没有沉淀，再向溶液中补加酒精至溶液中酒精的重量浓度为45-50％，静止沉淀10-12小时，将肝素钠完全沉淀；分别将每次收集的沉淀物送检测，不含多硫酸软骨素的沉淀物合并后进入下一工序；(9)脱水烘干将步骤(8)的沉淀物加入酒精中，搅拌捣碎，溶液中的酒精重量浓度在85％以上，静止12小时，真空抽滤，得到的固体物在70-80℃真空干燥，即得到不含多硫酸软骨素的肝素钠。
2.如权利要求1所述的快速沉淀分离肝素钠中多硫酸软骨素的方法，其特征在于步 骤(3)所述的树脂为阴离子交换树脂。
全文摘要
本发明公开了快速沉淀分离肝素钠中多硫酸软骨素的方法，本发明采用离子交换法去除大量杂质，结合双氧水氧化法，大大提高肝素钠的色泽、效价，再用酒精快速沉淀法分离肝素钠中的多硫酸软骨素，保证肝素钠的收率达到85％以上，效价在180u/mg以上，各项指标完全符合USP、EP标准。本发明比报道的丙酮萃取法效果更加显著，因为多硫酸软骨素与肝素钠同属多糖类物质，对乙醇、丙酮等有机溶剂的溶解性非常低，因此有机溶剂萃取法分离效果不好，特别是肝素钠中多硫酸软骨素较高时分离效果更不明显。而快速沉淀法是根据多硫酸软骨素绝对分子量比肝素钠大、结构上又有差异等特点设计的，本发明操作简单、分离效果显著。
文档编号C08B37/10GK101824098SQ20101011206
公开日2010年9月8日 申请日期2010年2月12日 优先权日2010年2月12日
发明者刘榜惠, 张志斌, 袁红英 申请人:淮安麦德森化学有限公司