用于产前诊断和监测的新的胎儿标志物的制造方法与工艺

用于产前诊断和监测的新的胎儿标志物相关申请本申请要求享有2006年5月3日提交的美国临时专利申请序列号60/797,456的优先权，其内容通过引用整体并入本文。发明背景妊娠相关状态(包括妊娠或者分娩期间的潜在并发症以及胎儿的遗传缺陷)的早期检测非常重要，因为它允许母体和胎儿安全所需的早期医疗介入。通常采用例如绒毛膜绒毛取样(CVS)或者羊膜穿刺术的方法利用从胎儿分离的细胞来进行产前诊断。尽管操作非常仔细，但这些常规方法均是侵入性的，并对母体和胎儿有一定的风险(Taboretal.,Lancet1:1287-1293,1986)。在发现母体循环中存在数种类型的胎儿细胞(Johansenetal.,Prenat.Diagn.15:921-931,1995)之后，更重要的是在发现母体血浆和血清中能够检测到循环的无细胞的胎儿DNA(Loetal.,Lancet350:485-487,1997)之后，已经开发了替代这些侵入性方法的产前筛查方法，例如检测胎儿异常的方法。已证明，母体血液中的胎儿DNA的含量足够用于遗传学分析，与需要分离和富集胎儿细胞步骤的替代方法相比，并不需要对所述血浆或血清进行复杂的处理。利用基于聚合酶链式反应(PCR)的技术，通过检测母体血浆或者血清中的胎儿DNA来实现恒河猴胎儿D(RhD)基因型的检测(Loetal.,N.Engl.J.Med.339:1734-1738,1998)、胎儿性别的确定(Costaetal.,N.Engl.J.Med.346:1502,1998)以及数种胎儿病症的诊断(Amicuccietal.,Clin.Chem.46:301-302,2000；Saitoetal.,Lancet356:1170,2000；及Chiuetal.,Lancet360:998-1000,2002)。此外，已报道在先兆子痫(Loetal.,Clin.Chem.45:184-188,1999和Zhongetal.,Am.J.Obstet.Gynecol.184:414-419,2001)、胎儿21三体(Loetal.,Clin.Chem.45:1747-1751,1999和Zhongetal.Prenat.Diagn.20:795-798,2000)和妊娠剧吐症(hyperemesisgravidarum)(Sekizawaetal.,Clin.Chem.47:2164-2165,2001)中的母体血浆/血清的胎儿DNA定量性异常。美国专利第6,258,540号也公开了用于产前遗传分析的母体血液中胎儿核酸的检测。母体血液中的胎儿RNA已经被确定作为妊娠相关状态的诊断工具。例如，美国专利申请号09/876,005公开了基于检测母体血液中胎儿RNA的非侵入性技术；美国专利申请号10/759,783还公开了母体血液中存在的某些mRNA种类(例如，hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2和PLAC1)的数量可以用作诊断、监测或者预测妊娠相关病症的标志物，所述妊娠相关状态例如先兆子痫、胎儿染色体的非整倍性和早产。尽管DNA的稳定性为基于胎儿DNA的诊断提供了优势，但是这种方法存在较大的限制：胎儿和母体DNA均存在于孕妇血液的无细胞部分，例如，血清或者血浆。因此，需要区分胎儿DNA和母体DNA以保证确切的诊断。公开号为20030044388的美国专利申请号09/944,951首次公开了胎儿和母体DNA可以根据它们不同的甲基化模式进行区分。Landes等在美国专利申请公开号20030211522中还提出了不同的甲基化标志物可以用于产前诊断。在本文中，许多位于染色体21上的人类基因组DNA序列第一次被鉴定为包含基因组DNA差别甲基化区域的位点，所述基因组DNA来自胎儿或者成人(例如，孕妇)。因此，这些差别甲基化的基因组位点能够正确鉴定或者定量胎儿和母体DNA，从而能够可靠的诊断产前状态。发明简述在本发明的第一个方面，提供检测或者监测在怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法。所述方法包括下列步骤：(a)从所述妇女获得生物样品，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)确定样品中包含CpG的基因组序列的甲基化状态，其中所述胎儿的基因组序列和所述妇女的基因组序列是差别甲基化的，从而区别所述样品中所述妇女的基因组序列和所述胎儿的基因组序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)、类Fem1A(秀丽线虫(Caenorhabditiselegans))、CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)、染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；(c)确定胎儿基因组序列的水平；和(d)将所述胎儿基因组序列的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，所述妇女的基因组序列是甲基化的，而胎儿的基因组序列是非甲基化的。在其他实施方式中，所述妇女的基因组序列是非甲基化的，而胎儿的基因组序列是甲基化的。在一些实施方式中，通过用差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理样品来实施步骤(b)。例如，所述试剂可以包括亚硫酸氢盐；或者所述试剂可以包括一种或者多种优选切割甲基化DNA的酶；或者所述试剂可以包括一种或者多种优选切割非甲基化DNA的酶。在一些实施方式中，通过甲基化特异性PCR来实施步骤(b)。在本发明的第二个方面，提供检测或者监测在怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从所述妇女的生物样品获得DNA，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)用亚硫酸氢盐处理步骤(a)的DNA；和(c)利用步骤(b)的DNA和两条引物进行扩增反应来扩增包含CpG的基因组序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自：CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)、类Fem1A(秀丽线虫)、CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)、染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；和其中两条引物中的至少一条与胎儿基因组序列差别结合；和(d)将从步骤(c)扩增的基因组序列的部分的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)，例如甲基化特异性PCR。在其他实施方式中，扩增反应是基于核酸序列的扩增、链置换反应或者分枝DNA扩增反应。该方法以及本发明第一个方面描述的方法，适合于检测或者监测状态，所述状态诸如先兆子痫、早产、妊娠剧吐症、异位妊娠、染色体非整倍性(例如，21三体)和宫内发育迟缓。在本发明的第三个方面，提供检测和监测妊娠相关病症的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从所述妇女的生物样品获得DNA，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)用差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理步骤(a)的DNA；(c)确定来自步骤(b)的包含CpG的基因组序列的核苷酸序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自：CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)、类Fem1A(秀丽线虫)、CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)、染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；和(d)将来自步骤(c)的核苷酸序列的模式与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的模式变化提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，所述试剂包括亚硫酸氢盐；或者所述试剂可以包括一种或者多种优选切割甲基化DNA的酶；或者所述试剂可以包括一种或者多种优选切割非甲基化DNA的酶。在一些实施方式中，所述方法还可以包括利用步骤(b)的DNA和两条引物扩增基因组序列的扩增步骤。例如，所述扩增步骤可以通过PCR进行，所述PCR例如甲基化特异性PCR。在一些实施方式中，通过质谱分析法进行步骤(c)。在其他实施方式中，通过引物延伸进行步骤(c)。其他可以进行步骤(c)的方法包括多核苷酸杂交、实时PCR和电泳。在本发明的第四个方面，提供检测孕妇所怀胎儿21三体的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从所述妇女获得生物样品，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)用差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理步骤(a)的样品；(c)分析包含CpG的基因组序列的等位基因，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自：CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)、类Fem1A(秀丽线虫)、CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)、染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；和(d)确定所述等位基因的比例，其中与怀有无21三体的胎儿的妇女的等位基因比例的偏差提示胎儿具有21三体。在一些实施方式中，所述试剂包括亚硫酸氢盐。在其他实施方式中，所述试剂包括一种或者多种优选切割甲基化DNA的酶。可选择地，所述试剂可以包括一种或者多种优选切割非甲基化DNA的酶。在一些实施方式中，所述方法在步骤(b)后还包括扩增甲基化或者非甲基化基因组序列的扩增步骤。所述扩增步骤可以通过PCR进行，例如甲基化特异性PCR。存在多种可能来进行所要求方法的步骤(c)。例如，步骤可以通过质谱分析、引物延伸分析、实时PCR、多核苷酸杂交或者电泳来进行。在该方法的一些实施方式中，胎儿染色体21上基因组序列的两个不同等位基因包括单核苷酸多态性、插入-缺失多态性或者简单串联重复多态性。在本发明的第五个方面，提供检测或者监测怀有胎儿的妇女中妊娠相关病症的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从所述妇女获得生物样品，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)确定样品中包含CpG的基因组序列的水平，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个非甲基化胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)和类Fem1A(秀丽线虫)；和(c)将所述基因组序列的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，步骤(b)包括用差别修饰甲基化和非甲基化胞嘧啶的试剂处理血液样品中存在的DNA。该试剂可以包括亚硫酸氢盐，或者可以包括一种或者多种优选切割包括甲基化胞嘧啶的DNA的酶，或者可以包括一种或者多种优选切割包括非甲基化胞嘧啶的DNA的酶。在一些实施方式中，步骤(b)包括扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)，尤其是甲基化特异性PCR。扩增反应还可以是基于核酸序列的扩增、链置换反应、分枝DNA扩增反应。在一些实施方式中，通过电泳或者多核苷酸杂交确定基因组DNA序列的水平。所述方法适合于检测或者监测许多妊娠相关病症，包括先兆子痫、早产、妊娠剧吐症、异位妊娠、21三体和宫内发育迟缓。在本发明的第六个方面，提供检测或者监测怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从所述妇女获得生物样品，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)确定样品中包含CpG的基因组序列的水平，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个甲基化胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)、染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；和(c)将所述基因组序列的水平与标准对照比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，步骤(b)包括用差别修饰甲基化和非甲基化胞嘧啶的试剂处理血液样品中存在的DNA。该试剂可以包括亚硫酸氢盐，或者可以包括一种或者多种优选切割包括甲基化胞嘧啶的DNA的酶，或者可以包括一种或者多种优选切割包括非甲基化胞嘧啶的DNA的酶。在一些实施方式中，步骤(b)包括扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)，尤其是甲基化特异性PCR。扩增反应还可以是基于核酸序列的扩增、链置换反应、分枝DNA扩增反应。在一些实施方式中，通过电泳或者多核苷酸杂交确定基因组DNA序列的水平。所述方法适合于检测或者监测许多妊娠相关病症，包括先兆子痫、早产、妊娠剧吐症、异位妊娠、21三体和宫内发育迟缓。在如上所述的全部方面内实施本发明时，在一些情况下CpG岛可以用作包含CpG的基因组序列，而在其它情况下包含CpG的基因组序列可以不是CpG岛。在所有的方面，本发明的方法可以被进行而无需任何实施于妇女的步骤。在这些实施方式中，本发明的方法省略从妇女获得生物样品的步骤，并且从对样品进行的第一所述步骤开始。本申请所有其他公开的内容都同等地应用于这些实施方式，除了上下文另外明确要求的。因此，该实施方式第一个方面的方法变为：检测或者监测怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)确定来自妇女的生物样品中包含CpG的基因组序列的甲基化状态，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液，并且其中胎儿的基因组序列与妇女的基因组序列是差别甲基化的，从而区别样品中妇女的基因组序列和胎儿的基因组序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)、类Fem1A(秀丽线虫)、CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)和染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；(c)确定胎儿的基因组序列的水平；和(d)将所述胎儿基因组序列的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。类似地，该实施方式第二个方面的方法变为：检测或者监测怀有胎儿的妇女中妊娠相关病症的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)用亚硫酸氢盐处理来自妇女的生物样品的DNA，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(c)利用步骤(b)的DNA和两条引物进行扩增反应以扩增包含CpG的基因组序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)、类Fem1A(秀丽线虫)、CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)、染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；和其中两条引物中的至少一条与胎儿基因组序列差别结合；和(d)将步骤(c)扩增的基因组序列的部分的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。类似地，该实施方式第三个方面的方法变为：检测和监测妊娠相关病症的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)用差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理来自妇女的生物样品的DNA，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(c)确定步骤(b)的包含CpG的基因组序列的核苷酸序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)、类FemlA(秀丽线虫)、CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)、染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；和(d)将步骤(c)的核苷酸序列的模式与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的模式变化提示妊娠相关病症的存在或者进展。类似地，该实施方式第四个方面的方法变为：检测孕妇怀有的胎儿中21三体的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)用差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理来自妇女的生物样品，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(c)分析包含CpG的基因组序列的等位基因，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自：CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)、类Fem1A(秀丽线虫)、CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)、染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；和(d)确定所述等位基因的比例，其中与怀有无21三体的胎儿的妇女的等位基因比例的偏差提示胎儿具有21三体。类似地，该实施方式第五个方面的方法变为：检测或者监测怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)确定来自妇女的生物样品中包含CpG的基因组序列的水平，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个非甲基化胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)和类Fem1A(秀丽线虫)；和(c)将所述基因组序列的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。类似地，该实施方式第六个方面的方法变为：检测或者监测怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法，包括以下步骤：(a)[省略]；(b)确定来自妇女的生物样品中包含CpG的基因组序列的水平，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个甲基化胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自：CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)、染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；和(c)将所述基因组序列的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。附图简述图1.配对胎盘组织和母体血细胞中CGI137(A).A区和(B).B区的克隆和亚硫酸氢盐测序。在第一排对各个CpG位点编号，相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编(HumanMay2004(hg17)assemblyoftheUCSCGenomeBrowser)的chr21:46,249,636(+1)定义其核苷酸位置。后面每排显示通过克隆分离的单个DNA分子中CpG位点的甲基化状态。实心环和空心环分别代表甲基化和非甲基化的CpG位点。来自胎盘组织样品的克隆用前缀“PLN”标记，而来自母体血细胞的克隆用前缀“MBN”标记。通过“PLN”或者“MBN”后相同的样品编号表示来自相同怀孕个体的胎盘和母体血细胞。图2.针对CGI137(A).A区和(B).B区内被研究的各个CpG位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在X轴，各个CpG位点用它们相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:46,249,636(+1)的核苷酸位置命名。图3.针对妊娠末三个月和妊娠头三个月A区(A和B)、B区(C和D)和C区(E)的PDE9A内各个被研究CpG位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。对于图3A和图3B的X轴，各个CpG位点用它们相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:42,978,424(+1)反链的核苷酸位置命名；以及图3C和图3D，相对于chr21:42,978,718(+1)的正链；图3E，相对于chr21:42,978,005(+1)的正链。图4.针对(A).妊娠末三个月和(B).妊娠头三个月的PPP1R2P2A区内，以及(C).妊娠末三个月的PPP1R2P2B区内各个被研究CpG位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在X轴，各个CpG位点用它们相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:36,180,493(+1)的核苷酸位置命名。图5.针对类Fem1A(秀丽线虫)(A).A区和(B).B区内各个被研究的CpG位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在X轴，各个CpG位点用它们相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:14,056,070(+1)的核苷酸位置命名。图6.针对CGI009内各个被研究的CpG位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在X轴，各个CpG位点用它们相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:25,855,701(+1)的核苷酸位置命名。图7.针对羰基还原酶1内各个被研究的CpG位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在X轴，各个CpG位点用它们相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:36,363,538(+1)的核苷酸位置命名。图8.针对唐氏综合症细胞粘附分子内各个被研究的CpG位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在X轴，各个CpG位点用它们相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:41,139,872(+1)的核苷酸位置命名。图9.针对C21orf29内各个被研究的CpG位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在X轴，各个CpG位点用它们相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:44,953,288(+1)的核苷酸位置命名。图10.配对胎盘组织和母体血细胞中CGI111的克隆和亚硫酸氢盐测序。在第一排对各个CpG位点编号，相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:44,699,072(+1)定义其核苷酸位置。后面每排显示通过克隆分离的单个DNA分子中CpG位点的甲基化状态。实心环和空心环分别代表甲基化和非甲基化的CpG位点。来自胎盘组织样品的克隆用前缀“PLN”标记，而来自母体血细胞的克隆用前缀“MBN”标记。通过“PLN”或者“MBN”后相同的样品编号表示来自相同怀孕个体的胎盘和母体血细胞。图11.针对CGI121内各个被研究的CpG位点，胎盘和母体血细胞样品所有被测序的克隆中甲基化指数的箱线图。在X轴，各个CpG位点用它们相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:45,262,112(+1)的核苷酸位置命名。图12.针对CGI137非甲基化形式的同质MassEXTEND(homogeneousMassEXTEND)分析的图示。显示跨越扩增区的核苷酸序列。在亚硫酸氢盐转变的序列(SEQIDNO:2)上比对原始DNA序列(SEQIDNO:1)。CpG位点用“++”符号表示。另外对CpG位点进行了编号，该编号对应于图1A和图2A和表2A中的编号。不是CpG二核苷酸部分的胞嘧啶残基用“:”符号表示。显示的亚硫酸氢盐转变的序列基于全部CpG位点都是甲基化的这个假设。在亚硫酸氢盐转变的序列下面显示正向、延伸和反向引物(SEQIDNOS:3-5)的比对。图13.针对CGI137非甲基化形式的同质MassEXTEND分析的质谱仪描记。纯胎盘DNA、母体血沉棕黄层DNA、95:5(母体血沉棕黄层DNA:胎盘DNA)混合物、分娩前和分娩后的母体血浆以及无模板对照(NTC)的结果被显示。对于所有的质谱，X轴显示被检测延伸产物(显示为锐峰)的分子量，而Y轴显示任意单位(arbitraryunits)的强度。非甲基化分子的预期位置如标记所示。图14.(A).羧化全酶合成酶A区、(B).B1区和(C).B2区的组合亚硫酸氢盐限制性分析(CombinedBisulfiteRestrictionAnalysis,COBRA)分析。分析了两个21三体胎盘，两个妊娠头三个月正常胎盘，两个妊娠末三个月正常胎盘和两个妊娠头三个月母体血细胞(血沉棕黄层)。PCR产物经过(+)或者不经过(-)BstUI酶消化。通过更小的消化产物的出现来检测DNA甲基化。在凝胶电泳中使用1kbladder(InvitrogenCarlsbad,CA)(M)。图15.CGI009的COBRA分析。分析了两个21三体胎盘，两个妊娠头三个月正常胎盘，两个妊娠末三个月正常胎盘和两个妊娠头三个月母体血细胞(血沉棕黄层)。PCR产物经过(+)或者不经过(-)BstUI酶消化。通过更小的消化产物的出现来检测DNA甲基化。在凝胶电泳中使用1kbladder(InvitrogenCarlsbad,CA)(M)。图16.CGI132的COBRA分析。分析了两个21三体胎盘，两个妊娠头三个月正常胎盘，两个妊娠末三个月正常胎盘和两个妊娠头三个月母体血细胞(血沉棕黄层)。PCR产物经过(+)或者不经过(-)BstUI酶消化。通过更小的消化产物的出现来检测DNA甲基化。在凝胶电泳中使用1kbladder(InvitrogenCarlsbad,CA)(M)。图17.胎盘组织和母体血细胞中HLCSB2区的克隆和亚硫酸氢盐测序。在第一排对各个CpG位点编号，相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编的chr21:37,274,682-37,275,036的反链定义其核苷酸位置。后面每排显示通过克隆分离的单个DNA分子中CpG位点的甲基化状态。实心环和空心环分别代表甲基化和非甲基化的CpG位点。来自21三体、正常妊娠头三个月和正常妊娠末三个月胎盘组织样品的克隆分别用前缀“T21PLN”、“正常PLN妊娠头三个月”和“正常PLN妊娠末三个月”标记，而来自母体血细胞的克隆用前缀“血沉棕黄层”标记。通过前缀后的样品编号表示来自不同怀孕个体的胎盘和母体血细胞。图18.胎盘组织和母体血沉棕黄层中HLCSDNA的定量。甲基化指数被定义为限制性酶切后的HLCSDNA浓度与相同样品的模拟消化对照中测定的总浓度的比值。来自胎盘组织的DNA被标记为“正常PLN”，而来自母体血沉棕黄层的DNA被标记为“MBC”。图19.妊娠末三个月母体血浆中的胎儿特异性HLCS检测。在经过(图19A)或者不经过(图19B)甲基化敏感的限制性酶处理的母体血浆样品中检测到HLCS信号。分娩前血浆样品被标记为“前”，而分娩后血浆样品被标记为“后”。在消化反应中使用限制性酶HpaII和BstUI，在图中标记为“(+)”。不经过酶处理的模拟消化被标记为“(-)”。定义本申请使用的术语“妊娠相关病症”是指可能影响孕妇、该孕妇所怀的胎儿或者孕妇和胎儿两者的任何状态或者疾病。这种状态或者疾病可能在有限的时间段显示其症状，例如在妊娠或者分娩期间，或者可能在胎儿出生后持续其一生。妊娠相关病症的一些实例包括异位妊娠、先兆子痫、早产和胎儿染色体异常例如21三体。本文使用的“包含CpG的基因组序列”是指位于个体(例如人类胎儿或者孕妇)基因组确定位置的DNA序列的片段。通常，“包含CpG的基因组序列”至少长15个核苷酸，并且包含至少一个胞嘧啶。优选地，它的长度可以至少为30、50、80、100、150、200、250或者300个核苷酸，并且包含至少2、5、10、15、20、25或者30个胞嘧啶。对于给定位置的任一“包含CpG的基因组序列”，例如，在围绕染色体21上给定遗传位点(例如CpG岛CGI137，PDE9A，CGI009，等等)的区域内，个体与个体之间，甚至是相同个体的等位基因与等位基因之间可能存在核苷酸序列变化。通常，这种围绕确定遗传位点(例如，CpG岛)的区域包含所述位点以及上游和/或下游序列。每个上游或者下游序列(分别从遗传位点的5＇或者3'边界开始计算)的长度可以达到10kb，在其它情况下可以达到5kb、2kb、1kb、500bp、200bp或者100bp。此外，“包含CpG的基因组序列”可以包括转录为蛋白产物或并不转录为蛋白产物的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列可以是蛋白-编码序列、非蛋白-编码序列(例如转录启动子)或者其组合。本申请的“CpG岛”描述了在基因组中发现的DNA序列的片段，其具有最短的长度、最低的GC含量以及观察到的CpG频率/预期CpG频率(OCF/ECF)的最低比例。Yamada等(GenomeResearch14:247-266,2004)描述了确定CpG岛的一组标准：其长度必须至少是400个核苷酸，GC含量必须大于50%，并且OCF/ECF比例必须大于0.6。其他人(Takaietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:3740-3745,2002)对CpG岛的定义没有这么严格：序列长度至少为200个核苷酸，GC含量大于50%，并且OCF/ECF比例大于0.6。本申请使用的染色体21上“CpG岛”的概念符合任意现有计算程序提供的CpG岛模式，所述程序设计用于根据上文描述的标准扫描染色体，其包括在筛选过程中当利用100、200或者300个核苷酸的窗口大小或者1、2或者3个核苷酸的迁移或者步进大小(stepsizes)时获得的结果。如本说明书的表1所示，本公开中命名的各个CpG岛还通过它们在GenBank中对应的基因组重叠群(contig)登录号、版本和区域，相对于UCSC基因组浏览器人类2004年5月(hg17)汇编(genome.ucsc.edu)的染色体21序列的染色体位置，以及它们在给定条件下被PCR引物扩增的能力进行限定。本文使用的术语“表观遗传状态”是指除了一级核苷酸序列以外的核酸(例如，DNA或者RNA)分子水平的任何结构特征。例如，基因组DNA的表观遗传状态可以包括其二级或者三级结构，所述结构由例如其甲基化模式或者其与细胞蛋白的结合来决定或者受到它们的影响。当本申请使用术语“甲基化模式”或者“甲基化状态”来描述基因组序列的甲基化状态时，是指位于与甲基化相关的特定基因组位点的DNA片段的特征。这种特征包括，但不限于，该DNA序列内的任意胞嘧啶(C)残基是否是甲基化的，甲基化C残基的位置，任意特定残基序列中的甲基化C百分比，以及甲基化的等位基因差异，所述差异归因于诸如等位基因来源的差异。术语“甲基化模式”或者“甲基化状态”还指生物样品中任何特定残基序列的甲基化C或者非甲基化C的相对或者绝对浓度。本文使用的术语“单核苷酸多态性”或者“SNP”是指在相同基因组序列的不同等位基因内，存在于单核苷酸残基的多核苷酸序列变化。如果基因组序列在蛋白生成期间被转录，则该变化可以发生在基因组序列的编码区域或者非编码区域(即，启动子区域)内。检测一个或者多个SNP可以区别单个基因组序列的不同等位基因。本文使用的术语“血液”是指从孕妇或者检测妊娠可能性的妇女获得的血液样品或者制品。该术语包括全血或者血液的任何组分，例如常规定义的血清和血浆。本文使用的术语“亚硫酸氢盐”包括所有类型的亚硫酸氢盐，例如亚硫酸氢钠，其能够将胞嘧啶(C)化学转化成尿嘧啶(U)而不化学修饰甲基化胞嘧啶，因此可基于DNA的甲基化状态差别修饰DNA序列。本文使用的“差别修饰”甲基化或者非甲基化DNA的试剂包括，修饰甲基化和/或非甲基化DNA，且通过该过程从甲基化和非甲基化的DNA产生可区别产物，从而允许鉴定DNA甲基化状态的任何试剂。这类过程可以包括，但不限于，化学反应(例如通过亚硫酸氢盐的C→U转变)和酶处理(例如甲基化依赖的核酸内切酶切割)。因此，优选切割或者消化甲基化DNA的酶是当DNA是甲基化的时候以高很多的效率切割或者消化DNA分子的酶，但是当DNA不是甲基化的时候，优选切割或者消化非甲基化DNA的酶显示显著更高的效率。术语“核酸”或者“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)以及其单链或者双链形成的聚合物。除非具体限定，该术语包括了包含天然核苷酸已知类似物的核酸，所述类似物与参照核酸具有类似的结合性质，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式进行代谢。除非另外指出，特定核酸序列还提示性地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)，等位基因，同源基因，单核苷酸多态性(SNPs)，和互补序列，以及明确指出的序列。具体来说，简并密码子取代可以通过产生序列实现，该序列中一个或者多个挑选的(或者全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzeretal.,NucleicAcidRes.19:5081(1991);Ohtsukaetal.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);和Rossolinietal.,Mol.CellProbes8:91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。术语“基因”表示参与产生多肽链的DNA片段；它包括编码区前后参与基因产物的转录/翻译和转录/翻译调节的区域(前导区(leader)和尾区(trailer))，以及各个编码片段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。在本申请中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可以互换使用以指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或者多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物，所述术语还适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文使用的所述术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即，抗原)，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其功能类似于天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及之后被修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。本文的氨基酸可以用公知的3字母符号或者1字母符号表示，其由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐。同样地，核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码表示。当在本申请中使用时，“增加”或者“减少”是指数量相对于建立的标准对照的可检测的阳性或者阴性变化。增加是阳性变化，优选是对照值的至少10%，更优选50%，仍然更优选2倍，甚至更优选至少5倍，和最优选至少10倍。类似地，减少是阴性变化，优选是对照的至少10%，更优选50%，仍然更优选至少80%，和最优选至少90%。在本申请中按照如上所述的相同方式使用表示数量相对于比较基准的变化或者差异的其他术语，例如“更多”或者“更少”。本文使用的“多核苷酸杂交方法”指依据多核苷酸形成Watson-Crick碱基配对的能力，在合适的杂交条件下，利用已知序列的多核苷酸探针来检测多核苷酸存在和/或数量的方法。这种杂交方法的实例包括Southern印记和Northern印记。本文使用的“引物”是指可在扩增方法(例如聚合酶链式反应(PCR))中使用的寡核苷酸，基于对应于特定基因组序列的多核苷酸序列来扩增核苷酸序列，例如，位于染色体21上的CpG岛CGI137、PDE9A或者CGI009内的所述特定基因组序列，其处于各种甲基化状态。用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于所述序列是序列特异性的。本文使用的“标准对照”是指样品，它包括适用于本发明方法的预定数量或者甲基化模式(其可以包括与甲基化有关的多个不同和可分辨特征)的基因组序列，以便比较特定基因组序列的数量或者甲基化状态，例如位于染色体21上的CpG岛CGI137、PDE9A或者CGI009内的所述特定基因组序列，其存在于测试样品中。作为标准对照的样品提供目的基因的平均数量或者甲基化模式，其在怀有正常胎儿的平均且健康孕妇的血液中对于妊娠期间确定时间(例如，妊娠头三个月)来说是典型的，所述两者均没有患任何妊娠相关病症或者并发症的风险。在描述孕妇的情况下，术语“平均”是指所述妇女没有患至少一种相关状态，例如怀有染色体异常的胎儿，或者患有妊娠相关状态(例如，异位妊娠、先兆子痫或者早产)。当用于其他情况时，术语“平均”是指某些特征，例如在所述妇女血液中发现的母体和胎儿来源的特定基因组序列(例如，位于染色体21上CpG岛CGI137、PDE9A或者CGI009内)的甲基化模式，其代表怀有染色体正常胎儿并且对任何妊娠相关疾病或者状态不易感的健康妇女的随机挑选组。该挑选组应该包括足够数量的妇女，这样的话这些妇女中目的基因组序列的平均数量或者甲基化模式合理地准确反映了怀有健康胎儿的一般健康孕妇人群中的相应模式。此外，挑选组的妇女通常与被检验血液以指示潜在妊娠相关病症的妇女具有类似的孕龄。实施本发明的优选孕龄可以根据被筛查的病症而改变。例如，优选在妊娠中三个月筛查孕妇先兆子痫风险，而优选尽早筛查和诊断胎儿的染色体非整倍性。此外，用于测试的优选孕龄还可以取决于被测的目的基因。本文使用的术语“先兆子痫”指在妊娠过程中发生的疾病状态，其主要症状为多种形式的高血压并常伴有尿蛋白和水肿(肿胀)。先兆子痫有时称为妊娠毒血症，它与称为“惊厥”的更严重的病症有关，其为先兆子痫结合痉挛。尽管这些状态在出生后可立即发展或在妊娠20周之前发展，但是这些状态通常在妊娠的后半程(20周后)发展。本文使用的术语“早产”或“提前分娩”指在约40周的完全妊娠期届满前3周以上发生分娩的状态，如果不治疗常导致早产。术语“妊娠剧吐症”是指妊娠期间，尤其在妊娠头三个月强烈、持久的恶心和呕吐。恶心和呕吐可以导致脱水，并妨碍了妊娠必需的体重增加。“异位妊娠”是指异常妊娠，其中受精卵被植入到子宫的外面。尽管在异位妊娠的大多数情况下卵子迁入输卵管，但该术语还包括受精卵被植入妇女卵巢、腹部或者子宫颈的异常妊娠。发明详述I.引言1997年首次报道了胎儿DNA在母体血浆中的存在，这提供了仅通过分析母体血液样品而进行非侵入性产前诊断的可能(Loetal.,Lancet350:485-487,1997)。迄今为止，已经发展出许多潜在的临床应用。尤其是，已经发现母体血浆中胎儿DNA浓度的数量异常与许多妊娠相关病症有关，包括先兆子痫、早产、产前出血、侵入性胎盘形成(invasiveplacentation)、胎儿唐氏综合症和其他胎儿染色体非整倍性。因此，母体血浆的胎儿DNA分析可以作为监测胎儿母体健康的潜在标志物。但是，胎儿DNA与背景母体DNA在母体血浆中共存。因此，大部分报道的应用都依赖于Y染色体序列的检测，因为这些Y染色体序列可以方便地与母体DNA区分。这种方法使现有分析的适用范围局限于全部妊娠的仅50%，即怀有男性胎儿的那些。因此，非常需要开发用于母体血浆检测的不依赖于性别的胎儿DNA标志物。先前已经证明了可以根据甲基化状态的差异区别胎儿和母体DNA(美国专利申请公开号20030044388)。甲基化是表观遗传现象，是指改变表型但不涉及DNA序列改变的过程。通过利用展示基因组印记的位点H19的父系和母系遗传等位基因的DNA甲基化状态差异(差别甲基化，因此造成单基因两个等位基因的差别表达，其与特定等位基因的亲本来源有关)，本发明人之一(Y.M.D.Lo)和他的团队第一次证明了利用表观遗传标志物从母体血浆检测胎儿来源的母系遗传DNA序列的可行性(Poonetal.,Clin.Chem.48:35-41,2002)。Landes等还提出了表观遗传标志物用于非侵入性产前诊断的用途(美国专利申请公开号20030211522)。本发明人最近证明了在母体血浆中可以检测到胎盘来源的RNA(Ngetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:4748-4753,2003)。另一方面，已经表明正常个体的血浆DNA主要来自造血细胞(Luietal.,Clin.Chem.48:421-427,2002)。因此，有如下假设：母体DNA的主要来源是外周血细胞，而胎盘是释放入母体血浆的胎儿DNA的可能来源。因此，开发用于母体血浆检测的通用胎儿特异性DNA标志物的一个策略是鉴定在胎盘和母体外周血细胞之间差别甲基化的基因。本发明人第一次证明，位于染色体21上特定基因组位点的许多基因组序列在来自胎儿(例如，来自胎盘)的胎儿DNA和来自母体外周血细胞的母体DNA之间是差别甲基化的。因此该发现提供区别胎儿和母体基因组DNA的新方法，以及用于非侵入性产前诊断的新方法。II.一般方法利用分子生物学领域的常规技术进行本发明。公开本发明所用一般方法的基础性文章包括Sambrook和Russell,MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)(3rded.2001);Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(分子转移与表达：实验室手册)(1990)和CurrentProtocolsinMolecularBiology(最新分子生物学实验方法)(Ausubeletal.,eds.,1994)。对于核酸，大小单位是千碱基(kb)或者碱基对(bp)。这根据琼脂糖或者丙烯酰胺凝胶电泳、被测序的核酸或者公开的DNA序列来估算。对...