技术领域本发明涉及一种漂洗液，特别是涉及一种用于核酸提取纯化的漂洗液。
背景技术：
核酸是生命的最基本物质之一，包含脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，广泛存在于动植物细胞、细菌、病毒等一切生命体内，起着储存和传递遗传信息的作用。随着以核酸为检测对象的分子诊断技术的发展，核酸检测已经广泛应用于临床检验、出入境检验检疫、法医物证等领域。核酸检测的关键环节之一，即从各种生物样品中提取和纯化核酸，核酸提取效率和纯度对下游的核酸检测能否成功起至关重要的作用。核酸的提取纯化主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。核酸提取纯化的方法经历了一段时间发展，已经逐渐从传统的采用酚/氯仿等有机溶剂进行手工抽提法发展为采用硅胶膜吸附的离心柱法，以及采用磁珠法进行全自动核酸提取纯化的方法。磁珠法核酸提取纯化方法通常以纳米硅基磁珠为载体，通过磁珠在高盐溶液中吸附核酸而在低盐溶液中核酸从磁珠表面解吸附的原理进行核酸提取纯化。由于纳米磁珠具有大比表面积，选择性吸附核酸，超顺磁性，快速磁响应以及物化性质稳定等特点，使其非常适用于自动化。全球著名的生物技术公司，如Roche、Qiagen、Thermo、Chemagen等公司均有基于磁珠法原理的核酸提取试剂和全自动提取纯化系统在售。磁珠法核酸提取纯化的方法一般包括细胞裂解释放核酸与磁珠吸附核酸、漂洗吸附有核酸的磁珠、将核酸从磁珠上洗脱下来的几个主要步骤。根据现有公开文献资料可知，目前细胞裂解的方法一般根据样本类型的不同，可采用机械作用，化学作用以及酶处理等方式。机械作用，即包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法；化学作用，即在一定的pH环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40、CTAB等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍)而获得。而pH环境则由加入的强碱(NaOH)或缓冲液(TE、STE等)提供。在一定的pH环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂(EDTA等)可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+、Ca2+，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解；酶作用主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶以使细胞破裂，核酸释放，如在裂解液中加入蛋白酶可以降解蛋白质，灭活核酸酶(DNase和RNase)，加入DNase或RNase也用于去除不需要的核酸。对于磁珠吸附核酸，根据现有已知公开文献可知，在高盐溶液中，核酸吸附至纳米硅基磁珠表面，离液盐碘化钠或高氯酸钠可促进核酸与硅基磁珠的结合。中国专利《一种增强的磁珠法核酸提取方法》(专利号：201110124322.3)介绍了一种含有异丙醇的裂解与结合液，其中异丙醇起增强磁珠吸附核酸的作用。对于磁珠的漂洗，其目的是洗去磁珠上非特异结合的蛋白质和脂类等杂质，而尽量减少吸附在磁珠表面的核酸的损失，从而使后续从磁珠表面洗脱下来的核酸纯度更高。目前市售的磁珠法核酸提取试剂，多采用含有乙醇或异丙醇的漂洗液进行漂洗1～2次，不同公司试剂的配方可能有所不同，但基本含有乙醇和异丙醇等成分，尤其在进行洗脱前的一个步骤往往采用60％～75％乙醇或异丙醇进行漂洗。可参见下列中国专利申请和专利的描述：《基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒》(申请号：201410062784.0)，《一种增强的磁珠法核酸提取方法》(专利号：201110124322.3)；《一种提取纯化DNA的方法》(专利号：200910090336.0)；《磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒及其提取方法》(专利：201110204053.1)等。由于已知乙醇和异丙醇的残留对后续分子生物学反应(如PCR，酶切等)有显著抑制作用，所以，在采用乙醇或异丙醇为主要组分的漂洗液对磁珠进行漂洗后，需要对磁珠进行“晾干”处理2～15分钟，使磁珠表面的乙醇或异丙醇充分挥发。由于晾干过程增加了磁珠的暴露时间，可能会影响提取的核酸的稳定性，另外，一些市售的自动化提取仪为了加快乙醇或异丙醇的挥发，设置带加热功能的风扇，使磁珠周围空气加速流通，这增加了提取的核酸产物形成气溶胶并产生样本间交叉污染的风险。对于核酸从磁珠上洗脱，一般采用不含或者含有很低浓度盐分的缓冲液，例如TE(pH8.0)或者Tris-HCl(pH8.0)等，也有直接采用纯水作为洗脱液的试剂盒。为了提高洗脱效率，往往采用加热洗脱方式，一般加热至50～60℃洗脱效果为佳。洗脱的核酸提取纯化产物可直接用于后续分子生物学实验分析，如PCR、RT-PCR、酶切、测序等。如果提取产物不立即使用，应置于-20℃条件下储存，长期保存应置于-70℃条件下。然而，为了减少样本核酸提取纯化过程中交叉污染的机会、省去提取过程中的“晾干”步骤、减少核酸提取纯化的时间以及提高核酸提取纯化的效率等，还需要对用于核酸提取纯化的漂洗液进行进一步研究的必要。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种用于核酸提取纯化的漂洗液。该漂洗液不含乙醇或者异丙醇，因而是一种在核酸提取纯化中无需进行“晾干”处理步骤的漂洗液。因而，使用本发明的漂洗液具有减少样本核酸提取纯化过程中交叉污染的机会、省去提取过程中的“晾干”步骤、减少核酸提取纯化的时间以及提高核酸提取纯化的效率等优点，而且对于该漂洗液，其制备方法简单和易于操作。为解决上述技术问题，本发明的用于核酸提取纯化的漂洗液，其包含：缓冲试剂、聚乙二醇以及盐。所述漂洗液的pH优选为6.0～7.0。所述缓冲试剂包括：HEPES缓冲液或Tris-HCl缓冲液。优选地，所述HEPES缓冲液是10mM～200mM的HEPES缓冲液，其pH为6.0～7.0；Tris-HCl缓冲液是10mM～200mM的Tris-HCl缓冲液，其pH为6.0～7.0。所述聚乙二醇是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合而成，聚乙二醇产品无毒、无刺激性，味微苦，具有良好的水溶性，并与许多有机物组份有良好的相溶性。在本发明中，优选分子量为6000或8000的聚乙二醇，且聚乙二醇在漂洗液中的浓度范围优选为5g/100mL～20g/100mL。所述盐优选为无机盐，包括：氯化钠或氯化钾。该无机盐在漂洗液中的浓度优选为0.1M～0.5M。本发明的漂洗液，是磁珠法核酸提取纯化试剂中的一个重要组成部分，它能与核酸提取纯化试剂中的其他试剂配合使用，以发挥核酸提取纯化的作用。因此，本发明还提供一种用于核酸提取纯化的试剂盒，其包括：(1)核酸的裂解与结合液，其包括：离液盐、强变性剂、去污剂以及增强磁珠吸附核酸能力的试剂等；其中，离液盐包括：0.5M～3.0M的氯化钠、高氯酸钠或碘化钠等；强变性剂包括：胍盐等；去污剂包括：SDS或Triton-X100等；增强磁珠吸附核酸能力的试剂包括：乙醇或异丙醇等。此处的裂解与结合液，如同背景技术中所述，其用于裂解生物样本中的组织、细胞、细菌、病毒等，并释放核酸，促进核酸与磁珠吸附。(2)预漂洗液，其含有上述离液盐、强变性剂、去污剂以及增强磁珠吸附核酸能力的试剂；本发明中，为了获得高纯度的核酸，一般采用多次漂洗吸附有核酸的磁珠的步骤，除本发明提供的漂洗液外，还可以采用该预漂洗液；(3)本发明的上述漂洗液；(4)洗脱液；对于洗脱液，目的是使结合在磁珠表面的核酸洗脱下来，一般为不含或者含有低浓度盐的缓冲液，如包括：TE缓冲液、Tris-HCl缓冲液或纯水。其中，该TE缓冲液可为含有10mMTris-HCl、1mMEDTA的pH8.0缓冲液(即10mMTris-HCl，1mMEDTA,pH8.0)，Tris-HCl缓冲液是含有10mMTris-HCl的pH8.0缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.0)。对于上述试剂盒，本发明的漂洗液，在本发明所述范围内，其组分的浓度可能会根据配合使用的裂解与结合液、预漂洗液以及洗脱液的不同而进行调整，从而使提取纯化试剂盒的整体性能达到最佳。经过测试，本发明的漂洗液，对于脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类核酸的提取纯化均有优异的表现。由于没有乙醇或异丙醇的存在，该漂洗液在提取纯化过程中无需“晾干”处理的步骤。由于省去了晾干步骤，减少了提取纯化的整体时间，也大大降低了样本间交叉污染的机会，消除了可能存在的乙醇或异丙醇残留对后续反应的抑制作用，提高了提取效率。另外，由于乙醇和异丙醇属于极易燃的危险化学品，在生产、运输以及使用过程中的风险非常大，而采用本发明提供的漂洗液，其内组分均为一般化学品，无安全风险隐患。再者，使用本发明的漂洗液能大大降低生产成本。附图说明下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：图1为HBV(乙型肝炎病毒)国际标准品(1000IU/ml)采用本发明漂洗液及无晾干步骤提取产物的扩增图，其中，S2～S8为HBV定量标准品，其浓度分别为S2：3.0+E2IU/ml；S4：3.0+E4IU/ml；S6：3.0+E6IU/ml；S8：3.0+E8IU/ml，下图2～5中的“S2～S8”的含义与图1相同；另外，图1中的1E3的含义即HBV理论浓度为1.0E+03IU/mL(1000IU/ml)，其他图的表示方法与此相同。图2为HBV国际标准品(100IU/ml)采用本发明漂洗液及无晾干步骤提取产物的扩增图，其中，图2中的“1E2”即指HBV国际标准品(100IU/ml)；图3为HBV国际标准品(50IU/ml)采用本发明漂洗液及无晾干步骤提取产物的扩增图；图4为HBV国际标准品(20IU/ml)采用本发明漂洗液及无晾干步骤提取产物的扩增图；图5为HBV国际标准品(10IU/ml)采用本发明漂洗液及无晾干步骤提取产物的扩增图；图6为HCV(丙型肝炎病毒)国际标准品(1000IU/ml)采用本发明漂洗液及无晾干步骤提取产物的扩增图，其中，S2～S8为HCV定量标准品，其浓度分别为S2：3.0+E2IU/ml；S4：3.0+E4IU/ml；S6：3.0+E6IU/ml；S8：3.0+E8IU/ml，下图7～10中的“S2～S8”的含义与图6相同；另外，图6中的“1E3”即指HCV(丙型肝炎病毒)国际标准品(1000IU/ml)；“NTC”是阴性对照；图7为HCV国际标准品(100IU/ml)采用本发明漂洗液及无晾干步骤提取产物的扩增图；另外，图7中的“1E2”即指HCV(丙型肝炎病毒)国际标准品(100IU/ml)；图7中的“NTC”是阴性对照；图8为HCV国际标准品(50IU/ml)采用本发明漂洗液及无晾干步骤提取产物的扩增图；其中，图8中的“NTC”是阴性对照；图9为HCV国际标准品(30IU/ml)采用本发明漂洗液及无晾干步骤提取产物的扩增图；其中，图9中的“NTC”是阴性对照；图10为HCV国际标准品(15IU/ml)采用本发明漂洗液及无晾干步骤提取产物的扩增图。其中，图10中的“NTC”是阴性对照。具体实施方式在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。实施例1.本发明所述的漂洗液在乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测中的应用本实施例中采用本发明提供的漂洗液代替市售HBV核酸定量试剂内的漂洗液，在核酸提取过程中省去漂洗液的晾干步骤，对HBV国际标准品进行定量检测，从检测结果的准确定和灵敏度两方面来判断本发明提供的漂洗液是否可行，具体研究材料如下：(1)上海浩源生物科技有限公司生产的《乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(荧光定量PCR法)》(医疗器械注册证号：国食药监械(准)字2013第3402077号)；该产品包含核酸提取试剂、HBV核酸扩增试剂和定量标准品及对照品，其中核酸提取试剂包含磁珠悬液、抽提液、洗液A(预漂洗液)、洗液B(漂洗液)和洗脱液；核酸扩增试剂包含荧光HBV反应液A和荧光HBV反应液B；定量标准品及对照品包含定量标准品S2～S8及阴阳性对照。(2)本发明提供的漂洗液：具体的，其配方为HEPES(20mM,pH6.5),PEG6000(13％，即13g/100ml),NaCl(0.3M)；(3)HBV核酸定量国际标准品NIBSC10/264(8.5E+05IU/mL,GenotypeA)，来自英国国家生物制品检定所(NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl，NIBSC)；(4)HBV阴性正常人血浆；(5)美国TBG公司的EZ-Beadsystem-32核酸提取仪；(6)上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪。具体研究方法：将HBV核酸定量国际标准品NIBSC10/264(8.5E+05IU/mL，GenotypeA)分别用HBV阴性的血浆和血清进行系列稀释，对1.0E+03IU/mL、1.0E+02IU/mL、5.0E+01IU/mL、2.0E+01IU/mL、1.0E+01IU/mL浓度的样本分别进行8次重复测定，准确度要求为定量值的对数值与标准品理论值的对数值相差不超过±0.45lg范围；灵敏度要求在最低检出限浓度均应全部检出。依据产品说明书操作，并将本发明提供的漂洗液替换试剂盒内的“洗液B”，将提取程序内晾干步骤删除，具体操作步骤如下：1.采用美国TBG公司的EZ-Beadsystem-32核酸提取仪进行稀释后的HBV定量标准品的提取：1.1将核酸提取试剂、对照品、定量标准品取出，平衡至室温并混匀。1.2在样本制备用96孔深孔反应盘中按下表1布局预分装试剂：表1.反应盘试剂分装布局表1.3取待测梯度稀释的HBV核酸定量标准品以及试剂盒中的阴性对照、弱阳性对照、强阳性对照、定量标准品S8～S2各200μl加入到预分装试剂的反应盘A2～H2或A8～H8孔中。每块反应盘可处理16个样本。每台仪器可同时放入2个反应盘处理32个样本。1.4将金属条对准反应盘的A6～H6及A12～H12列底部，并将反应盘及金属条固定于EZbeadSystem-32核酸提取仪上，按下表2程序执行，其中晾干步骤时间均设置为0，即删除了晾干步骤。表2EZbead核酸提取程序1.5待程序结束后，取下反应盘，吸取洗脱产物进行PCR扩增反应。2.采用上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪进行扩增2.1扩增总体系为60μl，其中荧光HBV反应液A和荧光HBV反应液B各为10μl，核酸提取产物40μl。PCR扩增反应管使用Axygen0.2ml平盖八联管，CatNo：管PCR-0208-C、盖PCR-2CP-RT-C。2.2扩增程序为下表，其中“★”处为荧光信号采集点，采集通道设置为FAM和ROX。3.数据分析见表3，HBV国际标准品定量检测数据及统计分析。从附图1～5及表3中可以看出，系列稀释的HBV国际标准品浓度从20IU/ml到1000IU/ml的检出率均达到100％(8/8)，扩增曲线呈典型的“S”型，且均符合定量值的对数值与标准品理论值的对数值相差不超过±0.45lg范围的要求。另外，特别有意义的是，在该HBV核酸定量试剂盒声称的最低检测下限20IU/ml之下，增加检测8例10IU/ml浓度值的标准品，其检出率亦能达到100％(8/8)，提示采用本发明的漂洗液显著提高了试剂的检测灵敏度。总之，上述实验提示采用本发明所述的漂洗液漂洗后不经过晾干步骤，而直接进入洗脱环节，其洗脱产物的扩增效率非常好，证明采用本发明提供的无需晾干处理步骤的漂洗液适用于该HBV核酸定量检测试剂盒，并表现出优异的分析性能。表3HBV国际标准品定量检测数据及统计分析注：表3中的HBV定量标准品浓度的单位为“IU/mL”；Ct是循环数；实测浓度的单位为“IU/mL”；NTC(NoneTemplateControl)为无模板对照，即阴性对照；Noct即无扩增，未检测到目的靶标。实施例2本发明所述的漂洗液在丙型肝炎病毒(HCV)核酸定量检测中的应用本实施例采用本发明提供的漂洗液代替市售HCV核酸定量试剂内的漂洗液，在核酸提取过程中省去漂洗液的晾干步骤对HCV国际标准品进行定量检测，从检测结果的准确定和灵敏度两方面来判断本发明提供的漂洗液是否可行，具体研究材料如下：(1)上海浩源生物科技有限公司生产的《丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(荧光定量PCR法)》(医疗器械注册证号：国食药监械(准)字2011第3400554号)；该产品包含核酸提取试剂、HCV核酸扩增试剂和定量标准品及对照品，其中核酸提取试剂包含磁珠悬液、抽提液、洗液A(预漂洗液)、洗液B(漂洗液)和洗脱液；核酸扩增试剂包含荧光HCV反应液A、荧光HCV反应液B及反应液C；定量标准品及对照品包含定量标准品S2～S8及阴阳性对照。(2)本发明提供的漂洗液：具体的，其配方为HEPES(20mM,pH6.5)，PEG6000(13％，即13g/100ml)，NaCl(0.3M)；(3)HCV核酸定量国际标准品NIBSC06/102(2.6E+05IU/mL,Genotype1a)，来自英国国家生物制品检定所(NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl，NIBSC)；(4)HCV阴性正常人血浆；(5)美国TBG公司的EZ-Beadsystem-32核酸提取仪；(6)上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪。具体研究方法：将HCV核酸定量国际标准品NIBSC06/102(2.6E+05IU/mL,Genotype1a)分别用HCV阴性的血浆和血清进行系列稀释，对1.0E+03IU/mL、1.0E+02IU/mL、5.0E+01IU/mL、3.0E+01IU/mL、1.5E+01IU/mL浓度的样本分别进行若干次重复测定，准确度要求为定量值的对数值与标准品理论值的对数值相差不超过±0.45lg范围；灵敏度要求在最低检出限浓度均应全部检出。依据产品说明书操作，并将本发明提供的漂洗液替换试剂盒内的“洗液B”，将提取程序内晾干步骤删除，具体操作步骤如下：1.核酸提取环节和实施例1相同。2.采用上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪进行扩增2.1扩增总体系为62μl，其中荧光HCV反应液A为10μl、荧光HCV反应液B为9μl，HCV反应液C为3μl，核酸提取产物40μl。PCR扩增反应管使用Axygen0.2ml平盖八联管，CatNo：管PCR-0208-C、盖PCR-2CP-RT-C。2.2扩增程序为下表，其中“★”处为荧光信号采集点，采集通道设置为FAM和HEX。3.数据分析表4HCV国际标准品定量检测数据及统计分析注：表4中的NTC(NoneTemplateControl)为无模板对照，即阴性对照；Noct即无扩增，未检测到目的靶标。从附图6～10及表4中可以看出，系列稀释的HCV国际标准品浓度从30IU/ml到1000IU/ml的检出率均达到100％，扩增曲线呈典型的“S”型，且均符合定量值的对数值与标准品理论值的对数值相差不超过±0.45lg范围的要求。另外，特别有意义的，在该HCV核酸定量试剂盒声称的最低检测下限50IU/ml之下，增加检测8例30IU/ml和8例15IU/ml浓度值的标准品，其中30IU/ml检出率亦能达到100％(8/8)，而15IU/ml检出率亦能达到87.5％(7/8)，提示采用本发明的漂洗液显著提高了试剂的检测灵敏度。总之，上述实验提示采用本发明所述的漂洗液漂洗后不经过晾干步骤，而直接进入洗脱环节，其洗脱产物的扩增效率非常好，证明采用本发明提供的无需晾干处理步骤的漂洗液适用于该HCV核酸定量检测试剂盒，并表现出优异的分析性能。总之，对于本发明的漂洗液，由于和目前常用的含有乙醇或者异丙醇的漂洗液不同，它不含有对后续反应有抑制作用的组分，所以在提取纯化步骤中无需晾干步骤，从而可以缩短提取时间，并且减少了晾干步骤样本间交叉污染的机会。另外，需要注意的是：上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。