技术领域本发明涉及氧化石墨烯复合材料的制备方法领域，特别是涉及一种具有高抗菌性能和载酶量的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜的制备方法。
背景技术：
抗菌性玻璃或是包装袋作为一种新型生态功能材料，可以被广泛用于医疗、食品安全和公共卫生等领域。现在常见的抗菌玻璃采用在玻璃的制造过程中添加离子化金属如锌、银铜等，或是在玻璃表面涂覆二氧化钛膜，通过二氧化钛的光催化作用起到抗菌作用。但这些杀菌剂仍然对人体具有一定的危害，且释放到环境中会造成二次污染。因此，亟需选择环境更加友好，对人体无害的防污剂。目前，研究较多的是选择蛋白质类的有机抗菌剂，其中，有报道表明，通过聚多巴胺膜层负载溶葡球菌酶，可以使基体表现出较为优异的抗菌性能。但仍然存在一定问题，如蛋白质的活性较短，稳定性较差，因而大大影响了其使用。因此，如何提高蛋白质类杀菌剂的负载量，并延长其抗菌的时间就成为研究热点之一。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的是提供一种负载量高，抗菌时间长的用于固定溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜的制备方法。本发明首先在玻璃等基体表面进行多巴胺的自聚合，从而在基体表面包覆一层完整的聚多巴胺膜层；再在聚多巴胺膜层上引入不完整的氧化石墨烯膜层，通过控制氧化石墨烯的浓度，调节浸泡过程中的温度，使得聚多巴胺膜层的部分区域覆有氧化石墨烯，其余部分区域聚多巴胺膜层仍暴露在外，同时在此过程中，氧化石墨烯的含氧官能团部分被聚多巴胺还原，形成部分还原氧化石墨烯膜层；最后在不完整的部分还原氧化石墨烯膜层上固定溶菌酶，制备出固定溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜。本发明所采用的氧化石墨烯是hummers法制备出的氧化石墨烯，由于其具有较大的比较面积、较多的含氧官能团，对溶菌酶具有较好的固定作用，且其本身具有良好的抗菌性能，通过聚多巴胺改性后的基体能够较好的固定氧化石墨烯。本发明中聚合后形成的聚多巴胺膜层其具有良好的粘附性能，因此可以对溶菌酶和氧化石墨烯进行良好的固定。包覆聚多巴胺/部分还原氧化石墨烯膜层的基体可以大幅度提升溶菌酶固定量，同时延长其抗菌时间。本发明包括如下步骤：（1）对玻璃表面进行多巴胺改性将多巴胺或其盐加入到碱性溶液中配制成多巴胺溶液，放入清洗好的基体，室温静置24小时，取出后超声清洗，氮气吹干，以在基体表面包覆一层或多层完整的聚多巴胺膜层；（2）不完整石墨烯衍生物膜层的制备将包覆聚多巴胺膜层的基体放入0.1～0.5mg/mL的氧化石墨烯溶液中，在25～80℃条件下浸泡3小时，形成部分聚多巴胺膜层覆盖有氧化石墨烯的不完整的氧化石墨烯膜层，取出后超声清洗，氮气吹干，由于氧化石墨烯部分被聚多巴胺还原，最后在聚多巴胺膜层上形成不完整的部分还原氧化石墨烯膜层；（3）抗菌蛋白质的固定将pH7.4的PBS溶液中加入抗菌蛋白质，0～4℃条件下搅拌半小时，放入包覆聚多巴胺和不完整的部分还原氧化石墨烯膜层的基体，在4℃条件下浸泡48小时，取出后用PBS冲洗，得到固定溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜。所述的碱性溶液为pH6.5～8.5的Tris溶液或碱性水溶液（如KOH,NaOH），浓度为0.1～0.5mg/mL。所述的抗菌蛋白质为动物溶菌酶、微生物溶菌酶或溶葡球菌酶等具有抗菌杀菌性能的蛋白质。所述动物溶菌酶优选鸡蛋清溶菌酶。所述的基体材质为玻璃、金属或塑料。与现有技术相比，本发明具有如下优点：（1）本发明将聚多巴胺膜层和不完整的氧化石墨烯膜层结合，制备的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜层，或通过层层组装后制备的复合膜本身具有一定的抗菌作用。（2）本发明采用鸡蛋白溶菌酶作为主要的抗菌剂之一，其具有良好的抗菌性能，同时对人体无害，是环境友好的无毒抗菌剂。（3）本发明通过插入不完整的氧化石墨烯膜层，使复合膜载酶量明显提高，抗菌性能有了显著提高，同时较现有的同类抗菌剂而言，抗菌时间也有显著提高。附图说明图1是氧化石墨烯（GO）（a），经聚多巴胺/还原氧化石墨烯（PDA/rGO）复合膜改性玻璃表面（b）和经聚多巴胺/还原氧化石墨烯-溶菌酶（PDA/rGO-cLY）复合膜改性的玻璃表面（c）的红外谱图。图2分别是PDA/rGO改性的玻璃表面（a），PDA/rGO改性的玻璃表面的局部放大（b）；PDA/rGO-cLY改性的玻璃表面（c）的扫描电镜照片。图3是经溶菌酶作用后致死的大肠杆菌（a）和经氧化石墨烯作用致死的大肠杆菌（b）扫描电镜照片。图4是培养液中含有经PDA-cLY修饰的玻璃和PDA/rGO-cLY修饰的玻璃的大肠杆菌18小时内与空白组分的生长趋势对比图（a），7小时内的生长趋势对比放大图（b）。图5是经PDA-cLY修饰的玻璃和经PDA/rGO-cLY修饰的玻璃在不同时间点杀菌率对比图。图6是经PDA-cLY改性的玻璃表面（a）和经PDA/rGO-cLY改性的玻璃表面（b）的荧光显微镜照片。图7是分别经0.1mg/mL氧化石墨烯溶液（a）、0.3mg/mL氧化石墨烯溶液（b）和0.5mg/mL氧化石墨烯溶液（c）在50℃条件下浸泡3小时后的PDA/rGO扫描电镜照片。图8是氧化石墨烯溶液为0.3mg/mL条件下，分别在25℃（a），50℃（b）和80℃浸泡3小时后的PDA/rGO扫描电镜照片。具体实施方式下面结合附图以及对比例对本发明的实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。对比例1：对玻璃表面进行PDA-cLY膜层修饰。反应原料是盐酸多巴胺、pH8.5的Tris溶液，鸡蛋白溶菌酶，pH7.4的PBS缓冲液。其中盐酸多巴胺购自于Sigma-Aldrich，鸡蛋白溶菌酶购自于Sigma-Aldrich，活性单位为～100000U/mg，分子量为14.3kDa的单链。（1）对玻璃表面进行多巴胺改性将多巴胺加入到pH8.5的Tris溶液中配制成2mg/mL，放入清洗好的载玻片，室温静置24小时，取出后超声清洗，氮气吹干。（2）抗菌蛋白质的固定将pH7.4的PBS溶液中加入鸡蛋白溶菌酶抗菌类蛋白质，0～4℃条件下搅拌半小时，放入经多巴胺处理过的玻璃片，在4℃条件下浸泡48小时，取出后用PBS冲洗。所制备的抗菌玻璃的抑菌测试如下：（1）菌悬液的配制将大肠杆菌（E.coli）的菌种接入到LB液体培养基中进行活化，将菌液在恒温震荡培养箱中37℃条件下震荡24小时。然后移取活化好的6μL菌种，使其分散在8mLLB液体培养基和PBS缓冲液1:1的溶液中，进行震荡摇匀，放入经过处理的抗菌玻璃，在震荡培养想中37℃条件下震荡培养。（2）定性抑菌测试将培养一段时间后的玻璃片取出后，将细菌固定，利用扫描电镜对其进行观察。（3）定量抑菌测试将培养1小时，3小时，5小时，7小时，13小时和18小时各时间点上的菌液取出，分别用生理盐水稀释后，利用平板计数进行观察统计，并利用杀菌率公式对数据进行统计。实施例1：以玻璃为基体进行PDA/rGO-cLY膜层修饰。反应原料是盐酸多巴胺、pH8.5的Tirs溶液，氧化石墨烯，鸡蛋白溶菌酶，pH7.4的PBS缓冲液。其中盐酸多巴胺购自于Sigma-Aldrich，鸡蛋白溶菌酶购自于Sigma-Aldrich，活性单位为～100000U/mg，分子量为14.3kDa的单链，氧化石墨烯用Hummers法（Marcano,D.C.;Kosynkin,D.V.;Berlin,J.M.;Sinitskii,A.;Sun,Z.;Slesarve,A.;Alemany,L.B.;Lu,W.;Tour,J.M.ImprovedSynthesisofGrapheneOxide.ACSNano2010,4,4806-4814.）制备。（1）对玻璃表面进行多巴胺改性将多巴胺加入到pH8.5的Tris溶液中配制成2mg/mL，放入清洗好的载玻片，室温静置24小时，取出后超声清洗，氮气吹干。（2）不完整石墨烯衍生物膜层的制备将pH8.5的Tris溶液加入到氧化石墨烯中，配制成0.3mg/mL氧化石墨烯溶液，调整pH至8.5，将经过多巴胺处理的玻璃片放入氧化石墨烯溶液中，在50℃条件下浸泡3小时，取出后超声清洗，氮气吹干。（3）抗菌蛋白质的固定将pH7.4的PBS溶液中加入鸡蛋白溶菌酶，0～4℃条件下搅拌半小时，放入经多巴胺和氧化石墨烯处理过的玻璃片，在4℃条件下浸泡48小时，取出后用PBS冲洗。所制备的材料通过红外测试，如图1，与单纯的氧化石墨烯相比，固定在经聚多巴胺修饰的玻璃基底上的不完整氧化石墨烯膜层在1731cm-1(C=O键)和1402cm-1(C-OH键)部分发生变化。这两个峰在PDA/rGO谱线上几乎消失，由此得出部分氧化石墨烯被聚多巴胺还原，确定最终产物为PDA/rGO。对于经PDA/rGO-cLY修饰的玻璃红外谱图，属于N-H伸缩振动的3100cm-1和2944cm-1位置峰几乎消失，表明鸡蛋白溶菌酶有部分与PDA/rGO发生和化学键结合。证明氧化石墨烯丰富的含氧官能团能够提供活性位点与溶菌酶发生化学作用，从而将溶菌酶牢固的固定在膜层表面。所制备的材料通过扫描电镜照片，如图2，可以看出对于PDA/rGO膜层而言，氧化石墨烯膜层覆盖在聚多巴胺膜层上面，并且膜层并不完整，呈部分覆盖在聚多巴胺膜层表面。氧化石墨烯膜层铺展较均匀，中间有部分褶皱。对于PDA/rGO-cLY膜层而言，鸡蛋白溶菌酶主要分布在褶皱部分和氧化石墨烯的边缘部分，在裸露的聚多巴胺膜层上也有少量分布。证明氧化石墨烯的大比表面积和丰富的含氧官能团能够有效的固定溶菌酶。所制备的抗菌玻璃的抑菌测试如下：（1）菌悬液的配制将大肠杆菌（E.coli）的菌种接入到LB液体培养基中进行活化，将菌液在恒温震荡培养箱中37℃条件下震荡24小时。然后移取活化好的6μL菌种，使其分散在8mLLB液体培养基和PBS缓冲液1:1的溶液中，进行震荡摇匀，放入经过处理的抗菌玻璃，在震荡培养想中37℃条件下震荡培养。（2）定性抑菌测试将培养一段时间后的玻璃片取出后，将细菌固定，利用扫描电镜对其观察，如图3。由于溶菌酶的杀菌机理是作用于细胞壁的肽聚糖，溶菌酶通过溶解细胞壁的主要成分体现其抑菌作用。由a图可以看出，细菌已经被完全溶解，只剩残渣。而氧化石墨烯主要通过物理的机械切割作用，由锋利的边缘将细胞截断，由b图可以看出，细菌的一段被直接切断。因此，可以看出，此PDA/rGO复合膜层本身具有一定的抗菌性能，且经溶菌酶固定后，并没有钝化氧化石墨烯的边缘，氧化石墨烯的抗菌作用仍然存在，而氧化石墨烯也没有致使溶菌酶失活，溶菌酶也可以起到的杀菌作用。（3）定量抑菌测试将培养1小时，3小时，5小时，7小时，13小时和18小时各时间点上的菌液取出，分别用生理盐水稀释后，利用平板计数进行观察统计，并利用杀菌率公式对数据进行统计。如图4。通过图a可以看出，在18小时培养时间内，经PDA/rGO-cLY修饰的玻璃抑菌性能最好，在培养的7小时内，细菌繁殖几乎不明显，在7至13小时内，有明显的细菌繁殖迹象，细菌生长速度较慢，在13小时以后有明显的升高，但至18小时时，仍有较高的杀菌率，结合图5，18小时时杀菌率仍达到90%以上。而经PDA-cLY修饰的玻璃在培养7小时以后发生明显变化，细菌生长速度明显升高，结合图5,杀菌率不到60%。为了更清楚的观察7小时内的细菌生长趋势，由图b可以看出，对于PDA-cLY修饰的玻璃和PDA/rGO-cLY修饰的玻璃，两组分都在5小时后发生了明显的杀菌能力下降的现象，但PDA-cLY组分更为明显，结合图5，也可以得到相应的结论。由此可以得到，加入不完整的氧化石墨烯膜层后，可以延长材料抑菌的抗菌时间。对比例2：对玻璃表面进行PDA-cLY膜层修饰。反应原料是盐酸多巴胺、pH8.5的Tirs溶液，鸡蛋白溶菌酶，pH7.4的PBS缓冲液。其中盐酸多巴胺购自于Sigma-Aldrich，鸡蛋白溶菌酶购自于Sigma-Aldrich，活性单位为～100000U/mg，分子量为14.3kDa的单链。异硫氰酸（FITC）荧光素购于Sigma-Aldrich。将溶菌酶用异硫氰酸（FITC）荧光素进行标记。配置pH为9的碳酸盐和氯化钠回合溶液100mL，加入1g溶菌酶，分散溶解并降温至4℃。向4℃溶菌酶溶液中加入10mgFITC，在冰水浴中避光磁力搅拌12小时，生成荧光标记蛋白FITC-cLY。配置过量的半饱和硫酸铵溶液，加入到上述反应产物中，将标记蛋白沉淀分离，出去未结合的荧光素。配置pH为7.2的磷酸盐缓冲液，在4℃下透析标记蛋白，出去多余的硫酸铵，至透析的溶液中检测不到铵离子和荧光素为止。将产物进行冷冻干燥后，避光保存在4℃条件下，待用。（1）对玻璃表面进行多巴胺改性将多巴胺加入到pH8.5的Tris溶液中配制成2mg/mL，放入清洗好的载玻片，室温静置24小时，取出后超声清洗，氮气吹干。（2）抗菌蛋白质的固定将pH7.4的PBS溶液中加入经标记后的鸡蛋白溶菌酶，0～4℃条件下搅拌半小时，放入经多巴胺处理过的玻璃片，在4℃条件下浸泡48小时，取出后用PBS冲洗，待用。利用荧光显微镜，在激发波长为490nm条件下，对其载酶量进行观察。实施例2：对玻璃表面进行PDA/rGO-cLY膜层修饰。反应原料是盐酸多巴胺、pH8.5的Tirs溶液，鸡蛋白溶菌酶，pH7.4的PBS缓冲液。其中盐酸多巴胺购自于Sigma-Aldrich，鸡蛋白溶菌酶购自于Sigma-Aldrich，活性单位为～100000U/mg，分子量为14.3kDa的单链。氧化石墨烯用Hummers法制备。异硫氰酸（FITC）荧光素购于Sigma-Aldrich。将溶菌酶用异硫氰酸（FITC）荧光素进行标记。配置pH为9的碳酸盐和氯化钠回合溶液100mL，加入1g溶菌酶，分散溶解并降温至4℃。向4℃溶菌酶溶液中加入10mgFITC，在冰水浴中避光磁力搅拌12小时，生成荧光标记蛋白FITC-cLY。配置过量的半饱和硫酸铵溶液，加入到上述反应产物中，将标记蛋白沉淀分离，出去未结合的荧光素。配置pH为7.2的磷酸盐缓冲液，在4℃下透析标记蛋白，出去多余的硫酸铵，至透析的溶液中检测不到铵离子和荧光素为止。将产物进行冷冻干燥后，避光保存在4℃条件下，待用。（1）对玻璃表面进行多巴胺改性将多巴胺加入到pH8.5的Tris溶液中配制成2mg/mL，放入清洗好的载玻片，室温静置24小时，取出后超声清洗，氮气吹干。（2）不完整石墨烯衍生物膜层的制备将pH8.5的Tris溶液加入到氧化石墨中，配制成0.3mg/mL的氧化石墨烯溶液，，调整pH至8.5，将经过多巴胺处理的玻璃片放入氧化石墨烯溶液中，在50℃条件下浸泡3小时，去出后超声清洗，氮气吹干。（3）抗菌蛋白质的固定将pH7.4的PBS溶液中加入经标记的鸡蛋白溶菌酶，0～4℃条件下搅拌半小时，放入经多巴胺和石墨烯衍生物处理过的玻璃片，在4℃条件下浸泡48小时，取出后用PBS冲洗，待用。利用荧光显微镜，在激发波长为490nm条件下，对其载酶量进行观察。标记的酶显示为黄绿色荧光，如图6。由图可以看出，图b中明显看出含有两种形式的荧光标记，其中较亮为经过静电作用固定的溶菌酶，而较暗的部分表明为通过共价键作用固定的溶菌酶。对于图a可以看出，对于PDA/rGO复合膜而言，其固载的形式更多，且负载酶的量更大。证明其rGO不完整膜层在复合膜层中起着十分重要的作用。实施例3-5：不同浓度条件下对玻璃表面进行PDA/rGO膜层的制备。反应原料是盐酸多巴胺、pH8.5的Tirs溶液，氧化石墨烯。其中盐酸多巴胺购自于Sigma-Aldrich，氧化石墨烯用Hummers法。（1）对玻璃表面进行多巴胺改性将多巴胺加入到pH8.5的Tris溶液中配制成2mg/mL，放入清洗好的载玻片，室温静置24小时，取出后超声清洗，氮气吹干。（2）不完整石墨烯衍生物膜层的制备将pH8.5的Tris溶液加入到氧化石墨烯中，分别配制成0.1mg/mL、0.3mg/mL和0.5mg/mL氧化石墨烯溶液，调整pH至8.5，将经过多巴胺处理的玻璃片放入氧化石墨烯溶液中，在50℃条件下浸泡3小时，取出后超声清洗，氮气吹干。利用扫描电镜对其分布情况进行观察，如图7。可以看出在pH8.5的0.1mg/mL、0.3mg/mL和0.5mg/mL氧化石墨烯溶液中，50℃条件下浸泡3小时候的玻璃片均形成不完整的氧化石墨烯膜层，且随着浓度的增大，折皱有增多的趋势。（3）抗菌蛋白质的固定将pH7.4的PBS溶液中加入鸡蛋白溶菌酶，0～4℃条件下搅拌半小时，放入经多巴胺和石墨烯衍生物处理过的玻璃片，在4℃条件下浸泡48小时，取出后用PBS冲洗，待用。实施例6-8：不同温度条件下对玻璃表面进行PDA/rGO膜层的制备。反应原料是盐酸多巴胺、pH8.5的Tirs溶液，氧化石墨烯。其中盐酸多巴胺购自于Sigma-Aldrich，氧化石墨烯用Hummers法。（1）对玻璃表面进行多巴胺改性将多巴胺加入到pH8.5的Tris溶液中配制成2mg/mL，放入清洗好的载玻片，室温静置24小时，取出后超声清洗，氮气吹干。（2）不完整石墨烯衍生物膜层的制备将pH8.5的Tris溶液加入到氧化石墨烯中，配制成0.3mg/mL氧化石墨烯溶液，调整pH至8.5，将经过多巴胺处理的玻璃片放入氧化石墨烯溶液中，分别在25℃、50℃和80℃条件下浸泡3小时，取出后超声清洗，氮气吹干。利用扫描电镜对其分布情况进行观察，如图8。可以看出在25℃、50℃和80℃温度条件下浸泡3小时后的玻璃片均形成不完整的氧化石墨烯膜层，且随着温度的升高，氧化石墨烯与聚多巴胺膜层的结合有变大的趋势。（3）抗菌蛋白质的固定将pH7.4的PBS溶液中加入鸡蛋白溶菌酶，0～4℃条件下搅拌半小时，放入经多巴胺和石墨烯衍生物处理过的玻璃片，在4℃条件下浸泡48小时，取出后用PBS冲洗，待用。