改进的胸苷激酶基因的制作方法

本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请号61/784,901的权益，该临时申请通过引用全文并入本文。本申请涉及以下共同未决的专利申请：与本申请同日提交的申请序列号[尚未指定]，代理卷号30863-722.202，该申请通过引用全文并入本文。
背景技术：
：增殖性疾病如癌症对社会构成了严峻挑战。癌性生长，包括恶性癌性生长，具有独特的特征，例如不可控的细胞增殖(其导致，例如恶性组织的不受调控的生长)，入侵局部以及甚至远端组织的能力，缺乏分化，缺乏可检测的症状，以及最显著的是，缺乏有效的治疗和预防。癌症可在任何年龄在任何器官的任何组织中发展。癌症的病因学尚未被明确地界定，但诸如遗传易感性、染色体断裂病症、病毒、环境因素和免疫失调等机制均已与恶性细胞生长和转化相关联。癌症包括一大类别的医学状况，影响到全球数百万的个人。癌细胞可能出现在身体的几乎任何器官和/或组织中。在世界范围内，每年超过1千万人被诊断出患有癌症，并且据估计到2020年，这一数字将增加至每年1500万新发病例。癌症导致每年600万例死亡或全世界死亡数的12％。技术实现要素：本文提供了编码来自人单纯疱疹病毒(HSV-TK)的突变形式的胸苷激酶的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32、33、167、168或其组合处突变，其中该多核苷酸序列与SEQIDNO:1或3的多核苷酸序列相比是突变的。一种编码来自人单纯疱疹病毒(HSV-TK)的突变形式的胸苷激酶的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32、33、167、168或其组合处突变，其中该多核苷酸序列与SEQIDNO:3的多核苷酸序列相比是突变的。在一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基167、168或其组合处突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。在另一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基167处突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。在又另一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基168处突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。在再另一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基167和168处突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。在一个实施方案中，编码的HSV-TK的氨基酸残基167突变成丝氨酸或苯丙氨酸。在另一个实施方案中，编码的HSV-TK的氨基酸残基168突变成选自组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸的氨基酸。在又另一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸25和26处突变。在再另一个实施方案中，氨基酸残基25和26突变成选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在另一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基32和33处突变。在一个实施方案中，氨基酸残基32和33突变成选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32和33处突变。在另一个实施方案中，氨基酸残基25、26、32和33突变成选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在又另一个实施方案中，编码的HSV-TK包含选自氨基酸残基25、26、32和33的至少一个突变和选自氨基酸残基167和168的至少一个突变。在另外其他的实施方案中，编码的HSV-TK序列进一步包含核输出信号(NES)。在另一个实施方案中，该核输出信号序列在HSV-TK序列的5’末端处或附近插入。在另一个实施方案中，该核输出信号序列是LQKKLEELELDG(SEQIDNO:24)。在一个实施方案中，编码的突变HSV-TK并不仅仅定位于核区域。在一个实施方案中，编码的修饰HSV-TK显示与野生型HSV-TK相比降低量的胸苷激酶活性。在另一个实施方案中，编码的修饰HSV-TK的活性降低大约1.5倍、大约2倍、大约5倍、大约10倍、大约20倍、大约30倍或大约50倍。在又一个实施方案中，编码的修饰HSV-TK的活性降低大约1.5％、大约2％、大约5％、大约10％、大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％或大约100％。在一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32、33和168处包含突变。在另一个实施方案中，编码的HSV-TK包含突变R25G、R26S、R32G、R33S和A168H。在一个实施方案中，修饰的多核苷酸序列包含如SEQIDNO:12-22中的任一个所示的核酸序列。在又一个实施方案中，修饰的多核苷酸序列包含如SEQIDNO:16-22中的任一个所示的核酸序列。在一个实施方案中，该序列包含TK168dmNES(SEQIDNO:18)。在又一个实施方案中，该多核苷酸编码修饰的HSV-TK多肽。在另外其他的实施方案中，该多核苷酸进一步包含编码第二多肽的多核苷酸序列，其中所述第二多肽是治疗性多肽。在另外其他的实施方案中，该第二治疗性多肽是第二自杀基因或生长因子。在一些实施方案中，该生长因子选自表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF、TGF-α、TGF-β和成纤维细胞生长因子。在一些实施方案中，该第二自杀基因选自：胞嘧啶脱氨酶、VSV-tk、IL-2、硝基还原酶(NR)、羧基酯酶、β-葡糖醛酸酶、细胞色素p450、β-半乳糖苷酶、白喉毒素A-链(DT-A)、羧肽G2(CPG2)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和脱氧胞苷激酶(dCK)。在一些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含编码PiT-2多肽的多核苷酸。在另外其他的实施方案中，本文公开的多核苷酸还包含编码靶向多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，该靶向多肽与胞外蛋白质结合。在另一个实施方案中，该胞外蛋白质是胶原蛋白。本文还提供了杀伤有需要的受试者中的肿瘤细胞的方法，该方法包括施用治疗有效量的逆转录病毒颗粒，该逆转录病毒载体编码如本文所述的HSV-TK修饰的肽。在一些实施方案中，所述逆转录病毒颗粒经静脉内、肌内、皮下、动脉内、肝动脉内、鞘内、腹膜内和/或肿瘤内施用。在其他实施方案中，该逆转录病毒颗粒经肿瘤内或静脉内施用。在另外其他的实施方案中，该逆转录病毒载体颗粒经动脉内施用。在其他实施方案中，向有需要的受试者累积施用至少1×1012TVP的逆转录病毒载体。在另外其他的实施方案中，向有需要的受试者一次施用至少1×109TVP的逆转录病毒载体。在另外其他的实施方案中，所述前药在所述逆转录病毒载体颗粒施用后约1-2天之间施用。在一些实施方案中，该前药选自更昔洛韦、缬更昔洛韦、阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦。在一些实施方案中，该前药是更昔洛韦。本文还提供了用于治疗有需要的患者中的癌症的方法，该方法包括递送治疗有效量的逆转录病毒载体颗粒，该逆转录病毒载体编码如本文所述的HSV-TK修饰的肽，随后向该有需要的患者施用核苷前药。本文还提供了在受试者中增加HSV-TK更昔洛韦、缬更昔洛韦、阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦介导的肿瘤细胞杀伤的方法，该方法包括连同增加间隙连接细胞内通信(GJIC)的处理一起，向该受试者递送治疗有效量的包含HSV-TK的逆转录病毒载体颗粒。在一些实施方案中，该增加GJIC的处理包括递送编码至少一个间隙连接亚单位的多核苷酸序列。在其他的实施方案中，该间隙连接亚单位是连接蛋白43、连接蛋白30或连接蛋白26。在另外其他的实施方案中，该间隙连接亚单位是修饰以防止翻译后修饰的间隙连接亚单位。在另外其他的实施方案中，该增加GJIC的处理包括递送编码E-钙粘蛋白的多核苷酸序列。在另外其他的实施方案中，该增加GJIC的处理包括向受试者递送来自下组的化合物：吉西他滨；cAMP；视黄酸；类胡萝卜素；糖皮质激素，类黄酮，芹菜素(apigenin)或洛伐他汀。在另外其他的实施方案中，该增加GJIC的处理包括蛋白酶体抑制。在一个实施方案中，该蛋白酶体抑制包括N-乙酰基-Leu-Leu-Nle-CHO(ALLN)和/或氯喹的施用。在其他实施方案中，该增加GJIC的处理包括放射或电治疗。本文还提供了杀伤细胞的方法，该方法包括：a)将权利要求1-26中的任一项的多核苷酸序列引入细胞内；b)允许或引发该细胞表达所表达的胸苷激酶或其变体；和c)使该细胞与能被胸苷激酶转化为细胞毒性剂的试剂接触。在一个实施方案中，多核苷酸序列编码包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个修饰的、来自人单纯疱疹病毒(HSV-TK)的突变形式的胸苷激酶。在另一个实施方案中，多核苷酸序列编码包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个修饰的、来自人单纯疱疹病毒(HSV-TK)的突变形式的胸苷激酶。在另一个实施方案中，多核苷酸序列编码包含3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个修饰的、来自人单纯疱疹病毒(HSV-TK)的突变形式的胸苷激酶。在另一个实施方案中，多核苷酸序列编码包含4、5、6、7、8、9、10个或更多个修饰的、来自人单纯疱疹病毒(HSV-TK)的突变形式的胸苷激酶。在另一个实施方案中，多核苷酸序列编码包含5、6、7、8、9、10个或更多个修饰的、来自人单纯疱疹病毒(HSV-TK)的突变形式的胸苷激酶。。在一个实施方案中，所编码的HSV-TK可以在氨基酸残基167、168或其组合处突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。例如，所编码的HSV-TK可以在氨基酸残基167处突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。在另一实例中，所编码的HSV-TK可以在氨基酸残基168处突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。在另一实例中，所编码的HSV-TK可以在氨基酸残基167和168处均突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。在另一个实施方案中，所编码的HSV-TK的氨基酸残基167可以突变成丝氨酸或苯丙氨酸。在另一个实施方案中，所编码的HSV-TK的氨基酸残基168可以突变成选自下组的氨基酸：组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸。在另一个实施方案中，所编码的HSV-TK可以在氨基酸25和26处突变。例如，氨基酸残基25和26可以突变成选自下组的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸。在另一个实施方案中，所编码的HSV-TK可以在氨基酸残基32和33处突变。例如，氨基酸残基32和33可以突变成选自下组的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸。在另一个实施方案中，所编码的HSV-TK可以在氨基酸残基25、26、32和33处突变。例如，氨基酸残基25、26、32和33可以突变成选自下组的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸。在另一个实施方案中，所编码的突变HSV-TK并不仅仅定位于核区域。在另一个实施方案中，所编码的修饰的HSV-TK显示出与野生型HSV-TK相比降低的量的胸苷激酶活性。在另一个实施方案中，所编码的修饰HSV-TK的胸苷激酶活性可以降低约1.5倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约30倍或约50倍。在另一个实施方案中，所编码的修饰HSV-TK的胸苷激酶活性可以降低约1.5％、约2％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％。在另一个实施方案中，所编码的修饰HSV-TK的胸苷激酶活性可以增加约1.5倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约30倍或约50倍。在另一个实施方案中，所编码的修饰HSV-TK的胸苷激酶活性可以增加约1.5％、约2％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％。本文提供了如上所述的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK包含突变A167F、A168H或两者。本文中所描述的多核苷酸序列可进一步包含编码第二多肽的多核苷酸序列，其中所述第二多肽是治疗性多肽。在某些情况下，该治疗性多肽可以是自杀基因。自杀基因包括但不限于胞嘧啶脱氨酶、VSV-tk、IL-2、硝基还原酶(NR)、羧基酯酶、β-葡糖醛酸酶、细胞色素p450、β-半乳糖苷酶、白喉毒素A链(DT-A)、羧肽G2(CPG2)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、鸟苷酸激酶和脱氧胞苷激酶(dCK)。在一个实施方案中，本文所述的修饰的多核苷酸序列可以包含如SEQIDNO：12-24中的任一个所示的核酸序列。在另一个实施方案中，本文所述的修饰的多核苷酸序列可以包含如SEQIDNO：22-24中的任一个所示的核酸序列。在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸序列包含核输出信号。例如，多核苷酸序列可以包含HSV-TKA168HdmNES(SEQIDNO：18)。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法中的逆转录病毒载体包含一个或多个剪接位点修饰。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法中的逆转录病毒载体包含HSV-TKA167Fsm，其中，“sm”指的是单个突变对R25G-R26S(SEQIDNO：13)。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法中的逆转录病毒载体包含HSV-TKA168Hsm(SEQIDNO：12)。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法中的逆转录病毒载体包含HSV-TKA167Fdm，其中，“dm”是指双突变对R25G-R26S、R32G-R33S(SEQIDNO：17)。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法中的逆转录病毒载体包含HSV-TKA168Hdm(SEQIDNO：16)。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法中的逆转录病毒载体包含HSV-TKA167Fdm和来源于丝裂原(mitogen)活化的蛋白激酶激酶的核输出序列，其实例是SEQIDNO：19。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法中的逆转录病毒载体包含HSV-TKA168Hdm和NES(SEQIDNO：18)。在这样的实施方案中，该序列包含HSV-TKA168H。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法中的逆转录病毒载体包含HSV-TK，其中这样的载体包含升级的底物结合域和mNLS/NES组。此示例性实施方案的实例包括SEQIDNO：18和19。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法中的逆转录病毒载体包含HSV-TK，其中该载体包含选择性标记、发光基因和/或一种或多种杀伤基因。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法中的逆转录病毒载体包含两个修饰。在另一个实施方案中，逆转录病毒颗粒包含PiT-2多核苷酸序列，且该逆转录病毒颗粒与靶细胞的表面上的PiT-2受体特异性结合，从而允许逆转录病毒颗粒向细胞中的摄取。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法中的逆转录病毒载体包含HSV-TK，其中由多核苷酸序列编码的氨基酸序列包含TK168dmNES。本文提供了增加以下物质介导的受试者中的肿瘤细胞杀伤的方法：FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦样、更昔洛韦样和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物，所述方法包括连同增加间隙连接细胞内通信(GJIC)的处理一起，向受试者递送治疗有效量的编码HSV-TK的载体颗粒。在一个实施方案中，在这样的方法中所用的HSV-TK可由任何本文所述的多核苷酸序列编码。所述增加GJIC的处理可以包括，例如，递送编码至少一个间隙连接亚单位的多核苷酸序列。间隙连接亚单位可以是，例如，连接蛋白43、连接蛋白30或连接蛋白26。该间隙连接亚单位可以是修饰以防止翻译后修饰的间隙连接亚单位。在一个实施方案中，所述增加GJIC的处理包括递送编码E-钙粘蛋白的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述增加GJIC的处理包括向受试者递送来自下组的化合物：吉西他滨；cAMP；视黄酸；类胡萝卜素；糖皮质激素，类黄酮，芹菜素或洛伐他汀。在另一个实施方案中，所述增加GJIC的处理包括蛋白酶体抑制。蛋白酶体抑制可以包括N-乙酰基-Leu-Leu-NLE-CHO(ALLN)和/或氯喹的施用。在另一个实施方案中，所述增加GJIC的处理包括放射或光动力治疗，包括与氧化剂和激活MAP激酶的药剂共同施用。在另一个实施方案中，所述增加GJIC的处理包括电治疗。本文提供了一种杀伤细胞的方法，该方法包括：(a)将本文描述的多核苷酸序列引入细胞中；(b)允许或引发该细胞以表达所表达的胸苷激酶或其变体；和(c)使该细胞与能被胸苷激酶转化为细胞毒性剂的药剂接触。本文提供了一种增加胸苷激酶旁观者效应的方法，该方法包括连同编码HSV-TK的逆转录病毒载体颗粒一起递送编码间隙连接亚单位的序列。在一些实施方案中，该逆转录病毒颗粒可以靶向至感兴趣的细胞或系统。在一些实施方案中，该逆转录病毒靶向方法可以包括引入识别或结合感兴趣的细胞或系统的因子。在一些实施方案中，该逆转录病毒靶向方法可以包括靶向蛋白的引入，包括与感兴趣的系统的细胞的表面上的蛋白质或受体结合，该蛋白质或受体包括抗体、受体结合蛋白质或与细胞组分结合的蛋白质，包括但不限于胶原蛋白。在一些实施方案中，该靶向蛋白可以包括与胶原蛋白结合的蛋白质，包括但不限于包含胶原蛋白结合域的肽、蛋白质和/或蛋白质结构域。附图说明本发明的新颖特征在所附的权利要求书中特别地提出。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：图1示出了HSV-TK剪接位点去除如何避免HSV-TK的失活形式。用去除(HuTSF/Tk/mut)或不去除(HuTG1Tk1SvNa)剪接位点的HSV-TK载体转导的T细胞系和初级T细胞的PCR分析。图2提供了使用本文描述的组合物的IA期临床试验的示意图。图3提供了使用本文描述的组合物的IB期临床试验的示意图。图4提供了针对组群1至3的IA期临床试验的事件的示例性时间表。图5提供了针对组群4及以上的IA期临床试验的事件的示例性时间表。图6提供了使用本文描述的组合物的IB期临床试验的示意图。图7提供了针对使用本文所述组合物的治疗的临床试验的时间表A的示意图。图8提供了针对使用本文所述组合物的治疗的临床试验的时间表B的示意图。图9提供了PiT-2跨膜分子的图示。框表示Anti-PiT-2Western抗体结合位点的近似位置。图10提供了PiT-2跨膜分子的图示。框表示Anti-PiT-2IHC抗体结合位点的近似位置。图11提供了具有多种HSV-TK修饰的示例性Reximmune构建体。图11A：GM-CSF-，HSV-TK167sm。图11B：GM-CSF-，HSV-TK168sm。图11C：GM-CSF-，HSV-TK167dm。图11D：GM-CSF-，HSV-TK168dm。图11E：GM-CSF-，HSV-TK167dm+NES。图11F：GM-CSF-，HSV-TK168dm+NES。图12：mHSV-TK，针对在图11中显示的逆转录病毒载体通过Western分析的蛋白质检测。将病毒DNA转染到2963T载体生产细胞中，裂解该细胞，用抗-HSV-TK抗体检测HSV-TK蛋白。发现所有HSV-TK病毒载体都表达高水平的HSV-TK蛋白。图13提供了示例性逆转录病毒载体。图13A：RexRed-TKA168H。图13B：RexRed-TK167-dm。图13C：RexRed-TK168dm。图14提供了另外的示例性逆转录病毒载体，其中采用特定形式的密码子优化。图14A：RexRed-TK167-dm+NES。图14B：RexRed-TK168-dm+NES。图14C：RexRed-TK167-dm+NESJCO。图14D：RexRed-TK168-dm+NESJCO。JCO＝合理的密码子优化。图15提供了另外的示例性逆转录病毒载体。图15A：RexRed-TKA168F。图15B：RexRed-TKA168F(GCV特异性的)。图15C：包含潮霉素抗性基因的Rex-Hygro-R-TKA168F。图16提供了另外的示例性逆转录病毒载体。图16A：Rex-Hygro-R-TKA167F。图16B：Q-PiT-2是包含与靶细胞表面上的PiT-2受体结合的病毒受体基因的载体。图17提供了另外的示例性的逆转录病毒载体。图17A：原始Reximmune-C。图17B.包含升级的Reximmune-C，其中插入了mTK39(HSV-TKSR39)杀伤基因与新霉素抗性基因(NeoR)和选择性标记。图18提供了Reximmune-C+突变细菌胞苷脱氨酶(mBCD)杀伤基因的示例。图19提供了Reximmune-C+突变酵母细菌胞苷脱氨酶(mYCD)杀伤基因的示例。图20示出了RexRedSuperTK的一个实例，其包含发光基因(RFP)和在注出的位置包含确定的序列的杀伤基因。图21提供了具有升级的底物结合域及+/-MNLS和/或+/-NES组的逆转录病毒载体的示例，突出显示了Reximmune-C1或2、SR-39和野生型HSV-TK基因之间的序列差异，并且已经放置了第二治疗基因来代替在LTR与SV40启动子之间的RFP基因。图22示出了RexRedSuperTKA167F，其包含发光基因(RFP)和在位置159-161和167-169处含有注出的序列的杀伤基因。图23提供了示例性的逆转录病毒载体，其为LNCEA375转导的细胞的Reximmune-C多色克隆。图23A：LNC-EGFP，其含有增强绿色荧光蛋白作为发光基因。图23B：RexRed，其含有红色荧光蛋白作为发光基因。图24提供了示例性的载体，其仅有发光基因或仅有潮霉素抗性基因选择性标记。图25：亲本和PiT-2-CHO-K1系中的TK-GCV杀伤结果。该图示出了单一RxC2转导方案的数据。同批RxC2用于全部实验(如通过逆转录酶串联定量聚合酶链反应(RT-qPCR)所确定的，大约5E+10总病毒颗粒/毫升(TVP)的滴度)。图25A：在GCV中4天(4个剂量)后，RxC2转导的CHO-K1亲本系的GCV杀伤。图25B：在GCV中4天(4个剂量)后，RxC2转导的PiT-2-CHO-K1的GCV杀伤。图26：在三重RxC2-转导方案后在亲本和PiT-2-CHO-K1中的Tk-GCV杀伤。图26A：在第9天RxC2-三重转导的CHO-K1亲本的GCV杀伤(10％板，5个剂量的GCV)。图26B：在第9天RxC2-三重转导的PiT-2-CHO-K1的GCV杀伤(10％板，5个剂量的GCV)。图27：示出了在MIA-PACA-2人胰腺癌细胞系中用Reximmune-C2(HSV-TKA168HdmNES)(SEQIDNO：18)进行三重转导之后的TK-GCV杀伤。用不同浓度的GCV对RxC2三重转导的MIA-PaCa2的GCV杀伤，在第8天，再接种的初始细胞的25％。图28示出了在用Reximmune-C2对PiT-2-MIA-PaCa-2细胞进行三重转导后的TK-GCV杀伤。用不同浓度的GCV对RxC2三重转导的PiT-2-MIA-PaCa2的GCV杀伤，在第8天，初始细胞的25％。图29：得自旁观者体外测定的图形，其中用20mMGCV处理人黑素瘤A375HygroTK克隆。图30：得自旁观者体外测定的图形，其中用20mMGCV处理C6-Hygro-TK克隆。图31是描绘在不同的癌细胞系的Reximmune-C2三重转导后，GCV杀伤的百分比的图。图32示出了在GCV中4天后，RxC2-转导的CHO-K1细胞系的图。图33示出了在GCV中4天后，RxC2-转导的PiT-2-HA-CHO-K1细胞系的图。图34示出了在293T细胞瞬时转染中HSV-TK亚细胞定位的免疫组织化学(IHC)，24小时第一抗体(SantaCruz)，RexC1HSV-TK(左图)和RexC2HSV-TK(右图)。具体实施方式HSV-TK基因治疗产品是可获得的，但对于包括癌症基因治疗在内的体外和体内最大基因表达和肿瘤杀伤活性并非最佳的。在此第一次公开了HSV-TK基因内密码子的优化，以产生改进的自杀基因，该自杀基因在病毒或假病毒基因递送系统的背景中具有增强的前药活化性能。优化后的基因递送系统确保最佳的HSV-TK前药酶活性和高滴定度病毒颗粒的产生。因此，本文公开了使用生物信息学软件和本发明人的定制分析利用对基因和病毒载体系统的功能和限制的了解而制备的候选优化HSV-TK基因的优化。下面的优化步骤代表由本发明人用以实现本文描述的实施方案的示例性方法。可以利用软件辅助的密码子优化来除去稀有的和低使用率的密码子以改善HSV-TK蛋白表达。可以调节新密码子优化的基因中的GC含量以避免基因合成和其他问题。HSV-TK内已知的剪接受体和剪接供体序列可以被去除。可以除去聚嘧啶段(Tracts)，特别是通过密码子优化引入的可以参与剪接的那些。一个单个强Kozak翻译起始序列可以被包括在起始密码子(ATG)的前面，而HSV-TK开放阅读框内可能的Kozak序列可以被去除。这些序列中的一些序列可以通过密码子优化而引入，并且应当理解，可能需要在多次迭代中进行修饰以针对改善的杀肿瘤活性优化基因。可以除去HSV-TK内的核定位序列(NLS)以输出表达的HSV-TK，其中所表达的HSV-TK蛋白并不仅仅定位于细胞核，而是在细胞质中积累。可以加入使得能够将基因克隆到所公开的逆转录病毒载体中的许多位置中的位于HSV-TK基因侧翼的限制位点，同时排除HSV-TK基因本身内的这些相同的限制位点。可以在HSV-TK基因末端包含双终止密码子以确保HSV-TK翻译的完全终止。可以评估在HSV-TK基因内在氨基酸位置159-161处底物结合域附近的突变。可以对在HSV-TK基因内在氨基酸位置167处底物结合域中的突变体，评估针对前药核苷类似物如更昔洛韦(gangciclovir)和类似的前药的增加的酶活性，以及对它们杀伤癌细胞的能力的选择性。可以对在HSV-TK基因内在氨基酸位置168处底物结合域中的突变体，评估增加的前药GCV酶活性和对它们杀伤癌细胞的能力的选择性。可以对在HSV-TK基因内在氨基酸位置167+168处底物结合域中的突变体，评估增加的前药GCV酶活性和对它们杀伤癌细胞的能力的选择性。可以评估标签、融合蛋白和HSV-TK与其他基因和蛋白质的连接体的用途。也可以考虑其他优化方法供在本文所述的方法中使用。一旦基因以这种方式优化，就可以将其基因序列发送到基因合成公司以定制基因合成。定义除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。除非另外指出，在本文整个公开内容中涉及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列、网站和其他出版的材料均通过引用全文并入本文。在对于本文术语存在多种定义的情况下，以本部分中的定义为准。当提及URL或其他这样的标识符或地址时，应当理解，这样的标识符可能改变并且网络上的特定信息可能时有时无，但可通过搜索因特网找到等同的信息。对其的提及证实了该信息的可获得性和公共传播性。如本文所用的，“核酸”是指包含至少两个共价连接的核苷酸或核苷酸类似物亚单位的多核苷酸。核酸通常是脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，或者DNA或RNA的类似物。核苷酸类似物可商购获得，并且制备包含此类核苷酸类似物的多核苷酸的方法是已知的(Lin等人(1994)Nucl.AcidsRes.22:5220-5234；Jellinek等人(1995)Biochemistry34:11363-11372；Pagratis等人(1997)NatureBiotechnol.15:68-73)。核酸通常是单链的、双链的或它们的混合物。对于本文而言，除非另外说明，核酸是双链的，或根据上下文是显而易见的。如本文所用的，“DNA”意在包括所有类型和大小的DNA分子，包括cDNA、质粒以及包含修饰的核苷酸和核苷酸类似物的DNA。如本文所用的，“核苷酸”包括核苷单磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。核苷酸还包括修饰的核苷酸，例如但不限于硫代磷酸核苷酸和脱氮嘌呤核苷酸以及其他核苷酸类似物。如本文所用的术语“多核苷酸”意指任意长度的核苷酸的聚合形式，并包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。该术语还包括单链和双链DNA，以及单链和双链RNA。该术语还包括修饰的多核苷酸例如甲基化或封端多核苷酸。如本文所用的，术语“受试者”是指向其中引入大DNA分子的动物、植物、昆虫和禽类，包括更高等的生物，例如哺乳动物和禽类，包括人、灵长类动物、啮齿类动物、牛、猪、兔、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、猫、狗、马、鸡以及其他生物。如本文所用的，“施用于受试者”是这样的程序，通过该程序将一种或多种递送药剂和/或大核酸分子一起或单独地引入到受试者中或施加到受试者上，以使得存在于受试者中的靶细胞最终与该药剂和/或大核酸分子接触。如本文所用的，“递送载体”或“递送媒介物(deliveryvehicle)”或“治疗载体”或“治疗系统”是指携带外源核酸分子并将该外源核酸分子转运到靶细胞或组织的病毒和非病毒颗粒。病毒媒介物包括但不限于：逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、疱疹病毒和腺相关病毒。非病毒媒介物包括但不限于：微粒、纳米颗粒、病毒体和脂质体。如本文所用的“靶向”是指与递送媒介物相关联并将该媒介物靶向至细胞或组织的配体的使用。配体包括但不限于抗体、受体和胶原结合域。如本文所用的，“递送”(可与“转导”互换使用)指这样的过程，通过该过程将外源核酸分子转移到细胞内使得它们位于该细胞内部。核酸的递送是与核酸的表达不同的过程。如本文所用的，“多克隆位点(MCS)”是质粒中包含多个限制酶切位点的核酸区域，其中任何限制酶切位点均可以与标准重组技术结合使用以消化该载体。“限制酶消化”是指采用仅在核酸分子的特定位置起作用的酶进行的核酸分子的催化切割。这些限制酶中的许多可商购获得。此类酶的使用是本领域技术人员广泛了解的。通常，使用在MCS内切割的限制酶将载体线性化或片段化以使得外源序列能够与载体连接。如本文所用的，“复制起点”(通常命名为“ori”)是复制开始的特定的核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可以采用自主复制序列(ARS)。如本文所用的，“选择性或可筛选的标记”赋予细胞可识别的变化，从而使得容易鉴别含有表达载体的细胞。通常，选择性标记是赋予允许选择的性质的标记。正选择性标记是其中该标记的存在允许其选择的标记，而负选择性标记是其中其存在阻止其选择的标记。正选择性标记的实例是抗药性标记。通常，包含药物选择标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素和组氨醇的抗性的基因是有用的选择性标记。除了赋予允许基于条件的实施来辨别转化体的表型的标记，还考虑其他类型的标记，包括可筛选的标记，如GFP，其基础是色度分析。在一些实施方案中，使用可筛选的酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还已知如何采用免疫标记，其可能与FACS分析结合。所用的标记并不认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时被表达即可。选择性和可筛选的标记的其他实例是本领域技术人员公知的。术语“转染”用来指细胞对外来DNA的摄取。当外源DNA已经被引入细胞膜内时，该细胞已经被“转染”。许多转染技术是本领域中公知的。参见，例如，Graham等人,Virology52:456(1973)；Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989)；Davis等人,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)；Chu等人,Gene13:197(1981)。这样的技术可以用来将一个或多个外源DNA部分如核苷酸整合载体和其他核酸分子引入合适的宿主细胞中。该术语包括化学、电学和病毒介导的转染程序。如本文所用的，“表达”是指这样的过程，通过该过程核酸被翻译成肽或被转录成RNA，例如RNA可被翻译成肽、多肽或蛋白质。如果核酸来源于基因组DNA，则表达包括(如果选择合适的真核宿主细胞或生物)mRNA的剪接。对于将在宿主细胞中表达的异源核酸，它必须在初始时被递送到细胞内，并随后一旦进入细胞，则最终停留在细胞核中。如本文所用的，“治疗过程”是指在限定的时间段内周期性或定时施用本文公开的载体。这样的时间段为至少一天、至少两天、至少三天、至少五天、至少一周、至少两周、至少三周、至少一个月、至少两个月或至少六个月。施用还可以以长期方式进行，即非限定的时间段。所述周期性或定时施用包括一天一次、一天两次、一天三次或其他设定的定时施用。如本文所用的，术语“共施用”、“与……联合施用”及其语法等同词等意在涵盖向单个患者施用所选治疗剂，并且旨在包括其中通过相同或不同的施用途径或者在相同或不同的时间施用所述药剂的治疗方案。在一些实施方案中，如本申请中公开的治疗剂将与其他药剂共施用。这些术语包括将两种或更多种药剂施用于动物，以使得药剂和/或它们的代谢物二者同时存在于动物中。它们包括以单独的组合物同时施用，以单独的组合物在不同的时间施用，和/或以其中存在两种药剂的组合物施用。因此，在一些实施方案中，治疗剂和其他药剂以单一组合物施用。在一些实施方案中，治疗剂和其他药剂在组合物中混合。在进一步的实施方案中，治疗剂和其他药剂以单独的剂量在单独的时间施用。术语“宿主细胞”表示可被用作或已被用作多个用于产生递送载体的构建体的接受体的例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。该术语包括已被转染的原始细胞的子代。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常是指已经用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，由于天然的、偶然的或有意的突变，单个亲本细胞的子代可不一定与原始亲本在形态或基因组或总DNA互补序列上完全相同。如本文所用的，“基因治疗”包括将异源DNA转移到患有寻求治疗或诊断的病症或病况的哺乳动物尤其是人的某些细胞(靶细胞)。所述DNA以某种方式被引入到所选择的靶细胞中，以使得异源DNA被表达并由此产生编码的治疗性产物。在一些实施方案中，异源DNA直接或间接地介导编码治疗性产物的DNA的表达。在一些实施方案中，所述异源DNA编码产物，例如直接或间接地介导治疗性产物的表达的肽或RNA。在一些实施方案中，基因治疗用于递送编码基因产物的核酸以替代有缺陷的基因或补充由其中引入该核酸的哺乳动物或细胞产生的基因产物。在一些实施方案中，所引入的核酸因此编码通常不在哺乳动物宿主中产生或不以治疗有效量或在治疗上有用的时间产生的治疗性化合物，例如生长因子或其抑制剂，或者肿瘤坏死因子或其抑制剂，如受体。在一些实施方案中，编码治疗性产物的异源DNA在引入至患病宿主的细胞之前进行修饰以增强或以其他方式改变产物或其表达。如本文所用的，“异源核酸序列”通常是这样的DNA：其编码不由DNA在其中表达的细胞在体内正常产生的RNA和蛋白质，或者介导或编码通过影响转录、翻译或其他可调节生化过程来改变内源性DNA表达的介体。异源DNA在本文中涵盖本领域技术人员将认识到或认为对DNA在其中表达的细胞是异源或外来的任何DNA。异源DNA的实例包括但不限于，编码可追踪的标记蛋白质(如赋予抗药性的蛋白质)的DNA，编码治疗有效物质(如抗癌剂、酶和激素)的DNA，以及编码其他类型蛋白质(如抗体)的DNA。在一些实施方案中，由异源DNA编码的抗体在已引入异源DNA的细胞表面上分泌或表达。如本文所用的，术语“胸苷激酶突变体”不仅指本文描述的特定蛋白质(以及编码这些蛋白质的核酸序列)，而且还指其衍生物(其可包括保持生物活性的初级蛋白质的各种结构形式)。如本文所用的，“未突变的胸苷激酶”指天然或野生型胸苷激酶多肽序列。如本文所用的，“自杀基因”指编码一种产物的核酸，其中该产物单独或在其他化合物的存在下导致细胞死亡。如本文所用的，术语“突变”或“被另一个核苷酸替代”意指在某一位置的核苷酸在该位置被除了在未突变或先前已经突变的序列中出现的核苷酸之外的核苷酸所替代。也就是说，在一些情况下，可在不同的核苷酸中进行特定的修饰。在一些实施方案中，进行替代以使得相关的剪接供体和/或受体位点不再存在于基因中。参见，例如，图1。如本文所用的，“极性氨基酸”指氨基酸残基Asp(N)、Cys(C)、Gln(Q)、Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)或Tyr(Y)。如本文所用的，“非极性氨基酸”指氨基酸残基Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Trp(W)或Val(V)。如本文所用的，“碱性氨基酸”指氨基酸残基Arg(R)、His(H)或Lys(K)。如本文所用的，“酸性氨基酸”指氨基酸残基Asp(D)或Glu(E)。改进的HSV-TK胸苷激酶是将天然核苷底物以及核苷类似物磷酸化的补救途径酶。通常，病毒胸苷激酶通过将诸如更昔洛韦或阿昔洛韦等核苷类似物施用于表达病毒胸苷激酶的细胞而在治疗上应用，其中病毒胸苷激酶将核苷类似物磷酸化，产生能够杀死该细胞的毒性产物。本发明的编码病毒胸苷激酶的多核苷酸序列可以由很多种病毒胸苷激酶制备。在一些实施方案中，病毒胸苷激酶突变体来源于疱疹病毒科(Herpesviridae)胸苷激酶，包括例如灵长类动物疱疹病毒和非灵长类动物疱疹病毒，如禽类疱疹病毒。合适的疱疹病毒的代表性实例包括，例如1型单纯疱疹病毒(HSV)、2型单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、狨猴疱疹病毒、1型猫疱疹病毒、假性狂犬病病毒、1型马疱疹病毒、1型牛疱疹病毒、火鸡疱疹病毒、马雷克病病毒(Marek'sdiseasevirus)、疱疹病毒saimir和EB(Epstein-Barr)病毒。疱疹病毒可容易地获自商业来源，例如美国模式培养基保藏所(“ATCC”,Rockville,Md.)。疱疹病毒也可以从天然存在的过程(例如，感染的动物)分离。对TK基因的改进在一些实施方案中，本文公开了编码HSV-TK的多核苷酸序列。在一些实施方案中，该多核苷酸序列编码野生型HSV-TK氨基酸序列。在一些实施方案中，该多核苷酸序列编码突变的HSV-TK氨基酸序列。可用于制备本文提供的优化的多核苷酸序列的示例性程序包括但不限于：密码子优化；剪接位点的校正、多聚吡啶序列(poly-pyrimidinetract)和过量GC含量的去除；单Kozak序列的添加、不需要的Kozak序列的去除；纳入用于亚克隆到逆转录病毒或其他载体内的限制位点；核定位序列的去除或核输出序列的添加；突变序列的添加；双终止密码子序列的添加；标签、接头和融合序列的添加；提交至基因合成公司的序列文件的准备；将合成的基因亚克隆到逆转录病毒载体内；将荧光蛋白基因纳入到逆转录病毒载体内；将选择性标记基因纳入到逆转录病毒载体内；Maxiprep质粒DNA的制备；逆转录病毒生产细胞或其他细胞的转染；逆转录病毒的实验室、中试或GMP规模生产；用逆转录病毒对靶细胞的转染；GCV或类似的前药介导的细胞杀伤试验；次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)选择试验；用于产生逆转录病毒转导的细胞系的选择性标记药物选择程序；用于检测和记录逆转录病毒转导的靶细胞的荧光显微术和照相术；逆转录病毒转导的靶细胞的定量荧光检测；Western蛋白表达试验；HSV-TK分析所需的其他程序和试验；或它们的组合。本文描述了这些方法的方案，其可商购获得或描述于公开的文献和数据库中。在一些实施方案中，本文描述了获得改进的HSV-TK序列的方法。在一些实施方案中，该方法包括：a)剪接位点的校正和/或去除；和/或b)对单Kozak序列的调节。在一些实施方案中，任选地，该方法进一步包括用于HSV-TK序列的亚克隆的限制位点的纳入。在一些实施方案中，任选地或另外，该方法进一步包括胞核定位序列的去除。本文提供了编码来自人单纯疱疹病毒的病毒胸苷激酶(HSV-TK)的突变形式的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32、33、167、168或其组合处突变，其中该多核苷酸序列与SEQIDNO:1或3的多核苷酸序列相比是突变的。在这样的序列中，可能发生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个突变。本文提供了编码来自人单纯疱疹病毒的突变形式的胸苷激酶(HSV-TK)的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32、33、167、168或其组合处突变，其中该多核苷酸序列与SEQIDNO：1的多核苷酸序列相比是突变的。在这样的序列中，可以进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个突变。本文提供了编码来自人单纯疱疹病毒的突变形式的胸苷激酶(HSV-TK)的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32、33、167、168或其组合处突变，其中该多核苷酸序列与SEQIDNO：3的多核苷酸序列相比是突变的。在这样的序列中，可以进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个突变。修饰可以是保守的或非保守的突变。可进行突变以使得所编码的氨基酸被修饰成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。本文提供了编码来自人单纯疱疹病毒的突变形式的病毒胸苷激酶(HSV-TK)的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK包含核输出序列。本文提供了编码来自人单纯疱疹病毒的突变形式的胸苷激酶(HSV-TK)的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK与野生型HSV-TK相比在功能上得到改善，并且包含A168HdmNES(系统＝与TR启动子区域适当地融合的MV增强子)，其中NES指核输出序列。在一个实施方案中，突变的HSV-TKA168HdmNES是用于纳入在Reximmune-C2中的突变的HSV-TK基因。在一个实施方案中，NES来源于MAP激酶激酶(MAPKK)。在其他实施方案中，NES的多核苷酸序列是CTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGC(SEQIDNO:23)。在其他实施方案中，该NES多肽序列是LQKKLEELELDG(SEQIDNO:24)。在一些实施方案中，本文公开了编码人单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的多核苷酸序列的突变，其中不对野生型HSV-TK的多肽序列进行突变。核苷酸位置的提及参考SEQIDNO:1(野生型(wt)HSV1-TK核苷酸序列)或SEQIDNO:3(Reximmune-CHSV-TK中的HSV-TK；HSV-TK核定位信号(NLS)的SR39突变体和R25G-R26S突变)中的位置。在一个实施方案中，提供了约束突变HSV-TKSR39突变区的可克隆双链寡核苷酸的SacI-KpnI限制位点。参见，例如，SEQIDNO:6和7，其中SacI和KpnI位点分别示于左边和右边。粗体加下划线表示可进行突变的位点。SEQIDNO:8和9示出了用SacI和KpnI切割后的示例性序列。可用于进行突变的示例性的正向和反向引物如SEQIDNO:10和11所示。提供了示例性优化的HSV-TK多核苷酸序列，例如，作为SEQIDNO:12-24。然而，当这样提及时，本发明并不旨在限于如SEQIDNO:1或3中示出的确切序列，而包括其变体和衍生物。因此，考虑对其他胸苷激酶序列中核苷酸位置的鉴定(即，在本领域技术人员认为与SEQIDNO:1或3中所示的位置相对应的位置处的核苷酸的鉴定)。在一些实施方案中，通过考虑遗传密码以使得密码子变化为编码相同氨基酸残基的不同密码子，而替代核苷酸。在一些实施方案中，在HSV-TK编码核酸序列的编码区内替代核苷酸，但核酸序列保持野生型HSV-TK蛋白表达。在一些实施方案中，对密码子进行突变以使得所编码的HSV-TK表现出增加的活性。在一些实施方案中，密码子GCT用于表示丙氨酸。在一些实施方案中，密码子AGA用于表示精氨酸。在一些实施方案中，密码子AAT用于表示天冬酰胺。在一些实施方案中，密码子GAT用于代表天冬氨酸。在一些实施方案中，密码子TGT用于表示半胱氨酸。在一些实施方案中，密码子CAG用于表示谷氨酰胺。在一些实施方案中，密码子GAA用于表示谷氨酸。在一些实施方案中，密码子GGA用于表示甘氨酸。在一些实施方案中，密码子CAT用于表示组氨酸。在一些实施方案中，密码子ATT用于表示异亮氨酸。在一些实施方案中，密码子CTG用于表示亮氨酸。在一些实施方案中，密码子AAA用于表示赖氨酸。在一些实施方案中，密码子ATG用于表示甲硫氨酸。在一些实施方案中，密码子TTT用于表示苯丙氨酸。在一些实施方案中，密码子的CCT用于表示脯氨酸。在一些实施方案中，密码子TCT用于表示丝氨酸。在一些实施方案中，密码子ACA用于表示苏氨酸。在一些实施方案中，密码子TGG用于表示色氨酸。在一些实施方案中，密码子TAT用于表示酪氨酸。在一些实施方案中，密码子GTG用于表示缬氨酸。在一些实施方案中，密码子TGA用作终止密码子。下表中提供了用于突变的示例性密码子位置。用于设计人基因的改善的密码子使用，第一选择减少G/C含量的密码子优化在这样的实施方案中，5/21密码子在第三位置包含“C或G”(24％)；0/21密码子在第三位置包含“C”(0％)；5/21密码子在第三位置包含“G”(24％)；以及16/21密码子在第三位置包含“A或T”(76％)。在另外其他的实施方案中，21个密码子中的约3-7个密码子在第三个位置包含“C或G”；21个密码子中的超过0-3个密码子在第三个位置含有“C”；21个密码子中的约3-7个密码子在第三个位置包含“G”；且21个密码子中的约14-18密码子在第三个位置包含“A或T”。在一些实施方案中，密码子GCA用于表示丙氨酸。在一些实施方案中，密码子AGG用于表示精氨酸。在一些实施方案中，密码子AAC用于表示天冬酰胺。在一些实施方案中，密码子GAC用于表示天冬氨酸。在一些实施方案中，密码子TGC用于表示半胱氨酸。在一些实施方案中，密码子CAA用于表示谷氨酰胺。在一些实施方案中，密码子GAG用于表示谷氨酸。在一些实施方案中，密码子GGC用于表示甘氨酸。在一些实施方案中，密码子CAC用于表示组氨酸。在一些实施方案中，密码子ATC用于表示异亮氨酸。在一些实施方案中，密码子CTC用于表示亮氨酸。在一些实施方案中，密码子AAG用于表示赖氨酸。在一些实施方案中，密码子ATG用于表示甲硫氨酸。在一些实施方案中，密码子TTC用于表示苯丙氨酸。在一些实施方案中，密码子CCA用于表示脯氨酸。在一些实施方案中，密码子AGC用于表示丝氨酸。在一些实施方案中，密码子ACT用于表示苏氨酸。在一些实施方案中，密码子TGG用于表示色氨酸。在一些实施方案中，密码子TAC用于表示酪氨酸。在一些实施方案中，密码子GTC用于表示缬氨酸。在一些实施方案中，TAA用作终止密码子。用于设计人基因的改善的密码子使用，第二选择减少G/C含量的密码子优化在这样的实施方案中，16/21密码子在第三位置包含“C或G”(76％)；11/21密码子在第三位置包含“C”(52％)；5/21密码子在第三位置包含“G”(24％)；以及5/21密码子在第三位置包含“A或T”(24％)。在另外其他的实施方案中，21个密码子中的约14-18个密码子在第三个位置包含“C或G”；21个密码子中的约9-13个密码子在第三个位置包含“C”；21个密码子中的约3-7个密码子在第三个位置包含“G”；且21个密码子中的约3-7个密码子在第三个位置包含“A或T”。在一些实施方案中，在编码突变HSV-TK的多核苷酸或其变体的编码区内，如果可能，避免下列稀有密码子：针对丙氨酸的GCG；针对精氨酸的CGA或CGT；针对亮氨酸的TTA或CTA；针对脯氨酸的CCG；针对丝氨酸的TCG；针对苏氨酸的ACG；以及针对缬氨酸的GTA，除非改变稀有密码子序列会产生新剪接受体和/或替代的Kozak位点或增加不想要的限制位点或其他有问题的序列。如果可能要避免的稀有密码子是每氨基酸每密码子的密码子/氨基酸/分数小于或等于0.12的那些。稀有密码子[每氨基酸每密码子的密码子/氨基酸/分数]来自密码子使用数据库的人类数据在一些实施方案中，如本文所述改变密码子导致活性提高约2％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或者更高的百分比。发现高百分比密码子优化改善蛋白质表达，但会增加GC基因含量。密码子优化经评估并确定具有以下特征。由于用全自动密码子优化软件程序获得的结果不能令人满意，故进行定制密码子优化以同时增加蛋白质表达和获得的滴度。初始步骤包括使用密码子优化程序作为第一筛选以将针对正确阅读框的每个密码子设定成在受试物种(包括人类)中最优选的，从而提供“原始”密码子优化。通常，在此过程阶段中的使用中排除任何所需的克隆限制位点。其结果通过在DNA编辑程序中编辑DNA序列并搜索简并密码子如嘧啶(例如，通过搜索“Y”密码子)进一步精化。然后，按下述顺序进行以下的操作：运行“Y”的序列的手动搜索该序列的“Y”运行，一般至少五个或更多个“Y”连续运行。这些序列在给定的序列中突出显示，并且使用该DNA编辑程序来确定包括在寄存器中列出的DNA序列至肽序列的翻译，以确保密码子的改变不影响翻译的蛋白质。评价5个或更多个Y’的运行中的各密码子。当可用时，每个密码子的摆动碱基被转换为对氨基酸最有利的A-G碱基(通常腺嘌呤)，并检查结果。如果该改变的结果产生在3'AG处或附近结束的富含嘌呤的运行，则可手工逆转该改变。如果没有最有利的AT碱基可用于摆动碱基或者它会导致另一序列冲突，则最有利的CG碱基用于该摆动碱基。如果结果是稀有密码子(<10％的使用)，将该密码子移动到框中的下一个可用的密码子。如果另一个密码子变化可以消融推定的受体位点，则进行改变以回到成原始序列。如果没有这样的替代改变是可用的，那么实施初始的改变。一旦这个过程完成后，以5'到3'检查该序列的替代阅读框。在每个阅读框，检查处于ATG密码子3'的5个碱基作为Kozak序列的适合性。如果ATG在所需基因的阅读框中给出了甲硫氨酸，选项限于消融所述Kozak序列，即首先通过将ATG“-1”摆动碱基处的摆动碱基转化为“T”(如果可能)，然后转化“-4”摆动碱基。在罕见的情况下，可以希望将在阅读框中的第二个密码子(如果最初为“AGN”碱基(Ser/Arg))转换为以T(针对丝氨酸)或C(针对精氨酸)开始的密码子。但是，当严格应用上述算法时通常不会遇到这种情况，因为由于“AG”序列对而避免了“AGN”密码子。在替代阅读框不同于消息的阅读框，且围绕其的所述Kozak序列符合共有“CCACCatgG”的情况下，改变框内密码子的摆动碱基以除去起始密码子。这一般(但不总是)作为密码子优化和/或剪接受体消融过程的结果发生。通常执行进程中检查以确保该肽序列是不变的。在最终检查阶段，如果有太多的“稀有”密码子使用(通常为2个或更多个)，可能希望确定何者应优先使用，优选相对于“原始”密码子优化的序列给予较长嘧啶运行的改变。最后，增加任何需要的限制位点，并进行最后的检查以确保在优化过程开始之前该多肽相对于原始序列保持不变，并且任何所希望的限制位点对为了克隆目的而添加的那些保持是独特的。剪接位点修饰通常剪接掉RNA中的内含子以便连接外显子。剪接供体位点是RNA的5'侧上的RNA中的位点，其在剪接过程中除去并且包含在剪接受体位点内被切割并重新连接到核苷酸残基的位点。因此，剪接供体位点是外显子的末端与内含子的起始端之间的连接。通常，在RNA中的剪接供体位点是二核苷酸GU(或相应DNA序列中的GT二核苷酸)。剪接受体位点是RNA的3'侧上的RNA中的位点，其在剪接过程除去并且包含在剪接供体位点内被切割并重新连接到核苷酸残基的位点。因此，剪接受体位点是内含子(通常以二核苷酸AG终止)的末端与下游外显子的起始端之间的连接。在一些实施方案中，本文公开了编码胸苷激酶的核酸序列，其中与剪接供体位点对应的至少一个核苷酸被另一个核苷酸所替代。参见，例如，图1(Chalmers等人,Mol.Ther.4:146-8(2001))。在进一步的实施方案中，剪接受体位点的核苷酸没有被改变。在一些实施方案中，与剪接受体位点对应的至少一个核苷酸被另一个核苷酸所替代。在一些实施方案中，本文公开了编码胸苷激酶的核酸序列，其中与多核苷酸序列(例如，SEQIDNO:1或3)的329和330位处的剪接供体位点核苷酸对应的至少一个核苷酸被另一个核苷酸所替代。在一些实施方案中，在327和555位的两个核苷酸均被其他核苷酸所替代。例如，327位可突变成选自G至A的氨基酸残基。可替代地或另外地，555位可突变成选自G至A的氨基酸残基。在一个实施方案中，修饰的HSV-TK具有SEQIDNO:18的多核苷酸序列，其中的HSV-TK通过以下方式得到改善：HSV-TKNESdmNLSA168H,CO&SCNES＝来自MAP激酶激酶(MAPKK)的核输出序列dmNLS＝双突变的HSV-TK核定位序列CO＝密码子优化的SC＝在327和555处校正的剪接供体/受体位点，下划线序列SEQIDNO:18gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaCTGCGgCCaGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtca在一些实施方案中，本文公开了一种编码胸苷激酶的核酸序列，其中下述核苷酸被另一核苷酸替代：对应于野生型序列的554和555位的剪接受体位点核苷酸的核苷酸中的至少一个，或者对应于野生型序列的662和663位的剪接受体位点核苷酸的核苷酸中的至少一个，或者对应于野生型序列的541和542位的剪接受体位点的核苷酸中的至少一个。例如，541位可突变成选自G至A的氨基酸残基。542位可突变成选自G至A的氨基酸残基。554位可突变成选自G至A的氨基酸残基。555位可突变成选自G至A的氨基酸残基。662位可突变成选自G至A的氨基酸残基。663位可突变成选自G至A的氨基酸残基。在一些实施方案中，野生型HSV-TK编码序列中的至少一种核苷酸如在下面的表1中所述被替代。表1位置突变位置突变84C→A843C→A90C→G846C→A93C→A879C→G96C→G882C→A168C→A885C→A171C→A897C→A378C→T900C→A381C→A961A→T420C→A962G→C423C→A994A→T456C→A995G→C459C→A996C→A462C→A999C→G465C→A1059C→A468C→A1062A→C475A→C1077C→A477C→G1080C→A478T→A481C→T483G→C489C→G495C→A501C→A502T→C503T→A505A→C518C→G522C→A525C→A541A→T542G→C585C→A588C→A591C→A804C→A807C→A822C→A位置突变位置突变837C→AKozak序列位于mRNA内的AUG起始密码子的侧翼并且影响真核核糖体对起始密码子的识别。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含不多于一个Kozak序列。在一些实施方案中，该Kozak序列位于DNA序列的编码部分的上游。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸的Kozak序列被修饰为在哺乳动物细胞中以较高的翻译起始效率产生Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列的修饰在编码的HSV-TK多肽产物中不产生氨基酸置换。在一些实施方案中，该Kozak序列的修饰导致在编码的HSV-TK多肽产物中的至少一个氨基酸置换。在一个实施方案中，修饰的HSV-TK具有SEQIDNO:18的多核苷酸序列。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含插入一个或多个限制位点的修饰。用于插入一个或多个限制位点的最佳位点可凭经验确定和/或使用计算机程序分析序列来确定。在一个非限制性实施方案中，第一限制位点插入Kozak和ATG起始位点上游，且第二限制位点在序列的3'端插入。参见，例如，SEQIDNO：18，下面下划线标出的部分。HSVTKNESdmNLSA168H,CO&SCNES＝来自MAPKK的核输出序列dmNLS＝双突变的核定位序列CO＝密码子优化的SC＝在327和555处校正的剪接，之前描述的Kozak序列，之前描述的限制位点，加下划线并指定为:(GCGGCCGCACCGGTACGCGT＝Not-I、Age-I和MLU-I)(GGATCCCTCGAGAAGCTT＝BamH-I、Xho-I和Hind-III)SEQIDNO:18gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaCTGCGgCCaGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtca其他剪接位点修饰在下面的实施例中公开，并且被考虑作为可以在所要求保护的方法中使用的修饰TK序列而纳入。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、60、75、80、85、90、95、100个或更多个密码子置换。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、60、75、80、85、90、95、100个或更多个密码子置换，其中该密码子置换包括在哺乳动物细胞中比在该位置的野生型密码子具有更高使用频率的密码子置换。然而，在一些实施方案中，可以根据具体情况针对各个氨基酸选择较不利的密码子。在一些实施方案中，包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、60、75、80、85、90、95、100个或更多个密码子置换的编码HSV-TK的多核苷酸序列与SEQIDNO:1或3具有小于约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中序列同一性利用全局比对法在编码序列的全长上来确定。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如，SEQIDNO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、60、75、80、85、90、95、100个或更多个密码子置换，其中该密码子置换包括在哺乳动物细胞中比在该位置的野生型密码子具有更高使用频率的密码子置换。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQIDNO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、60、75、80、85、90、95、100个或更多个密码子置换，其中置换的密码子具有大于或等于约0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35或更高的使用频率。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQIDNO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含少于约45、40、35、30、25、20个或更少的密码子，其中密码子具有小于约0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25的使用频率。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQIDNO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多的密码子，该密码子具有大于或等于约0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35或更高的使用频率。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQIDNO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多的密码子，该密码子在哺乳动物细胞中具有最高的使用频率。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQIDNO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含少于约21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％或更少具有小于约0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25的使用频率的密码子。在一些实施方案中，该多核苷酸序列包含少于约21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％或更少在哺乳动物细胞中具有小于约0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25的使用频率的密码子。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQIDNO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含密码子置换，其中至少35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的密码子相比于野生型序列已发生改变。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含密码子置换，其中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的密码子已改变为相比于野生型序列在哺乳动物细胞中具有更高的使用频率的密码子。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQIDNO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含密码子置换，其中至少19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的密码子已改变成与野生型序列相比在哺乳动物细胞中具有最高使用频率的密码子。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQIDNO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。非保守突变来自所选的疱疹病毒的病毒胸苷激酶基因可以如下所述容易地分离和突变，以构建编码包含一个或多个突变的编码胸苷激酶的核酸分子，该胸苷激酶相比于未突变的野生型胸苷激酶，提高了胸苷激酶的生物活性。可使用本领域已知的任何试验(包括，例如测定核苷类似物的摄取速率或确定核苷或核苷类似物的磷酸化速率)容易地测定胸苷激酶的生物活性。此外，可以容易地选择以其他生物学性质如热稳定性和蛋白质稳定性表征的胸苷激酶突变体。在一些实施方案中，修饰编码HSV-TK的多核苷酸序列以去除或修饰预测的信号序列。在一些实施方案中，修饰多核苷酸以去除或修饰核定位序列(NLS)。在一些实施方案中，修饰多核苷酸以去除核定位序列。在一些实施方案中，修饰多核苷酸以修饰NLS而使其不再起到将HSV-TK只定位到细胞核的作用。在一些实施方案中，HSV-TK多肽序列在氨基酸残基167、168或二者处突变。在一个实例中，该序列在氨基酸残基167处突变。在另一个实例中，该序列在氨基酸残基168处突变。在另一个实例中，该序列在氨基酸残基167和168处突变。氨基酸残基167可以突变成丝氨酸或苯丙氨酸。氨基酸残基168可以突变成组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸或苯丙氨酸。在一些实施方案中，HSV-TK多肽序列在氨基酸残基25和/或26处突变。在氨基酸残基25和/或26处可以突变为选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，HSV-TK多肽序列在氨基酸残基32和/或33处突变。氨基酸残基32和/或33可以突变为选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，HSV-TK多肽在氨基酸残基25、26、32和/或33处突变。氨基酸残基25、26、32和/或33可以突变成选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。可以对比SEQIDNO:2或4的多肽序列进行氨基酸残基修饰。根据本发明，提供了由上述核酸分子编码的突变胸苷激酶酶，以及能够表达此类分子的载体。在一些实施方案中，提供了包含与本发明的核酸分子可操作地连接的启动子的表达载体。在一些实施方案中，该载体是能够引导核酸分子的表达的病毒载体。这样的病毒载体的代表性实例包括单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、痘载体、细小病毒载体、杆状病毒载体和逆转录病毒载体。在一些实施方案中，提供了能够引导核酸分子的表达的病毒载体，该核酸分子编码包含一个或多个突变的胸苷激酶酶，至少一个突变编码氨基酸置换，与未突变的(即，野生型)胸苷激酶相比，其提高了胸苷激酶的生物活性。在一些实施方案中，本文提供的核酸分子编码这样的胸苷激酶，该胸苷激酶能够以比由野生型胸苷激酶进行的核苷类似物的磷酸化水平高至少10％的水平将核苷类似物磷酸化。在一些实施方案中，胸苷激酶能够以比由野生型胸苷激酶进行的核苷类似物的磷酸化水平高至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的水平将核苷类似物磷酸化。合适的核苷类似物的代表性实例包括更昔洛韦、阿昔洛韦、泛昔洛韦、布昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦、三氟胸苷、1-[2-脱氧,2-氟,β-D-呋喃阿拉伯糖基]-5-碘尿嘧啶、ara-A、araT、1-β-D-呋喃阿拉伯糖基胸腺嘧啶、5-乙基-2'-脱氧尿苷、5-碘-5'-氨基-2,5'-二脱氧尿苷、碘苷、AZT、AIU、双脱氧胞苷和AraC。在一些实施方案中，改进的TK突变体缺乏胸苷激酶活性。在一些实施方案中，公开的HSV-TK突变体的胸苷激酶活性的Km值为至少2.5μm。在一些实施方案中，公开的HSV-TK突变体的胸苷激酶活性的Km值为至少5μm、至少10μm、至少15μm、至少20μm、至少25μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm、至少100μm、至少150μm、至少200μm、至少250μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm或至少1000μm。在一些实施方案中，公开的HSV-TK突变体相对于野生型HSV-TK的百分比Km为至少至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％。在本发明的一个实施方案中，提供了HSV-TK突变体的截短的衍生物。例如，定点诱变可以容易地进行以缺失胸苷激酶突变体的N末端45个氨基酸，由此构建保持其生物活性的突变体的截短形式。针对胸苷激酶突变体的衍生物的表达而构建的核苷酸序列中的突变应保持编码序列的阅读框相位。此外，该突变优选地不产生可杂交产生二级mRNA结构(如环或发夹)的互补区域，该二级mRNA结构将不利地影响受体mRNA的翻译。此类衍生物可以使用很多种技术容易地构建，包括上文讨论的那些技术。修饰的胸苷激酶突变体通过使用本文描述的方法，本发明人确定优化的HSV-TK基因的大多数候选物显示与逆转录病毒表达系统兼容，并产生了生物学上有用的逆转录病毒滴度。此外，并入了这些优化中的大多数的优化的HSV-TK基因(SEQIDNO：18)表现出前药GCV酶活性和选择性供其在逆转录病毒转导递送后杀死癌细胞的能力。经密码子优化和剪接校正的突变HSV-TK基因A168H显示具有最高的GCV介导的癌症杀伤活性(SEQIDNO：12、16、18或22)。这种HSV-TK基因A168H和在氨基酸159-161处从LIF突变为IFL的相同形式表现出GCV介导的癌细胞杀伤活性。经密码子优化和剪接校正的突变HSV-TK基因A167F(SEQIDNO:13、17或19)在逆转录病毒转导递送后具有非常高的GCV介导的癌症杀伤活性，但更惊人的是不具有胸苷激酶活性，如通过在用HAT培养基选择的3T3TK(-)细胞中进行逆转录病毒转导递送后表达该基因所确定的。据我们所知，这是曾经生物学评价的，对GCV活化而言最具GCV选择性、且其不具有胸苷活性(HAT试验)的HSV-TK合成基因产物。双突变HSV-TK基因A167F+A168H(SEQIDNO:14)出人意料地消除GCV和胸苷酶活性，即表现出非常小的GCV介导的癌症杀伤活性和非常小的胸苷活性(HAT试验)，。本发明人确定，可产生基因的功能性HSV-TK融合体，所述基因如细菌胞嘧啶脱氨酶、酵母胞嘧啶脱氨酶、新霉素磷酸转移酶，并可包括接头序列和保留HSV-TKGCV介导的癌细胞杀伤活性。在一个实施方案中，可制备具有GCV介导的癌症杀伤活性的密码子优化的HSV-TK基因，其保留未与一个或多个其他治疗性基因融合的一个或多个核定位序列。本文所述的优化的HSV-TK基因的另外的修饰和/或评价可以包括以下的一个或多个：HSV-TK内的已知核定位序列的去除；提高的前药GCV酶活性和选择性供其提高下述能力：杀死癌细胞，评估多个标签的应用，将HSV-TK的蛋白质和接头与其他基因和蛋白质融合，HSV-TK优化的基因与其他优化的自杀和癌症杀伤基因在癌细胞中的共表达，在Reximmune-C型逆转录病毒载体系统中包括优化的HSV-TK基因；Reximmune-C型GMP产物的产生和测试，或它们的任意组合。示例性的多核苷酸序列在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸序列包含核输出信号。例如，多核苷酸序列可以包含TK168dmNES。在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含一个或多个剪接位点修饰。在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TKA167Fsm(SEQIDNO:13)。在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TKA168Hsm(SEQIDNO:12)。在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TKA167Fdm(SEQIDNO:17)。在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TKA168dm(SEQIDNO:16)。在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TKA167Fdm和NES(SEQIDNO:19)。在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TKA168Hdm和NES(SEQIDNO:18)。在这样的实施方案中，该序列包含HSV-TKA168H。在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TK，其中这样的载体包含升级的底物结合域和mNLS/NES组。在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TK，其中该载体包含选择性标记、发光、荧光或生物发光基因和/或一种或多种杀伤基因。在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含至少两个修饰。胸苷激酶突变体的构建本发明的胸苷激酶突变体可以通过使用多种技术来构建。例如，可以通过合成侧翼为使得能够连接至天然序列的片段的限制位点的含有突变序列的寡核苷酸，而在特定的基因座处引入突变。连接后，所得的重构序列编码具有所需氨基酸插入、置换或缺失的衍生物。或者，寡核苷酸引导的位点特异性(或区段特异性)诱变程序可被用来提供根据所需的置换、缺失或插入而改变特定密码子的改变的基因。胸苷激酶突变体的缺失或截短衍生物也可以通过利用邻近于所需缺失的方便的限制性内切核酸酶位点构建。进行限制酶切后，可将突出端补平，并且再连接该DNA。进行上述变化的示例性方法由Sambrook等人(Molecularcloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)公开。本文所公开的胸苷激酶突变体的其他衍生物包括胸苷激酶突变体与其他蛋白质或多肽的偶联物。这可以通过例如N-末端或C-末端融合蛋白的合成而实现，所述融合蛋白可以添加以促进胸苷激酶突变体的纯化或鉴别(参见美国专利号4,851,341，还参见Hopp等人,Bio/Technology6:1204,1988.)。HSV介导的杀伤的改善在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列还包括编码次级治疗剂或多肽的序列。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽是诊断或治疗剂或多肽。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽是额外的“自杀蛋白”，其导致细胞本身或在其他化合物的存在下的死亡。在一些实施方案中，第二自杀基因选自青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、羧肽酶A、亚麻苦苷酶(也称为β-葡糖苷酶)、大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌Deo基因、胞嘧啶脱氨酶、VSV-tk、IL-2、硝基还原酶(NR)、羧基酯酶、β-葡糖醛酸酶、细胞色素p450、β-半乳糖苷酶、白喉毒素A链(DT-A)、羧肽G2(CPG2)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和脱氧胞苷激酶(dCK)。在一些实施方案中，第二自杀蛋白将前药转换成有毒的化合物。如本文所用，“前药”是指在本文公开的方法中使用的任何化合物，其可以被转化成有毒产物，即，对肿瘤细胞是有毒的。该前药被自杀蛋白转化成有毒产物。这样的前药的代表性实例包括：针对胸苷激酶的FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或携带2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦样、更昔洛韦样和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物，针对氧化还原酶的异环磷酰胺；针对VZV-TK的6-甲氧基嘌呤阿糖胞苷；针对胞嘧啶脱氨酶的5-氟胞嘧啶；针对β-葡糖醛酸酶的多柔比星；针对硝基还原酶的CB1954和硝基糠腙；和针对羧肽A的N-(氰基乙酰基)-L-苯丙氨酸或N-(3-氯丙酰基)-L-苯丙氨酸。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽选自包括但不限于以下的组：细胞周期调节剂、抑制细胞周期蛋白的药剂，例如细胞周期蛋白A和/或D基因的反义多核苷酸，生长因子，例如，诸如，表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF、TGF-α、TGF-β和成纤维细胞生长因子，细胞因子，包括但不不限于白介素1到13和肿瘤坏死因子，抗凝血剂，抗血小板剂，消炎剂，抗血管生成因子，肿瘤抑制蛋白，凝血因子，包括因子VII、因子VIII和因子IX，蛋白S、蛋白C，抗凝血酶III，vonWillebrand因子，囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，和阴性选择标记。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽是癌抑制物，例如p53或Rb或编码此蛋白质或多肽的核酸。次级治疗试剂或多肽的其他实例包括促凋亡治疗性蛋白质和多肽，例如P15、P16或者p21/WAF-1。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽是细胞因子。细胞因子的实例包括：GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)；TNF-α(肿瘤坏死因子α)、干扰素，包括但不限于：IFN-α和IFN-γ；及白介素，包括但不限于，白介素1(IL1)、白介素-β(IL-β)、白介素-2(IL2)、白介素-4(IL4)、白介素-5(IL5)、白介素-6(IL6)、白介素-8(IL8)、白介素-10(IL10)、白介素-12(IL12)、白介素-13(IL13)、白介素-14(IL14)、白介素-15(IL15)、白介素-16(IL16)、白介素-18(IL18)、白介素-23(IL23)、白介素-24(IL24)，尽管其他实施方案在本领域中是公知的。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽是促凋亡的。促凋亡蛋白质或多肽的实例包括但不限于：Bax、Bad、Bik、Bak、Bim、细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)、Puma、CT10调节激酶(CRK)、Bok、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、前列腺凋亡响应蛋白-4(Par-4)、Smac、激酶Cδ、Fas、抑制性PAS结构域蛋白(IPAS)和Hrk。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽参与细胞与细胞之间的通信。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽参与间隙细胞连接。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽是连接蛋白(connexin)。在一些实施方案中，治疗性蛋白或多肽是选自连接蛋白43、连接蛋白32和连接蛋白26的连接蛋白。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽由人受体基因PiT-2(SLC20A2)编码。包括在Reximmune-C1和2逆转录病毒载体中的双向性包膜(AmphotropicEnvelope)基因产物在靶细胞感染前与PiT-2受体结合。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽由人受体基因PiT-1(SLC20A1)编码。长臂猿白血病病毒(GALV)包膜(GibbonApeLuekemiaVirus(GALV)Envelope)基因产物在靶细胞感染前与PiT-1受体结合。在一些实施方案中，次级治疗剂或多肽是逆转录病毒蛋白的N-末端截短物，其中该N-末端截短物包含包膜蛋白的功能受体结合域。增加细胞内通信以改善治疗旁观者效应的增加在一些实施方案中，本文公开了增加HSV-TK前药底物旁观者效应的方法。如本文所用，“旁观者效应”是指如下的现象：通过该现象，在诱导HSV-TK表达在HSV-TK阳性细胞中的表达后，HSV-TK阳性细胞对相邻的HSV-TK阴性细胞施加杀伤作用。在一些实施方案中是例如在用GCV治疗后，连同增加间隙连接细胞内通信，增加HSV-TK前药介导的旁观者效应的方法。在一些实施方案中，HSV-TK前药介导的旁观者效应使杀伤率增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。间隙连接是具有间隙连接通道簇的细胞膜的区域，所述间隙连接通道将一个细胞的细胞质与另一个细胞的细胞质直接连接。间隙连接通道由通过两个相邻细胞的每一个提供的两个半通道(连接子)构成。连接子最经常包含六个连接蛋白，这是具有包含四个跨膜域、二个胞外环和胞质环的基本结构的大家族的蛋白质。间隙连接用于多种生理作用，如生长控制和体内稳态(即，离子、营养物质和流体在细胞间的快速平衡)。此外，间隙连接充当能够传播电信号的细胞中的电突触，所述细胞如心肌细胞、平滑肌细胞和神经元。一旦磷酸化，GCV可通过GJ行进到共享连接的邻近的细胞。GCV-P将在那些细胞中进一步磷酸化，并如在HSK-TK表达细胞中触发细胞死亡。旁观者效应的程度取决于间隙连接的存在，因此它会在细胞类型之间有所不同。但是参见，Dahle等人，“GapjunctionalintercellularcommunicationisnotamajormidiatorinthebystandereffectinphotodynamictreatmentofMDCKIIcells.”RadiationRes.154:331-341(2000年9月)。病毒TK酶对前药更昔洛韦(GCV)是敏感的，所述前药类似于DNA碱基鸟嘌呤。当GCV被添加到细胞培养基中时，病毒TK(但不是宿主非病毒TK)将GCV磷酸化，将其转化为药物，其现在是磷酸化的，因为其与鸟嘌呤的相似性而将会与dGTP竞争向DNA中的并入。并入会导致DNA链合成的终止。GCV-monoP向非癌细胞中的转移对它们没有毒性，除非它们正在活跃地分裂。当用高水平GCV药物治疗时，处于危险中的正常细胞仅仅是与病毒TK表达细胞紧密接触的那些。在一些实施方案中，本文公开了增加受试者中的病毒胸苷激酶介导的靶细胞杀伤的方法，该方法包括连同增加间隙连接细胞内通信(GJIC)的处理一起，递送编码HSV-TK的载体颗粒。在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，增加GJIC的处理包括向细胞递送编码至少一个间隙连接亚单位的多核苷酸序列。在一些实施方案中，该至少一个间隙连接亚单位是野生型或突变蛋白质。在一些实施方案中，所述间隙连接亚单位选自野生型或突变连接蛋白43、连接蛋白30、连接蛋白26。在其他实施方案中，所述间隙连接亚单位是连接蛋白30.3、连接蛋白31、连接蛋白31.1、连接蛋白32、连接蛋白33、连接蛋白37、连接蛋白40、连接蛋白45、连接蛋白46和连接蛋白50。在一些实施方案中，对间隙连接亚单位进行修饰以防止翻译后修饰。在一些实施方案中，增加GJIC的处理包括向细胞递送编码E-钙粘蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，增加GJIC的处理包括向受试者递送化合物。在一些实施方案中，增加GJIC的处理包括向受试者递送来自以下的化合物：吉西他滨；cAMP；视黄酸；类胡萝卜素；糖皮质激素，类黄酮，芹菜素，和/或洛伐他汀。在一些实施方案中，增加GJIC的处理包括蛋白酶体抑制。在一些实施方案中，增加GJIC的处理包括通过施用N-乙酰基-Leu-Leu-NLE-CHO(ALLN)和/或氯喹的蛋白酶体抑制。在一些实施方案中，增加GJIC的处理包括放射治疗。在一些实施方案中，增加GJIC的处理包括电治疗。检测方法在一些实施方式中，本文公开了测量HSV-TK介导的旁观者效应的方法，该方法包括：1)用编码HSV-TK和第一荧光蛋白的多核苷酸序列转染细胞；b)用编码可与第一荧光蛋白在光学上辨别的第二荧光蛋白的第二多核苷酸序列转染细胞；c)用滴定剂量的更昔洛韦处理细胞；和d)测量所述第一荧光蛋白和第二荧光蛋白的表达的相对量。在一个实施方案中，红色荧光蛋白(RFP)用于定量用第一荧光蛋白和第二荧光蛋白两者转导的靶肿瘤细胞的数目，而可用来选择其中全部表达和HSV-TK两者的肿瘤细胞群体。RFP是可商购的且设想在此处使用(参见，例如，在下面参考文献1-14中描述的RFP)。在另一个实施方案中，绿色荧光蛋白(GFP)用于定量转导的靶肿瘤细胞的数目。GFP是可商购的且设想在此处使用，包括但不限于增强绿色荧光蛋白(EGFP)。质粒和HSV-TK的产生在一些实施方案中，本文公开了编码HSV-TK的核酸分子，或其突变体和/或衍生物，它们可操作地与合适的转录或翻译调节元件连接。在一些实施方案中，合适的调节元件来自于细菌、真菌、病毒、哺乳动物、昆虫或植物基因。适当的调节元件的选择依赖于所选择的宿主细胞，并且在一些实施方案中，包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，和核糖体结合序列，包括翻译起始信号。本文所述了质粒，其含有如上所述的编码HSV-TK的核酸序列或其突变体和/或变体。在一些实施方案中，本文公开了编码与第二肽组分融合的HSV-TK的质粒。在一些实施方案中，第二肽组分是治疗剂或多肽。在一些实施方案中，第二肽组分是诊断多肽。在一些实施方案中，本文公开了多种适合于引导本文公开的编码HSV-TK的核酸分子表达的病毒和非病毒载体。在一些实施方案中，本文公开了用于转染和生产用于治疗和诊断程序中的递送载体或治疗载体的质粒。在一般情况下，这样的质粒提供了编码本文公开的靶向载体的病毒或非病毒组分的核酸序列。这样的质粒包括编码例如MoMLV包膜蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，MoMLV包膜蛋白被修饰以包含胶原蛋白结合域。额外的质粒可包括可操作地连接到启动子的核酸序列。该序列一般编码病毒gag-pol多肽。该质粒还包括可操作地连接到启动子的核酸序列，且所述序列编码对生产细胞赋予抗药性的多肽。复制起点也包括在内。在一些实施方案中，额外的质粒包含如本文所公开的改进的HSV-TK编码序列、5'和3'长末端重复序列；Ψ逆转录病毒包装序列、5'LTR启动子上游的CMV增强子、可操作地连接至启动子的核酸序列和SV40复制起点。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸是在合适的启动子的控制下。合适的启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子；劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子；组蛋白启动子；polIII启动子，β肌动蛋白启动子；诱导型启动子，如MMTV启动子，金属硫蛋白启动子；热休克启动子；腺病毒启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；B19细小病毒启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR；人生长激素启动子，和MxIFN诱导型启动子。在一些实施方案中，该启动子是组织特异性启动子。在一些实施方式中，组织特异性启动子选自酪氨酸酶相关的启动子(TRP-1和TRP-2)、DF3增强子(针对乳房细胞)、SLPI启动子(分泌性白细胞蛋白酶抑制剂—在许多类型的癌中表达)、TRS(组织特异性调节序列)、甲胎蛋白启动子(分别对正常肝细胞和转化的肝细胞是特异性的)、癌胚抗原启动子(用于胃肠道、肺、乳房和其他组织的转化细胞)、酪氨酸羟化酶启动子(针对黑素细胞)、用于神经母细胞瘤中的胆碱乙酰转移酶或神经元特异性烯醇酶启动子、胶质成纤维细胞瘤的调节序列、酪氨酸羟化酶启动子、c-erbB-2启动子、PGK启动子、PEPCK启动子、乳清酸性启动子(乳房组织)和酪蛋白启动子(乳房组织)和脂肪细胞P2启动子。在一些实施方案中，该启动子是病毒特异性启动子(例如，逆转录病毒启动子，以及其他，如HIV启动子)、肝炎、疱疹(例如，EBV)。在一些实施方案中，该启动子是天然的HSV-TK启动子。在一些实施方案中，该启动子是细菌、真菌或寄生虫(如疟疾)特异性启动子，其用以靶向被病毒、细菌、真菌或寄生虫感染的特定细胞或组织。在一些实施方案中，递送载体或治疗载体可包括靶向部分，该靶向部分将递送载体或治疗载体靶向期望的细胞或系统。在一些实施方案中，靶向部分是指由递送载体或治疗载体表达的配体，所述递送载体或治疗载体与递送媒介物相关联并且将媒介物靶向细胞或组织。在一些实施方案中，该配体可以包括但不限于，与暴露在靶向细胞或系统之中或之上的细胞组分结合的抗体、受体和蛋白质。在一些实施方案中，暴露的细胞组分可包括胶原蛋白。在一些实施方案中，与暴露的细胞组分结合的配体包含含有胶原蛋白结合域的蛋白质。本文所公开的质粒可以通过本领域技术人员公知的基因工程技术来产生。此外，该质粒可容易地由多种原核和真核宿主细胞表达，该宿主细胞包括细菌、哺乳动物、酵母或其他真菌、病毒、昆虫或植物细胞。用于转化或转染这些细胞以表达外来DNA的方法是本领域中公知的(参见，例如，Itakura等人,美国专利号4,704,362；Hinnen等人,PNASUSA75:1929-1933,1978；Murray等人,美国专利号4,801,542；Upshall等,美国专利号4,935,349；Hagen等人,美国专利号4,784,950；Axel等人,美国专利号4,399,216；Goeddel等人,美国专利号4,766,075；和Sambrook等人，MolecularCloning.ALaboratoryManual,2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989；关于植物细胞参见Czako和Marton,PlantPhysiol.104:1067-1071,1994；和Paszkowski等人,Biotech.24:387-392,1992)。用于哺乳动物细胞的转染的方案是本领域普通技术人员所熟知的。代表性的方法包括磷酸钙和/或磷酸镁介导的转染、电穿孔、脂转染、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和原生质体融合介导的。在一些实施方案中，HSV-TK，或其突变体，是通过培养上面描述的宿主/载体系统以表达重组胸苷激酶突变体而制备的。重组产生的胸苷激酶突变体可以根据本领域中公知的方法进一步纯化。在一些实施方案中，本文中描述的核酸分子被引入多种宿主细胞中。这样的宿主细胞的代表性例子包括植物细胞、真核细胞和原核细胞。在一些实施方案中，核酸分子被引入来自脊椎动物或温血动物如人、猕猴、狗、牛、马、猪、绵羊、大鼠、仓鼠、小鼠、鱼细胞或其任何杂种的细胞中。在一些实施方案中，本文中描述的核酸分子被引入哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞选自COS、BHK、CHO、HeLa、293和NS-1细胞。在一些实施方案中，用于引导在哺乳动物细胞中的表达的合适的表达载体包含启动子，以及其他转录和翻译控制序列。常见的启动子包括SV40、MMTV、金属硫蛋白-1、腺病毒E1a、巨细胞病毒立即早期启动子和巨细胞病毒立即晚期启动子。在一些实施方案中，本文中描述的核酸分子引入到酵母或真菌细胞中。适用于实施本发明的酵母和真菌宿主细胞尤其包括，粟酒酵母(Saccharomycespombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母属和克鲁维酵母属，和曲霉属的各个种。用于酵母和真菌的合适的表达载体尤其包括，针对酵母的YCp50，和amdS克隆载体pV3。在一些实施方案中，酵母的转化通过制备酵母与DNA的球粒体或通过用碱性盐如LiCl处理来完成。在一些实施方案中，真菌的转化使用聚乙二醇来进行。在一些实施方案中，本文中描述的核酸分子被引入细菌细胞中。适用于实施本发明的细菌宿主细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌，和假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各个种，以及许多其他本领域普通技术人员公知的细菌种。细菌宿主细胞的代表性例子包括DH5α(Stratagene,LaJolla,Calif.)。在一些实施方案中，细菌表达载体包含在宿主细胞中起作用的启动子、一个或多个表型选择性标记和细菌复制起点。代表性的启动子包括β内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统、T7RNA聚合酶启动子、λ启动子、trp启动子和tac启动子。代表性选择性标记包括各种抗生素抗性标记如卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。在一些实施方案中，适于转化宿主细菌细胞的质粒尤其包括pBR322，pUC质粒pUC18、pUC19、pUC118、pUC119，pNH8A、pNH16a、pNH18a，和BluescriptM13(Stratagene,LaJolla,Calif.)在一些实施方案中，本文中描述的核酸分子在非人转基因动物如小鼠、大鼠、兔、羊、狗和猪中表达。在一些实施方案中，表达单元，包括待与适当定位的表达控制序列一起表达的核酸分子，例如通过显微注射被引入到受精卵的前核中。在一些实施方案中，通过对来自组织样品的DNA的印迹分析来检测注射的DNA的整合。在一些实施方案中，引入的DNA并入动物的种系使得其被传递给该动物的后代。在一些实施方案中，组织特异性表达是通过组织特异性启动子的使用，或通过诱导型启动子的使用而实现的，所述启动子例如是金属硫蛋白基因启动子，其允许转基因的调节表达。在一些实施方案中，本文中描述的核酸分子通过多种机制被引入宿主细胞中，所述机制包括例如磷酸钙介导的转染；脂质转染；基因枪；电穿孔；逆转录病毒，腺病毒，原生质体融合介导的转染或DEAE-葡聚糖介导的转染。载体及其制备方法本文公开了载体颗粒，其包含如上所述的改进的HSV-TK编码序列，其将在期望的细胞中表达。在一些实施方案中，该载体颗粒是病毒载体颗粒。在一些实施方案中，该病毒载体颗粒是逆转录病毒载体颗粒。在一些实施方案中，包含改进的HSV-TK编码序列的载体颗粒除了改进的HSV-TK的编码序列外还含有或表达多种附加的核酸分子。在一些实施方案中，所述载体另外表达淋巴因子、反义序列、毒素或“替代”蛋白质(例如，腺苷脱氨酶)。淋巴因子的代表性实例包括，例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、α-干扰素、β-干扰素、γ干扰素和肿瘤坏死因子(TNF)。反义序列的代表性实例包括但不限于：反义myc、反义p53、反义ras以及阻断病毒如HIV、HBV和HCV的表达或产生的反义序列。毒素的代表性实例包括但不限于：蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素、霍乱毒素、白树毒素、肉毒杆菌、美洲商陆抗病毒蛋白、小麦毒蛋白、志贺氏菌毒素和假单胞菌外毒素A。自杀基因的代表性实例包括但不限于：胞嘧啶脱氨酶、VSV-tk、IL-2、硝基还原酶(NR)、羧基酯酶、β-葡糖醛酸酶、细胞色素p450、β-半乳糖苷酶、白喉毒素A链(DT-A)、羧肽G2(CPG2)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和脱氧胞苷激酶(dCK)。在一些情况下，该载体另外表达酵母和/或细菌胞嘧啶脱氨酶。另外的治疗序列包括但不限于，酵母或细菌胞嘧啶脱氨酶、其他自杀基因、p53和其他凋亡基因、鸟苷酸激酶、IL-12和其他免疫刺激物或细胞因子基因、GFP、RFP、iRFP、LUC2、GLUC和其他荧光和生物发光基因、细胞周期蛋白A、D和其他细胞周期调节基因、病毒基因、细菌基因、人类基因、合成的基因、siRNA、RNAi、微RNA、基因的反义、抑制或刺激序列、从文库策略捕获的基因、重复序列、复制序列、启动子或增强子序列、DNA结合序列、任何治疗序列等。在一些实施方案中，纳入编码针对γ逆转录病毒的受体的多核苷酸序列。在本申请中本文公开了证实双嗜性病毒载体包膜基因产物的受体结合域(RBD)与靶细胞的细胞膜上的PiT-2受体结合并允许增强病毒载体转导的实验。使用PiT-2的拓扑模型和针对CHO-K1和BHK细胞的鼠白血病病毒(A-MuLV)受体结合测定，Feldman等人(EidenMV.JVirol.(2004)78:595–602)确定了人PiT-2受体的细胞外结构域1(ECD1)对于双嗜性病毒结合和感染至关重要。Bottger和Petersen(2004)的研究表明，结合病毒所需的部分可以被缩小至182aaN-Term区和170aaC-Term区。因此，在选择实施方案中，本文还提供了编码来自人单纯疱疹病毒(HSV-TK)的突变形式的胸苷激酶的多核苷酸序列，其中编码的HSV-TK包括多核苷酸序列以编码PiT-2、PiT-1、MCAT和由γ逆转录病毒使用的其他受体。间隙连接细胞内通信在一些实施方案中，载体颗粒还包含如本文所述的增加间隙连接细胞内通信(GJIC)的处理。在一些实施方案中，载体颗粒还表达一种或多种基因，其编码促进或增加胸苷激酶的生物活性的蛋白质。在一些实施方案中，载体还包含编码DNA聚合酶(例如，疱疹DNA聚合酶)和/或鸟苷酸激酶的序列。用于实现基因治疗的最常用的递送系统之一涉及病毒载体，最常见的是腺病毒和逆转录病毒载体。示例性的基于病毒的载体包括但不限于，重组逆转录病毒(参见，例如，WO90/07936；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；美国专利号5,219,740；WO93/11230；WO93/10218；美国专利号4,777,127；英国专利号2,200,651；EP0345242；和WO91/02805；关于重组逆转录病毒的公开内容，其各自通过引用并入)，基于α病毒的载体(例如，辛德毕斯(Sindbis)病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCCVR-67；ATCCVR-1247)、罗斯河病毒(ATCCVR-373；ATCCVR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCCVR-923；ATCCVR-1250；ATCCVR1249；ATCCVR-532))和腺相关病毒(AAV)载体(参见，例如，WO94/12649,WO93/03769；WO93/19191；WO94/28938；WO95/11984和WO95/00655)。如由Curiel(Hum.GeneTher.(1992)3:147)描述的连接到被杀死的腺病毒的DNA的施用也可以使用。逆转录病毒通常具有三个共同的开放阅读框，gag、pol和env，其分别编码基质、gag和核衣壳结构蛋白，编码包括逆转录酶、整合酶和蛋白酶在内的酶，和编码包膜蛋白和跨膜促融合蛋白。一般而言，逆转录病毒载体颗粒由反式地提供必需的gag、pol和env基因产物的包装细胞系所产生。这种方法导致逆转录病毒载体颗粒的产生，该颗粒转导哺乳动物细胞，但在它们整合到该细胞的基因组中之后不能进一步复制。为基因递送的目的，可以从对靶细胞天然的病毒或从对靶细胞非天然的病毒来开发病毒颗粒。通常，理想的是使用非天然病毒载体，而不是天然病毒载体。虽然天然病毒载体可能具有对靶细胞天然的亲和力，但这类病毒造成更大的危害，因为它们具有在靶细胞内繁殖的更大潜力。在这方面，动物病毒载体，其中它们非天然地设计用于在人细胞中繁殖，可以用于将基因递送至人类细胞。但是，为了获得用于基因递送的此类动物病毒载体的足够产率，有必要在天然动物包装细胞中进行生产。但是，以这种方式产生的病毒载体，通常缺乏可以提供对人类细胞的向性的作为包膜的一部分或作为衣壳的一部分的任何组分。例如，用于生产非人类病毒载体如诸如MMLV的亲嗜性(ecotropic)小鼠(鼠)逆转录病毒的目前实践，是在小鼠包装细胞系中产生的。必须提供人细胞向性所需的另一组分。在一般情况下，病毒载体(无辅助病毒)的繁殖在包装细胞中进行，其中包装组分的核酸序列稳定整合入细胞基因组内，且编码病毒核酸的核酸被引入此细胞系中。在一些实施方案中，逆转录病毒质粒载体包括包含改进的HSV-TK编码序列的多核苷酸，且包括包含改进的HSV-TK编码序列的多核苷酸的表达载体被转导到包装细胞系中，该包装细胞系包括编码gag、pol和野生型(即未修饰的)env逆转录病毒蛋白的核酸序列。这样的包装细胞系的例子包括但不限于，PE501,PA317(ATCCNo.CRL9078),'-2,-AM,PA12,T19-14X,VT-19-17-H2,TCRE,TCRIP,GP+E-86,GP+envAml2和如在Miller,HumanGeneTherap,Vol.1,pgs.5-14(1990)中描述的DAN细胞系，其通过引用全文并入本文，或293T细胞系(美国专利号5,952,225)。载体可通过本领域中已知的任何手段被转染入包装细胞中。这样的手段包括但不限于电穿孔和使用脂质体，例如如上所述，和CaPO4沉淀。这类生产细胞通常产生感染性逆转录病毒载体颗粒，其包括第一或未修饰的野生型逆转录病毒包膜蛋白、嵌合逆转录病毒包膜蛋白以及编码治疗剂或诊断剂的多核苷酸。在一些实施方案中，提供了包装细胞，其包括编码gag和pol蛋白的多核苷酸，编码不含非逆转录病毒肽的第一逆转录病毒包膜蛋白(其在一些实施方案中，是野生型逆转录病毒包膜蛋白)的多核苷酸，和编码嵌合逆转录病毒包膜蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，用于产生包括第一和嵌合包膜蛋白的逆转录病毒载体颗粒的生产细胞，通过向此包装细胞引入逆转录病毒载体颗粒或逆转录病毒质粒载体而生成，在每种情况下，其包括编码治疗剂或诊断剂的多核苷酸的。在一些实施方案中，生产细胞系因此生成感染性逆转录病毒载体颗粒，其包括包含改进的HSV-TK编码序列的多核苷酸。在一些实施方案中，本文公开了用于生产病毒载体的试剂盒，该试剂盒包括：a)含有包含编码逆转录病毒包膜蛋白的核酸序列的第一质粒的容器，其中所述核酸序列可操作地连接至启动子；b)含有包含以下元件的第二质粒的容器：可操作地连接至启动子的核酸序列，其中所述序列编码病毒gag-pol多肽、可操作地连接至启动子的核酸序列，其中所述序列编码对生产细胞赋予抗药性的多肽，和SV40复制起点；c)含有包含以下元件的第三质粒的容器：可操作地连接至启动子的改进的HSV-TK编码序列、5'和3'长末端重复序列(LTR)、Ψ逆转录病毒包装序列、5'LTR上游的CMV启动子；可操作地连接至启动子的核酸序列，其中所述序列编码对生产细胞赋予抗药性的多肽、SV40复制起点，d)包含表达SV40大T抗原的生产细胞的容器；和e)关于用a)、b)和c)的质粒瞬时转染d)的生产细胞并在允许生成病毒颗粒的条件下培养转染的生产细胞的说明。认识到本文公开的递送载体或治疗载体包括病毒和非病毒颗粒。非病毒递送系统，如包括例如阳离子脂质体和聚阳离子的微粒或纳米颗粒，提供用于递送系统的替代方法并被本公开内容所涵盖。非病毒颗粒包括在脂双层中包封的核蛋白，其包括完全或部分组装的病毒颗粒。用于将病毒包封入脂双层中的方法是本领域中已知的。它们包括被动包封入脂双层封闭的囊泡(脂质体)中，和病毒体与脂质体温育(美国专利号5,962,429；Fasbender等人,J.Biol.Chem.272:6479-6489；HodgsonandSolaiman,NatureBiotechnology14:339-342(1996))。不受理论的限制，我们假设在病毒体的表面上暴露的酸性蛋白质为与递送载体或治疗载体的阳离子脂质/阳离子聚合物组分的复合提供界面并用作通过中性脂质组分形成双层的“支架”。非病毒递送系统的实例包括，例如，Wheeler等人，美国专利号5,976,567和5,981,501。这些专利公开了通过使质粒的水溶液与含有阳离子和非阳离子脂质的有机溶液接触制备血清稳定的质粒-脂质颗粒。Thierry等人，美国专利号6,096,335公开了包含全部阴离子生物活性物质、阳离子成分和阴离子成分的复合物的制备。Allen和Stuart,PCT/US98/12937(WO98/58630)公开了在适合于阳离子脂质溶解的脂质溶剂中形成多核苷酸-阳离子脂质颗粒，将中性囊泡形成脂质加入含有颗粒的溶剂，并蒸发脂质溶剂以形成具有包封在其中的多核苷酸的脂质体。Allen和Stuart,美国专利号6,120,798公开了通过在第一，例如水性的溶剂中溶解多核苷酸，在第二，例如有机的、与所述第一溶剂不混溶的溶剂中溶解脂质，加入第三溶剂以实现单相的形成，并进一步加入一定量的第一和第二溶剂来进行两个液相的形成。Bally等人，美国专利号5,705,385和Zhang等人，美国专利号6,110,745公开了通过使核酸与含有非阳离子脂质和阳离子性脂质的溶液接触以形成脂质-核酸混合物来制备脂质-核酸颗粒的方法。Maurer等人，PCT/CA00/00843(WO01/06574)公开了用于制备带电荷治疗剂的完全脂质包封的治疗剂颗粒的方法，该方法包括合并预制脂质囊泡、带电荷的治疗剂和去稳定剂以形成其在去稳定溶剂中的混合物，该去稳定溶剂去稳定但不破坏囊泡，并随后除去去稳定剂。颗粒形成组分(“PFC”)典型地包含脂质，诸如阳离子脂质，其任选与PFC而非阳离子脂质组合。阳离子脂质是其分子能够电解解离产生pH范围为约3至约10，优选约4至约9的生理pH范围的净正离子电荷的脂质。这类阳离子脂质包括，例如，阳离子去污剂，例如具有单一烃链的阳离子两亲物。专利和科技文献描述了具有增强核酸转染性质的许多阳离子脂质。这些增强转染的阳离子脂质包括，例如：1,2-二油酰氧基-3-(N,N,N-三甲基铵基)丙烷氯化物-、DOTMA(美国专利号4,897,355)；DOSPA(参见Hawley-Nelson等人,Focus15(3):73(1993))；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基铵溴化物，或者DDAB(美国专利号5,279,833)；1,2-二油酰氧基-3-(N,N,N-三甲基铵基)丙烷氯化物-DOTAP(Stamatatos等人,Biochemistry27:3917-3925(1988))；基于甘油的脂质(参见Leventis等人,Biochem.Biophys.Acta1023:124(1990)；精氨酰-PE(美国专利号5,980,935)；赖氨酰-PE(Puyal等人.J.Biochem.228:697(1995))、脂多胺(美国专利号5,171,678)，和基于胆固醇的脂质(WO93/05162、美国专利号5,283,185)；CHIM(1-(3-胆固醇基)-氧基羰基-氨基甲基咪唑)；等等。例如，在Behr,BioconjugateChemistry,5:382-389(1994)中综述了用于转染的阳离子脂质。优选的阳离子脂质是DDAB、CHIM或其组合。是阳离子去污剂的阳离子脂质的例子包括(C12-C18)-烷基-和(C12-C18)-烯基-三甲基铵盐、N-(C12-C18)-烷基-和N-(C12-C18)-烯基-吡啶鎓盐等。在一些实施方案中，形成的递送载体或治疗载体的大小在约40至约1500纳米的范围内。在一些实施方案中，递送载体或治疗载体的大小在约50-500纳米的范围内。在一些实施方案中，递送载体或治疗载体的大小在约20-150纳米的范围内。当它被施用于身体时，这种大小选择有利地有助于递送载体，以从血管穿透入病变组织如恶性肿瘤，并在其中传送治疗核酸。它也是递送载体的特征性的和有利的性质，如例如通过动态光散射法测量的，其大小在胞外生物流体例如体外细胞培养基或血浆的存在下基本上不增加。或者，在一些实施方案中，将产生逆转录病毒的细胞注射到肿瘤中。在一些实施方案中，这样引入的逆转录病毒产生细胞被工程化为活跃地产生递送载体，例如病毒载体颗粒，使得在肿瘤块内原位发生载体的连续产生。在一些实施方案中，增殖的肿瘤细胞通过接近逆转录病毒载体产生细胞而被体内转导。使用方法在一些实施方案中，本文公开了向靶细胞提供如本文所公开的编码HSV-TK的多核苷酸的方法，该方法包括及然后将细胞暴露于转化为有毒物质的适当底物来杀死表达突变HSV-1胸苷激酶基因的那些细胞，以及在突变HSV-1胸苷激酶基因表达细胞附近的细胞，即，旁观者细胞。突变HSV-1胸苷激酶基因可直接施用到靶向细胞或期望的细胞或系统性地施用，与靶向手段相组合，例如通过特定的病毒载体或递送制剂的选择。细胞可以在待治疗的患者体内进行处理，或体外处理，然后注射到患者中。在突变HSV-1胸苷激酶基因引入患者的细胞内后，以有效量全身或局部施用所述前药，该有效量将被突变HSV-1胸苷激酶转化成足够量的有毒物质以杀死靶细胞。是HSV-1TK的底物以产生杀死靶细胞的有毒物质的核苷类似物在本文中称为“前药”。在一些实施方案中，本文公开了杀伤细胞的方法，该方法包括：i)将如本文所公开的多核苷酸或载体引入细胞中；ii)允许或引导细胞表达胸苷激酶；和iii)使细胞与能被胸苷激酶转化为细胞毒性剂的试剂接触。在本发明的一些实施方案中，本文提供了预防患者中的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，该方法包括：(i)施用经遗传工程化以包括本发明的多核苷酸或载体的宿主T-细胞；和(ii)在移植物抗宿主病发生之前，以有效杀死能够实现GvHD的遗传工程化T细胞的量，向所述宿主施用能够被胸苷激酶转化为细胞毒性剂的药剂。在同种异体骨髓移植期间，同种异体反应性T淋巴细胞可以从移植物除去，以防止移植物抗宿主病。当在移植的干细胞移植物中的T-细胞攻击移植物接受者的身体时，GvHD发生。但是，T细胞的除去可以增加疾病复发、移植排斥和病毒感染的再活化的发生率。为了对抗GvHD的可能性，同种异体骨髓移植患者可以在同种异体骨髓移植之后的延迟后通过引入供体T淋巴细胞来治疗。然而，在同种异体骨髓移植之后的供体T淋巴细胞的延迟引入被GvHD、治疗的频繁且潜在的致命并发症所限制。通过向移植接受者施用经遗传工程化以包括编码“自杀基因”的多核苷酸的T细胞，如果T-细胞开始攻击移植接受者的身体则它们会被杀死。在一些实施方案中，逆转录病毒载体颗粒，其包括嵌合逆转录病毒包膜蛋白和编码治疗剂的多核苷酸，被施用于宿主以在宿主中表达治疗剂。在一些实施方案中，编码治疗剂的多核苷酸是如本文所公开的编码HSV-TK的多核苷酸，或其突变体和/或变体。在一些实施方案中，细胞从患者获得，并用逆转录病毒载体颗粒将治疗剂或多肽引入细胞中，并且将这样修饰的细胞施用于患者。在一些实施方案中，逆转录病毒载体颗粒被体内施用至患者，由此，逆转录病毒载体颗粒在体内转导患者的细胞。在一些实施方案中，本文公开了将治疗剂或多肽递送至受试者中的组织损伤部位的方法，该方法包括向组织损伤部位直接或静脉内递送逆转录病毒颗粒，所述逆转录病毒颗粒包含：i)嵌合逆转录病毒包膜蛋白和ii)至少一种编码治疗性多肽的多核苷酸，其中所述病毒颗粒与在组织损伤部位暴露的胶原蛋白结合，并在组织损伤部位表达治疗性多肽。在一些实施方案中，组织损伤选自由肿瘤侵袭、血管病变、溃疡性病变、炎性组织损伤、对眼睛的激光损伤、手术、关节炎关节、疤痕、瘢痕疙瘩引起的组织损伤。在一些实施方案中，组织损伤是由宿主中的肿瘤的生长引起的组织的病变。在一些实施方案中，如本文所公开的治疗性载体被用于包括恶性和非恶性肿瘤在内的癌症的治疗。在一些实施方案中，治疗载体进一步包含细胞外基质结合肽或肽结构域。在一些实施方案中，细胞外基质结合肽或肽结构域是胶原结合域或肽。在一些实施方案中，肿瘤包括但不限于所有的实体瘤。在一些实施方案中，如本文所公开的治疗性载体被用在选自以下的癌症的治疗中：乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头和颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡和乳头型鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状(veticulum)细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺瘤、胆石、胰岛细胞瘤、原发性脑瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经元瘤、肠神经节瘤(intestinalganglloneuromas)、增生性角膜神经瘤、马方综合征习性瘤(marfanoidhabitustumor)、维尔姆斯瘤、精原细胞瘤、卵巢瘤、平滑肌瘤(leiomyomatertumor)、宫颈非典型增生和原位癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、蕈样肉芽肿、横纹肌肉瘤、卡波济肉瘤、成骨和其他肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症(polycythermiavera)、腺癌、多形性成胶质细胞瘤、白血病、淋巴瘤、恶性黑色素瘤、表皮样癌。在其他实施方案中，所治疗的癌症是胰腺癌、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、肺癌、软组织肉瘤、喉癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、尤因肉瘤或结肠癌。在其他实施方案中，待治疗的癌症选自原发性肝细胞癌、肝转移性乳腺癌、肝转移性胰腺癌、肝转移性胃癌、肝转移性食道癌、肝转移性肺癌、肝转移性黑色素瘤、肝转移性卵巢癌和肝转移性肾癌。治疗载体可单独施用或与其他治疗性处理或活性剂联合施用。可以使用的其他活性剂的实例包括但不限于：化疗剂、抗炎剂、蛋白酶抑制剂如HIV蛋白酶抑制剂、核苷类似物如AZT。在一些实施方案中，治疗方法进一步包括在施用治疗性病毒颗粒之前、与其同时或之后，向受试者施用化疗剂、生物剂或者放射治疗。本领域技术人员将会理解，本文所述的逆转录病毒颗粒可以通过与一种或多种药剂相同的途径施用(例如，逆转录病毒载体和该药剂均静脉内施用)或者通过不同的途径施用(例如，逆转录病毒载体静脉内施用，而所述一种或多种药剂口服施用)。治疗性病毒颗粒的剂量优选在包括没有或几乎没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。该剂量可根据所使用的剂型和使用的施用途径在该范围内变化。治疗有效剂量可最初根据细胞培养试验来估计。剂量可以在动物模型中调配以达到如在细胞培养物中测定的包括IC50(即，达到半数最大感染或半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更准确地确定在人类中的有用剂量。例如，可以通过RT-qPCR或ddPCR方法来测量血浆中的水平。可以采用多种方式来确定待施用于需要治疗的受试者的本文所公开的逆转录病毒颗粒的有效量或治疗有效量。举例而言，该量可基于动物模型中的病毒滴度或功效。或者，可将临床试验中所使用的剂量方案用作通用准则。在一些实施方案中，每日剂量可以以单一剂量施用或在一天中的不同小时分份施用。在一些实施方案中，可能需要较高的剂量并且该剂量可在获得最佳初始反应时随时间的推移而减少。在一些实施方案中，治疗可以是连续数天、数周或数年，或者可以以中间的休息期间隔开。在一些实施方案中，根据个体可能正在接受的其他治疗而修改剂量。然而，治疗方法绝不限于逆转录病毒颗粒的特定浓度或范围，并且可以针对正在治疗的每个个体以及针对所用的每种衍生物而变化。可能需要剂量的个体化以对给定的个体达到最大效果。在一些实施方案中，施用于正在治疗的个体的剂量根据个体的年龄、疾病的严重程度或阶段以及对治疗过程的反应而变化。在一些实施方案中，用于确定剂量的临床参数包括但不限于：肿瘤大小，在针对特定恶性肿瘤的临床测试中使用的肿瘤标志物的水平的改变。在一些实施方案中，治疗医师确定将用于给定个体的治疗有效量。在一些实施方案中，本文公开的治疗根据需要经常施用由治疗医师判断的必需的时间段。治疗载体包括但不限于：对感兴趣的细胞或系统具有特异性的，可全身性或区域性(局部)递送至需要治疗的受试者的治疗性逆转录病毒颗粒。例如，治疗载体可全身静脉内施用。或者，治疗载体也可动脉内施用。治疗载体也可局部、静脉内、动脉内、瘤内、结肠内(intracolonically)、气管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘内、颅内、髓内、胸膜内、皮内、皮下、肌内、眼内、骨内和/或滑膜内或立体定位地(sterotactically)施用。也可以使用递送模式的组合，例如，患者可以以全身性和区域性(局部)两种方式接受治疗载体，以改善对治疗载体治疗的肿瘤反应。在一些实施方案中，将多个治疗过程(例如，第一和第二治疗过程)施用于需要治疗的受试者。在一些实施方案中，第一和/或第二治疗过程静脉内施用。在其他实施方案中，第一和/或第二治疗过程通过动脉内输注施用，该输注包括但不限于通过肝动脉、大脑动脉、冠状动脉、肺动脉、髂动脉、腹腔干动脉、胃动脉、脾动脉、肾动脉、性腺动脉、锁骨下动脉、椎动脉、腋动脉、肱动脉、桡动脉、尺动脉、颈动脉、股动脉、肠系膜下动脉和/或肠系膜上动脉的输注。动脉内输注可以使用血管内程序、经皮程序或开放手术方法来完成。在一些实施方案中，第一和第二治疗过程可以顺序施用。在其他实施方案中，第一和第二治疗过程可以同时施用。在其他实施方案中，任选的第三治疗过程可以与第一和第二治疗过程顺序或同时施用。在一些实施方案中，本文公开的治疗载体可累积以高剂量与顺序或同时施用的治疗过程联合施用。例如，在一些实施方案中，有此需要的患者可全身施用，例如静脉内施用累积至少1x109TVP、至少1x1010TVP、至少1x1011TVP、至少1x1012TVP、至少1x1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x1015TVP、至少1x1016TVP、至少1x1017TVP、至少1x1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x1020TVP、至少1x1021TVP或至少1x1022TVP的递送载体的第一疗程。第一治疗过程可以全身施用。或者，第一治疗过程可以以局部方式，例如动脉内施用，例如，有此需要的患者可以通过动脉内输注施用累积至少1x109TVP、至少1x1010TVP、至少1x1011TVP、至少1x1012TVP、至少1x1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x1015TVP、至少1x1016TVP、至少1x1017TVP、至少1x1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x1020TVP、至少1x1021TVP或至少1x1022TVP的递送载体。在其他实施方案中，有此需要的受试者可以接受高剂量递送载体的全身和动脉内输注施用的组合，顺序或同时进行。例如，有此需要的患者可以首先全身施用累积至少1x109TVP、至少1x1010TVP、至少1x1011TVP、至少1x1012TVP、至少1x1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x1015、至少1x1016TVP、至少1x1017TVP、至少1x1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x1020TVP、至少1x1021TVP或至少1x1022TVP的递送载体，接着进行动脉内输注，例如肝动脉输注施用累积至少1x109TVP、至少1x1010TVP、至少1x1011TVP、至少1x1012TVP、至少1x1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x1015TVP、至少1x1016TVP、至少1x1017TVP、至少1x1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x1020TVP、至少1x1021TVP或至少1x1022TVP的递送载体的附加治疗过程。在又一实施方案中，有此需要的患者可以接受高剂量递送载体的动脉内输注和全身施用的组合。例如，有此需要的患者可首先通过动脉内输注施用累积至少1x109TVP、至少1x1010TVP、至少1x1011TVP、至少1x1012TVP、至少1x1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x1015TVP、至少1x1016TVP、至少1x1017TVP、至少1x1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x1020TVP、至少1x1021TVP或至少1x1022TVP的递送载体，接着进行全身施用累积至少1x109TVP、至少1x1010TVP、至少1x1011TVP、至少1x1012TVP、至少1x1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x1015TVP、至少1x1016TVP、至少1x1017TVP、至少1x1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x1020TVP、至少1x1021TVP或至少1x1022TVP的递送载体的附加治疗过程。治疗过程还可以同时施用，即，高剂量递送载体，例如累积至少1x109TVP、至少1x1010TVP、至少1x1011TVP、至少1x1012TVP、至少1x1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x1015TVP、至少1x1016TVP、至少1x1017TVP、至少1x1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x1020TVP、至少1x1021TVP或至少1x1022TVP的递送载体的治疗过程与动脉内输注，例如肝动脉输注施用累积至少1x109TVP、至少1x1010TVP、至少1x1011TVP、至少1x1012TVP、至少1x1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x1015TVP、至少1x1016TVP、至少1x1017TVP、至少1x1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x1020TVP、至少1x1021TVP或至少1x1022TVP的递送载体的治疗过程一起施用。在其他实施方案中，有此需要的受试者可以额外地(与第一和第二治疗过程顺序地或同时)接受累积剂量的递送载体，例如，累积至少1x109TVP、至少1x1010TVP、至少1x1011TVP、至少1x1012TVP、至少1x1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x1015TVP、至少1x1016TVP、至少1x1017TVP、至少1x1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x1020TVP、至少1x1021TVP或至少1x1022TVP的递送载体的附加治疗过程(例如，第三治疗过程、第四治疗过程、第五治疗过程)。在一些实施方案中，需要治疗的受试者全身(例如静脉内)施用至少1x1011TVP的剂量，随后通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x1011TVP的剂量。在其他实施方案中，需要治疗的患者可以全身(例如静脉内)施用至少1x1012TVP的累积剂量，随后通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x1012TVP的剂量。在一个实施方案中，需要治疗的患者可以全身(例如静脉内)施用至少1x1013TVP的剂量，随后通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x1013TVP的剂量。在其他实施方案中，需要治疗的患者可以全身(例如静脉内)施用至少1x1014TVP的剂量，同时通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x1014TVP的剂量。在其他实施方案中，需要治疗的患者可以与通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x1015TVP的剂量一起，全身(例如静脉内)施用至少1x1015TVP的剂量。在其他实施方案中，需要治疗的患者可以全身(例如静脉内)施用至少1x1016TVP的剂量，同时通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x1016TVP的剂量。在其他实施方案中，需要治疗的患者可以与通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x1017TVP的剂量一起全身(例如静脉内)施用至少1x1017TVP的剂量。需要治疗的受试者还可以全身或局部(例如动脉内输注，诸如肝动脉输注)施用递送载体的治疗过程限定的时间段。在一些实施方案中，该时间段可以是至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少七天、至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月、至少十个月、至少十一个月、至少一年、至少两年、至少三年、至少四年或者至少五年。施用还可以以长期方式进行，即未限定或无限的时间段。所述治疗载体的施用还可以以周期性方式发生，例如一天至少一次、一天至少两次、一天至少三次、一天至少四次、一天至少五次。所述递送载体的周期性施用可能依赖于递送载体的时间以及施用方式。例如，肠胃外施用可在整个延长的时间段内一天仅进行一次，而递送载体的口服施用可一天进行多于一次，其中递送载体的施用在较短的时间段内进行。在一个实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息1到2天。在一些实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息2到4天。在其他实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少2天。在其他实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少4天。在其他实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少6天。在一些实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少1周。在其他实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少2周。在一个实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少一个月。在一些实施方案中，允许受试者在第二治疗过程与任选的第三治疗过程之间休息至少1-7天。在其他实施方案中，允许受试者在第二治疗过程与任选的第三治疗过程之间休息至少1-2周。在一些实施方案中，施用治疗载体以增加肽或载体的局部浓度。在一些实施方案中，治疗载体通过动脉内输注而施用，这增加了治疗载体至特定器官系统的局部浓度。在另外其他的实施方案中，治疗载体经肿瘤内施用。在一些实施方案中，取决于靶病变的位置，进行肝动脉的导管插入接着分别向胰十二指肠、右部肝和中部肝动脉内输注，以局部靶向肝病变。在一些实施方案中，肽或递送载体向其他器官系统(包括肺、胃肠、脑、生殖、脾或其他限定的器官系统)的局部分配通过导管插入或其他局部递送系统来实现。在一些实施方案中，动脉内输注通过任何其他可用动脉源来完成，包括但不限于通过肝动脉、大脑动脉、冠状动脉、肺动脉、髂动脉、腹腔干、胃动脉、脾动脉、肾动脉、性腺动脉、锁骨下动脉、椎动脉、腋动脉(axilaryartery)、肱动脉、桡动脉、尺动脉、颈动脉、股动脉、肠系膜下动脉和/或肠系膜上动脉输注。在一些实施方案中，动脉内输注使用血管内程序、经皮程序或开放外科手术方法完成。制剂包含治疗载体的药物组合物可以通过将所选量的治疗载体与一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂混合以任何常规方式进行配制。例如，治疗载体可以悬浮于载体如PBS(磷酸盐缓冲盐水)中。活性化合物可以通过任何合适的途径，例如，口服、肠胃外、静脉内、皮内、皮下，或局部，以液体、半液体或固体形式施用，并以适于每种施用途径的方式配制。在一些实施方案中，治疗载体和生理上可接受的盐和溶剂化物被配制用于通过吸入或吹入(通过嘴或鼻子)施用或用于口服、颊部、肠胃外或直肠施用。在一些实施方案中，对于通过吸入的施用，治疗载体通过使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体以气雾剂喷雾形式从加压包装或喷雾器中递送。在一些实施方案中，加压的气雾剂剂量单位或阀递送计量的量。在一些实施方案中，用于在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(例如明胶的)被配制成含有治疗性化合物和合适的粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。在一些实施方案中，药物组合物被配制为作为通过采用药学上可接受的赋形剂以常规手段制备的片剂或胶囊来口服施用，该赋形剂例如是粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。在一些实施方案中，片剂通过本领域公知的方法包衣。在一些实施方案中，用于口服施用的液体制剂为例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或该液体制剂被配制成在使用前用水或其他合适的载体重建的干燥产物。在一些实施方案中，此类液体制剂通过采用药学上可接受的添加剂以常规手段制备，该添加剂例如是悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水载体(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分级分离的植物油)；以及防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。在一些实施方案中，适当时，该制剂还含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制成口服施用以提供活性化合物的控制释放。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于以常规方式配制的片剂或锭剂(lozenge)形式经颊部施用。在一些实施方案中，治疗载体被配制用于通过注射例如通过团注或连续输注而肠胃外施用。在一些实施方案中，用于注射的制剂为具有添加的防腐剂的单位剂型，例如在安瓿或多剂量容器中。在一些实施方案中，所述组合物被配制成在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液。在一些实施方案中，所述制剂包含配方剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，在一些实施方案中，活性成分为在使用前用合适的载体例如无菌无热原水重建的冻干粉末形式。在一些实施方案中，治疗载体被配制成贮库型(depot)制剂。在一些实施方案中，此类长效制剂通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如，在一些实施方案中，治疗性化合物与合适的聚合或疏水性材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或配制为微溶性衍生物，例如作为微溶性盐。在一些实施方案中，活性剂被配制用于局部或局限性应用，例如用于皮肤和粘膜的局部应用，例如在眼中，以凝胶、乳膏和洗剂的形式，并应用于眼部或用于脑池内或脊柱内应用。在一些实施方案中，此类溶液，特别是旨在用于眼睛应用的那些溶液，与合适的盐一起被配制成0.01％-10％的等渗溶液(pH约5-9)。在一些实施方案中，所述化合物被配制成用于局部应用的气雾剂，例如通过吸入。药物组合物中的活性化合物的浓度将依赖于活性化合物的吸收、失活和排泄率，剂量时间表，和给药量，以及本领域技术人员已知的其他因素。在一些实施方案中，组合物存在于包装或分配器装置中，其包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。在一些实施方案中，该包装可以包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。在一些实施方案中，该包装或分配器装置随附给药说明。在一些实施方案中，活性剂被包装成含有包装材料、本文提供的药剂以及指示该药剂所针对的病症的标签的制品。动物模型在一些实施方案中，上文描述的逆转录病毒载体颗粒在体内施用于动物，作为用于研究基因疗法治疗的有效性的动物模型的一部分。在一些实施方案中，逆转录病毒载体颗粒以变化的剂量施用于相同物种的不同动物。随后评价动物中期望的治疗剂或诊断剂的体内表达。在一些实施方案中，根据从这些评价中获得的数据，本领域普通技术人员确定将施用于人类患者的逆转录病毒载体颗粒的量。试剂盒还提供了包含用于在本文描述的方法中使用的组合物的试剂盒或药物递送系统。对于施用本文公开的逆转录病毒颗粒所必需的所有必要的材料和试剂均可以装在试剂盒中(例如，包装细胞构建体或细胞系，细胞因子表达载体)。试剂盒的组分可以以如上所述的多种制剂提供。一种或多种治疗性逆转录病毒颗粒可以与一种或多种药剂(例如，化疗剂)配制成单一的药学上可接受的组合物或单独的药学上可接受的组合物。这些试剂盒或药物递送系统的组分还可以以干燥或冻干形式提供。当试剂或组分作为干燥形式提供时，通常通过添加合适的溶剂来进行重建，该溶剂也可以在另外的容器装置中提供。试剂盒的容器装置通常可以包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或可向其中放置至少一种物质的其他容器装置。本文公开的试剂盒还可以包括关于逆转录病毒颗粒的剂量和或施用信息的说明。该说明可以包括实施本文描述的任何方法(包括治疗方法)的说明。该说明可另外包括可能发生的满意的临床终点或任何不良症状的指示，或者监管机构如美国食品与药品管理局(FDA)针对人类受试者使用所要求的其他信息。所述说明可以在“印刷品”上，例如在试剂盒内或贴在试剂盒上的纸张或纸板上，或在贴在试剂盒或包装材料上的标签上，或附着于含有试剂盒组分的小瓶或试管上。该说明可以另外包含在计算机可读介质上，例如磁盘(软盘或硬盘)、光盘例如CD-或DVD-ROM/RAM，磁带，电子存储介质如RAM和ROM，这些介质的IC端和混合物，诸如磁性/光学存储介质。在一些实施方案中，试剂盒或药物递送系统包括用于包含在严密限制空间中的小瓶以供商业销售的装置，例如，其中保留期望的小瓶的注射或吹塑塑料容器。不论容器的数目或类型如何，该试剂盒还可以包含或包装有用于辅助将最终的复合组合物注射/施用或放置到受试者体内的仪器。这样的仪器可以是敷抹器、吸入器、注射器、移液管、镊子、量匙、滴眼管或任何这样的医学上批准的递送工具。包装和试剂盒可以进一步包括具体列举例如产品描述、施用模式和/或治疗适应证的标签。本文提供的包装可以包括如本文描述的任何组合物。该包装可以进一步包括用于治疗一种或多种疾病和/或病况的标签。术语“包装材料”是指容纳试剂盒组分的物理结构。包装材料可以无菌地保持组分，且可以由通常用于此类目的的材料(例如，纸、波纹纤维(corrugatedfiber)、玻璃、塑料、箔、安瓿等)制成。标签或包装插页可以包括合适的书面说明。因此，试剂盒可以另外包括关于在本文描述的任何方法中使用试剂盒组分的标签或说明。试剂盒可以包括在包装中的化合物或分配器以及关于在本文描述的方法中施用化合物的说明。实施例为了本领域技术人员可以更好地实施本文描述的组合物和方法，提供了下列实施例用于说明性目的。实施例1：细胞系生成首先，通过利用磷酸钙试剂将3或4个质粒系统转染到293T细胞内而产生逆转录病毒上清液。上清液通过0.45μm过滤器过滤。过滤的上清液可新鲜使用，在4℃下储存长达48小时，或者在-80o℃下储存。通过在6孔组织培养皿中接种1×104个细胞/孔生成细胞系。第二天，将逆转录病毒上清液与8μg/mL聚凝胺一起加入16-24小时并用适当剂量的选择药物(G418、潮霉素或嘌呤霉素)选择。选择药物的剂量是在加入药物后至少4天导致100％杀死非HSV-TK细胞的最小量，以避免对细胞的过度毒性。实施例2：GCV敏感性试验表达HSV-TK或其突变体和/或变体的细胞以1×105接种到6孔皿中。第二天，以1mM至0.1μm的最终浓度加入5个系列10倍稀释的GCV。GCV处理后三(3)天，加入亚甲蓝以对活细胞进行染色。实施例3：旁观者试验用0-100％的TK细胞的混合物将细胞一式三份以1-4×104个细胞/孔接种到96孔板中。第二天以10μm至1mM的剂量加入GCV。在GCV加入后20-24小时，将汇合的细胞板以1:30分成3个板。5天后，通过PrestoBlue分析细胞的活细胞代谢并在微量培养板读取仪(microplatereader)上读取。在通过PrestoBlue处理GCV后3天分析亚汇合下的细胞板。在一个试验中，生成了发明人使用的HSV-TK克隆细胞系；使用新霉素HSV-TK、潮霉素-HSV-TK，比较红色荧光蛋白(RFP)-HSV-TK细胞系和若干HSV-TK基因的突变体。RexC2携带改进形式的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因(TK)。已用RxC2有效地感染(转导)的细胞宿主将病毒TK整合到其基因组中并表达这种酶。为将其并入分裂的细胞中的新合成的DNA内，HSV-TK对DNA碱基胸苷进行磷酸化。用于细胞接种和GCV处理的典型96孔板计划在下表中显示(HK＝HSV-TK)：旁观者测定试验的图形结果显示于图19和20中使用不同的突变HSV-TK和克隆群体进行了超过40个旁观者试验。数据与GCV灵敏度和酶动力学测量和用于具有潜力的突变体的生产的病毒滴度一起编辑。所有这些参数的仔细检查允许选择突变HSV-TK168dmNES成为ReximmuneC-2中的TK基因。实施例4：通过实时PCR对TKRNA的剪接形式的定量将HSV-TK的未剪接和截短形式亚克隆到pCR2.1TOPO载体(Invitrogen)中。使用/ABIPRISM7700序列检测系统，采用能够选择性地扩增和检测HSV-TK的未剪接和剪接形式的两组不同的引物和探针设置两个定量实时PCR。对于HSV-TK未剪接形式，引物和探针被设计在HSV-tk基因的剪接区域中。对未剪接形式的实时PCR在25μl反应混合物中进行，所述反应混合物包含100-500ng基因组DNA或10μlcDNA、1X通用PCR主混合物、各300nM的两种引物TKwtfor(5'-CGGCGGTGGTAATGACAAG-3')和Tkwtrev(5'-GCGTCGGTCACGGCATA-3')和200nM的TKwtMGB探针(5'-FAMCCAGATAACAATGGGC-3')。包含剪接点的探针被设计为用于选择性地检测HSV-TK剪接形式。对TK剪接(截短)形式特异的定量实时PCR在25μl反应混合物中进行，所述反应混合物包含100-500ng基因组DNA或10μlcDNA、1X主混合物(PEAppliedBiosystems)、各300nM的两种引物。热循环条件如下：在50℃下UNG初始活化2分钟，接着是TaqGold的活化及UNG在95℃下失活15分钟。接着，以在95℃下15秒和在60℃下1分钟进行40个扩增循环。使用ABIPrism7700序列检测系统(AppliedBiosystems)在光学96孔反应板(AppliedBiosystems)中平行进行两个PCR。平均基线荧光从PCR循环3至15计算，且Ct定义为报告染料的归一化荧光强度等于0.05时的PCR循环。通过相对于DNA初始输入量的对数绘制Ct值，在每个测定中生成具有已知拷贝数的两个标准曲线(从10<6>至4个拷贝/反应)。分别以一式两份和一式三份分析标准稀释液和cDNA样品。实施例5：临床试验进行剂量递增试验，以评价Reximmune-C2(胸苷激酶和GM-CSF基因)在患有原发性肝细胞癌或转移至肝的肿瘤的难治性受试者中的安全性、药代动力学和药效学。背景和基本原理Reximmune-C2由含有编码感兴趣的治疗性蛋白质的内部载荷的遗传传递平台组成。该遗传传递平台已经在全球280多名受试者中给药；约270名受试者用含有dnG1作为载荷(Rexin-G)的载体治疗，并且16名受试者用胸苷激酶(vTK)和免疫刺激物粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为载荷(Reximmune-C)治疗。该遗传传递平台是高度工程化的非重组小鼠莫洛尼病毒载体(MoMLV)。先前，进行了在患有难治性原发性或转移性实体瘤的受试者中研究Rexin-G和Reximmune-C的组合的1期剂量递增试验(Genevieve试验)。此项提出的I期临床试验(命名为Genevieve2试验)是使用胸苷激酶加GM-CSF组合中胸苷激酶的改进形式研究单独Reximmune-C2——没有Rexin-G——的所进行试验的延伸。在最初的Genevieve试验中，招募了十六名受试者，在全部3个剂量水平中，最高剂量组中的平均暴露量为8.0x1010cfu(#pts＝7)，且最长持续时间为6个周期(3-6周期的范围)。对于该研究的A部分，治疗由先前确定的安全且有效(最佳)剂量的Rexin-G和递增剂量的Reximmune-C构成。具体地，在第1、3、5、8、10和12天Rexin-G2x1011cfu，在第3天Reximmune-C1.0、2.0或3.0x1010cfu(分别为剂量水平I、II、III)，以及在第6-19天伐昔洛韦1gm口服一天三次，作为一个周期。对于该研究的B部分，没有毒性的或毒性已经降低至1级或更低的受试者可以接受额外的长达总计6个治疗周期的治疗周期。在任何剂量水平下均没有剂量限制性毒性。在该研究中报告了16名受试者的不相关不良事件，但是事件的数目较少(在大多数情况下，每个优选项发生1或2次)，且多数是1级或2级。2名受试者中发生了相关的非严重不良事件，且两者都是2级。四名受试者经历了严重不良事件，认为其全部与研究药物无关。该1期试验的继续部分的基本原理是：(1)胸苷激酶本身可证明是有效的抗癌剂，特别是在其肿瘤证明有旁观者效应的受试者中。(2)至今，将遗传传递平台施用于国际组的受试者已经证实了极其高度的安全性；以及(3)动物中的生物分布提示肝脏的高生物分布。此外，加入GM-CSF可以促进免疫效应和通过募集合适的免疫细胞经由肿瘤相关抗原的增强的肿瘤细胞杀伤。病毒颗粒的生物分布在肝脏中最高，然后是脾脏，之后是肺——这是最初集中于肝细胞肿瘤的基本原理，在肝细胞肿瘤中剂量强度应该是最高的。还存在对于这些癌症的有效抗癌剂的尚未满足的迫切临床需要。应理解，本文公开的实施方案不限于特定的方法和组分，且如所述的其他过程可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，且并不旨在限制本发明的范围。必需注意的是，除非上下文另外清楚地指出，如本文和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包含复数引用。因此，例如，提及“蛋白质”即提及一种或多种蛋白质，且包括本领域技术人员已知的其等同物等。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。描述了特定的方法、装置和材料，尽管在实施或测试本发明中可以使用与本文描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料。本文引用的所有出版物均通过引用并入于此，包括所有的期刊文章、书籍、手册、公开的专利申请以及授权的专利。另外，提供了在说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语和短语的含义。定义并不意在在本质上进行限制，而是用于提供对本发明的某些方面的更清楚的理解。实施例6：基因治疗应用的临床试验该临床试验分为两个阶段：IA期，其中Reximmune-C2在五天中的三天中作为单一静脉剂量施用。不论PET扫描结果如何，在第8天开始缬更昔洛韦(更昔洛韦的口服形式)给药，持续5天。接下来是约一周的休药期。每个周期将具有三周的持续时间。在第一和后续的组群中将有三名患者，直到患者经历了剂量限制性毒性(DLT)或归因于研究药物的NCI-CTC2级毒性的两种情况(除了恶心/呕吐、疲劳、厌食、脱发或贫血之外)。如果没有DLT，则患者将转至下一个剂量水平。如果有DLT，则该组群将扩大至6名患者，且如果2名或更多名患者表现出DLT则将不超过该剂量水平。一旦达到最大施用剂量(MAD)，则接着以没有DLT的组群剂量开始进行改进的Fibonacci时间表，并且继续直到在该剂量水平的两名患者中观察到剂量限制性毒性。一旦限定了推荐的2期剂量(RP2D)，则将招募6-12名患者。IB期被设计用于考察Reximmune-C2在基于IA期数据具有定义的肿瘤类型和阶段并且在一个剂量(RP2D)的Reximmune-C2后第三至六天呈[18F]FHBG扫描阳性的患者中的活性。如果扫描是阳性的，则患者被收入该方案的IB期治疗阶段，并且在5天内给予三个剂量的RP2D，随后在该阶段的第8天开始施用5天的缬更昔洛韦，然后是一周的休药期。每个周期具有三周的持续时间。在一个单一剂量的Reximmune-C2之后具有阴性[18F]FHBGPET扫描的患者将给予5天的缬更昔洛韦，并且不再继续该研究。患者DLT将被定义为归因于Reximmune-C2并且在施用药物的第一个周期(3周)期间发生的任何下列事件的出现：4级嗜中性粒细胞减少(即嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)<500个细胞/mm3)持续连续7天或更多天，或发热性嗜中性粒细胞减少(即，发热≥38.5℃且ANC<1000个细胞/mm3)；4级血小板减少症(<25,000个细胞/mm3或需要血小板输注的出血事件)；3级或更高级别的恶心和/或呕吐，尽管使用了足够的/最大的医疗干预和/或预防；任何3级或更高级别的非血液毒性(除了3级注射部位反应、脱发、疲劳之外)；由于从与Reximmune-C2治疗相关的毒性中恢复的延迟而引起的大于3周的再治疗延迟；以及3级或更高级别的超敏反应，尽管适当地使用了术前用药法(根据常见毒性标准被定义为“有症状的支气管痉挛、需要肠胃外用药、有或没有荨麻疹；变态反应相关水肿-神经性水肿”)。Reximmune-C2通过输液泵经15-60分钟(取决于剂量)静脉内输注。Reximmune-C2在储存于-80℃±10℃的30ml小瓶中提供。在这个I期试验中，将研究递增剂量的Reximmune-C2的安全性、药代动力学和药效学。针对ReximmuneC2，将确定最大耐受剂量并将限定推荐的2期剂量。将描述对于ReximmuneC2治疗的任何抗肿瘤活性和临床反应。该试验中的起始剂量基于：对相关的载体平台药品Rexin-G和Reximmune-C的人类临床安全性经验，以及针对Reximmune-C2的21天大鼠GLP毒理学研究结果。目标该研究的主要目标是确定Reximmune-C2的最大耐受剂量(MTD)、剂量限制性毒性(DLT)、安全性以及推荐的2期剂量(RP2D)，其中Reximmune-C2在参与该研究的已被诊断为患有晚期原发性或肝转移性肿瘤的患者中经三周的周期(包括：在第1周的五天内静脉内给予一系列的三个剂量，随后在第2周给予5个日剂量的缬更昔洛韦)施用。次要目标包括：(i)评价Reximmune-C2的血浆药代动力学；(ii)通过系列[18F]FHBGPET和/或SPECT成像来评估来自Reximmune-C2的HSV-TK-m2蛋白表达的替代；(iii)描述和评估Reximmune-C2的抗肿瘤活性的任何初步证据；以及(iv)为逆转录病毒载体gp70env的抗体，外周血淋巴细胞(PBL)中的可复制逆转录病毒，载体整合入PBL的基因组DNA，以及使hGM-CSF蛋白循环提供临床研究测试。方法研究设计：平行组，开放标签剂量递增，三中心临床试验。分层：无。治疗：Reximmune-C2将作为静脉内输注施用于不同的患者。在IA期——研究Reximmune-C2——剂量将在患者组群之间递增直到观察到DLT。在RP2D，将招募另外的患者。在IB期，将通过[18F]FHBGPET针对HSV-TK-m2的表达预筛选患者。表达HSV-TK-m2的那些患者将接受附加剂量的Reximmune-C2。患者将不被预用药，除非发生超敏反应。统计方法：描述性统计将用于统计分析。样本大小确定：无法定义精确的样本大小，因为其依赖于观察到的毒性。对于每个时间表，三到六名受试者的组群将在每个剂量水平下进行治疗，直到定义了MTD。一旦确定MTD，则该剂量水平将扩大至最多12名患者，这些患者将被治疗以更好地定义该剂量和时间表的耐受性和药代动力学。预期45-70名受试者将参加，其中33到46个在IA部分。入选标准受试者必须满足适于随机进入该研究的所有下列入选标准：1.诊断为具有组织学记录的肝脏晚期原发性或转移性成人实体瘤，其对于标准治疗是难治性的，或对其不存在治愈性的标准治疗。2.射线照相可测量或可评估的病变的证据。3.任何先前的放射治疗、化疗或手术程序的所有急性毒性作用必须已经降低至国立癌症研究所(NCI)常见毒性标准(CTC)(4.0版)级别<1。4.年龄必须>18岁。5.除了激素治疗之外的抗肿瘤治疗的最后给药必须>21天。外部光束放射治疗必须为<25％包含骨髓的骨骼。6.患者可以是乙型肝炎和丙型肝炎阳性。(患者可以继续他们的抗病毒药物治疗)。7.如果患者已经进行脑照射并且稳定6周，则患者可具有任何数目的颅内转移。患者可服用抗癫痫药物，但绝不能使用类固醇。8.Karnofsky行为状态必须≥70。9.至少3个月的预期寿命。10.患者必须能够行进至圣卢克医疗中心(St.Luke’sMedicalCenter)进行PET扫描。11.要求的基线实验数据包括：12.签署知情同意书，表明他们知道他们疾病的肿瘤性质，并且已被通知随后的程序、治疗的实验性质、替代选择、潜在的益处、副作用、风险和不适。13.愿意并且能够遵守预定的访视、治疗计划和实验室检测。下列任何一项的存在将从研究入组中排除受试者：1.同时采用包括任何其他试验药的任何抗癌治疗进行治疗。2.筛选6周内已知有颅内水肿或CVA。3.孕妇或哺乳期女性。女性受试者必须同意使用有效的避孕措施，必须是手术绝育的，或必须是绝经后的。男性受试者必须同意使用有效的避孕措施或是手术绝育的。有效避孕措施的定义将基于研究者或指定助理的判断。所有高危女性受试者必须在研究治疗开始之前7天之内为妊娠试验阴性。4.临床上显著的心脏病(纽约心脏协会(NewYorkHeartAssociation)，III或IV级)。5.痴呆或将阻止知情同意的改变的精神状态。6.可能增加与研究参与或研究药物施用相关的风险，或者可能妨碍对研究结果的解释以及根据主要研究者的判断将使受试者不适合该研究的其他严重的、急性或慢性的医学或精神状况或实验室异常。7.已知对更昔洛韦类抗病毒药物具有副反应。8.已知是HIV阳性的患者。9.患者在筛查时不得服用类固醇。起始剂量和时间表的基本原理Reximmune-C已经在16名患者中在1.0、2.0或3.0x1010cfu的范围内给药(在周期的第3天分别为剂量水平I、II、III)。在任何剂量水平下均没有剂量限制性毒性。在该研究中报告了16名患者的不相关不良事件，但是事件的数目较少(在大多数情况下，每个优选项发生1或2次)，且多数是1级或2级。2名患者中发生了相关的非严重不良事件，且两者都是2级。四名患者经历了严重不良事件，认为其全部与研究药物无关。在确定Reximmune-C的最佳剂量和时间表之前结束了试验。在该试验(新的Genevieve-2试验)中，初始给药将基于21天毒理学和HSV-TK-m1研究。未来给药将使用总病毒颗粒(TVP)/ml(其为比cfu每毫升更加准确的滴度量度)进行。该时间表基于Reximmune-C2暴露不会转导所有肿瘤细胞的基本原理。因此，患者将在5天的时间内每个周期给药三次。在暴露于GDS与HSV-TK-m2(和hGM-CSF)表达之间的时间估计为48至72小时。因此，第三次Reximmune-C2给药后72小时，将开始给予缬更昔洛韦。剂量(其将针对肾功能进行调节)将以常规的抗病毒剂量水平给予。由于缬更昔洛韦的潜在毒性和公开的观察结果(5天的更昔洛韦应足以杀死大多数含有HSV-TK-m2的细胞)，因此选择了5天的治疗。由于Reximmune-C2和缬更昔洛韦两者的潜在毒性，这之后将为约9天的休药期。hGM-CSF在缬更昔洛韦添加时可以为足够的浓度以影响可能在肿瘤细胞凋亡期间出现的任何肿瘤相关抗原(TAA)的呈现。在第一个周期的第一次和第三次剂量后以及在第二个周期的第一次剂量后，取血浆样品用于药代动力学分析。由于主要分布在肝脏，因此将仔细地监测肝脏的毒性，并且由于其相关性，也监测骨髓的毒性。这一临床方案需要将Reximmune-C2经由静脉内输注施用于患有晚期恶性肿瘤(原发性肝细胞或转移至肝脏的肿瘤)的患者。其将具有两部分：IA期(每三周剂量递增3次剂量/周)和IB期(一个剂量的Reximmune-C2后的预筛选和[18F]FHBG扫描)。如果PET扫描是阳性的，则患者将继续该研究。如果PET扫描是阴性的，则患者将接受5天的缬更昔洛韦并且将不继续该试验。对于IA期，剂量递增将遵循加速滴定设计，将每剂量水平的三名患者合并，直到观察到归因于研究药物的一种DLT情况或两种NCI-CTC2级毒性情况(除了恶心/呕吐、疲劳、厌食、脱发或贫血)。此后，临床方案中的剂量将遵循改进的Fibonacci时间表，直到达到剂量限制性毒性。试验设计这是1期开放标签的四中心剂量递增试验。剂量将增加直到观察到DLT，并且定义MTD。Reximmune-C2将作为静脉内输注经15-60分钟施用。预期33-70名患者将在研究过程中进行治疗。对于IA期，Reximmune-C2的剂量将从6.0x1011TVP递增。在加速剂量递增阶段，将在每个剂量水平下选入三名患者的组群。剂量递增增量将为100％，直到观察到DLT或两个2级CTC或更多毒性。当加速剂量递增结束时，在标准剂量递增中新的患者的剂量递增将遵循改进的Fibonacci方案(即67％、50％、40％、33％和25％的剂量增量)。每个剂量水平下最少三名患者将入选。对于IB期，Reximmune-C2的剂量将是RP2D。将评估DLT。如果在某剂量水平下，在六名患者中的≥2个中观察到DLT，则将不会进行进一步的剂量递增。该剂量水平将定义最大施用剂量(MAD)。刚好低于MAD的剂量将被认为是MTD。一旦定义了MTD，则该剂量水平可以扩大至最多十二名患者，以进一步表征作为用于2期临床研究的推荐剂量的药代动力学和药效学参数以及适用性。患者的治疗仅熟悉程序的合格人员(最小化对他们自己和环境的不当暴露)可以承担在合适的环境中生物治疗剂的准备、处理和安全处置。ReximmuneC2是含有编码HSV-TK-m2和hGM-CSF的基因的莫洛尼鼠不可复制逆转录载体颗粒。该药物产品含有DMEM(低葡萄糖)、RD逆转录载体颗粒、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、人血清白蛋白、正丁酸、镁以及其他赋形剂。药物产品在一个小瓶大小中可用：具有20mm抛光层(finish)的30mL的1型透明玻璃小瓶(含有25mL的≥1.0x1010TVP)。小瓶用20mm的特氟隆(Teflon)涂覆的血清塞子和20mm的钳口涂漆的翻盖封闭。Reximmune-C2将由输液泵经15分钟静脉内施用高至100mL的体积，经30分钟静脉内施用>100mL到200mL的体积，经45分钟静脉内施用>200mL到300mL的体积，以及经60分钟静脉内施用>300mL到400mL的体积。超过400mL的体积将在由研究者和GleneaglesMedicalMonitor确定的速率下施用。一旦确定了时间表的MTD，则如果指明(并且在研究者与GleneaglesMedicalMonitor之间达成一致时)可以改变施用时间。缬更昔洛韦口服施用，且应当与食物一起服用。应仔细监测血清肌酸酐或肌酸酐清除率水平。基于如下表所示的肌酸酐清除率需要进行剂量调整。缬更昔洛韦给药可以在该周期的第7天至第9天开始，但必须给予连续5天。肌酸酐清除率可以通过下列公式由血清肌酸酐计算得到：对于男性＝{(140–年龄[年])x(体重[kg])}/{(72)x(0.011x血清肌酸酐[微摩尔/L])}对于女性＝0.85x男性值。表I.肾损伤患者的缬更昔洛韦给药1期研究的目的是确定试验药的MTD、DLT、安全性和RP2D。因此，毒性效果是主要研究终点，且将持续进行评估。如果患者患有可以容易地测量并再评估的疾病，则将获得反应信息。这些评估将在每个周期中进行。此外，必须注意间隔至少6周的两次检查之间的反应，以便被记录为确认的治疗反应。·毒性可评价——如果所有患者均接受任何研究药物，则他们将是毒性可评价的。·反应可评价——已经接受至少单个周期的治疗且进行肿瘤再评估的所有患者均将被认为是反应可评价的。另外，患有早期进展性疾病的那些患者也将被认为是反应可评价的。进行了至少两个治疗周期的治疗的患者的反应将被评价。抗肿瘤疗效的确定将基于根据免疫相关反应标准(irRC)评价系统作出的客观肿瘤评估，并且由研究者作出的治疗决策将基于这些评估。鉴于Reximmune-C2中GM-CSF转基因的存在，以及导致肿瘤效果的免疫应答的可能性，免疫应答标准将用于临床反应。使用免疫应答标准与RECIST1.1的原因如下：(1)对于免疫治疗可测量的抗肿瘤活性的出现可能需要比细胞毒性治疗更长的时间；(2)对免疫治疗的反应在常规PD之后发生；(3)免疫治疗的中止在一些情况下可能是不合适的，除非确认了PD(如通常针对反应所完成的)；(4)推荐对于“临床上不足的”PD的允许量(例如，在其他反应性病变存在下的小的新病变)；以及(5)持久的SD可以代表抗肿瘤活性。下文列出了RECIST1.1与免疫相关应答标准之间的比较：表II.WHORECIST与免疫相关应答标准的比较评估的时机和类型所有基于基线成像的肿瘤评估均在开始治疗前的14天内进行。为达到该研究的目的，对于IA期和IB期二者，所有患者的肿瘤评估应当在开始治疗后的第9周起始以及此后的每6周(例如第9周、第15周、第21周等)进行再评价。所有具有反应性肿瘤(irCR或irPR)的患者必须在第一次反应记录后不少于6周确认反应。所有具有肿瘤进展的患者必须在第一次进展记录后不少于6周确认进展。相同的评估方法和相同的技术应当用于表征在基线和在随访期间的每个确定且报告的病变。当两种方法均已用于评估治疗的抗肿瘤效果时，对于通过临床检查进行的评价，基于成像的评价是优选的。所有测量值均应以公制符号进行记录。CT和CT/PET是用于肿瘤评估的方法。常规的CT应当采用在切片厚度上连续地切割10mm或更少来进行。螺旋CT应当使用5mm连续重建算法进行。这适用于胸部、腹部以及骨盆。胸部CT将用于肺部病变的评估。临床病变仅当其是表面的(例如皮肤结节、明显的淋巴结)时，才被认为是可测量的。在皮肤病变的情况下，推荐通过包含用于估计病变大小的标尺的彩色照相术进行记录。[18F]FHBGPET-CT扫描将在IA期中患者接受Reximmune-C2的前三次剂量(第1个周期)之后以及在IB期Reximmune-C2的筛选剂量之后获得。在IA期，另外的[18F]FHBGPET-CT扫描可以根据研究者的判断并经MedicalMonitor的指示而在随后的周期中获得。超声不应当用于测量临床上不容易获得客观反应评价的肿瘤病变，例如内脏病变。它是对于表面可触知结节、SC病变以及甲状腺结节的临床测量的可能的替代测量。超声也可用于确认通常通过临床检查评估的表面病变的完全消失。内窥镜检查、腹腔镜检查以及放射性核素扫描不应当用于反应评估。所有患者的档案和放射学图像对于来源验证必须是可获得的，并且可以提交外部评审以用于抗肿瘤活性的最终评估。肿瘤病变的可测量性在基线处，肿瘤病变将由研究者根据如下描述的标准分类为可测量的或不可测量的：·可测量的：可以在至少一个维度(待记录的最大直径)上采用常规技术准确地测量为≥20mm或采用螺旋CT扫描准确地测量为≥10mm的病变。临床病变仅在当其是表面的(例如，皮肤结节、明显的淋巴结)时才被认为是可测量的。·不可测量的：所有其他的病变，包括小病变(采用常规技术最大直径<20mm或采用螺旋CT扫描最大直径<10mm)和骨病变、软脑膜疾病、腹水、胸腔积液或心包积液、皮肤或肺的淋巴管炎、通过成像技术不能确认和跟进的腹部肿块、囊性病变、先前的照射病变以及仅由间接证据(例如通过如碱性磷酸酶进行的实验室检验)所记录的疾病。注：细胞学和组织学：如果可测量的疾病局限于孤立性病变，则其肿瘤性质应通过细胞学/组织学来确认。也可通过独立的中心放射学盲态审查来评估对治疗的反应。记录肿瘤测量结果代表所有累及的器官的多达最多10个病变的所有可测量病变，应当被确定为靶病变，且在基线处以及在治疗期间以规定的时间间隔进行测量和记录。靶病变应当基于它们的大小(具有最长直径的病变)以及它们用于准确的重复测量的适宜性(通过成像技术或者临床上)进行选择。对于每个靶病变都将记录最长直径。所有靶病变的最长直径的总和将被计算并记录为基线。最长直径的总和将用作在治疗期间进一步表征疾病的可测量维度的客观肿瘤反应的参考。所有的测量值均应当以厘米的公制符号进行记录。所有其他病变(或疾病部位)均应当被确定为非靶病变，并且也应当在基线处进行记录。测量不是必需的，且这些病变应当记为“存在”或“不存在”。肿瘤反应的定义将遵循免疫相关应答标准来评估肿瘤反应。通过免疫相关应答标准来确定总反应。实体瘤的靶病变·完全反应(irCR)被定义为通过从第一次记录的日期起不少于6周的重复连续评估确认所有病变均消失(不论是可测量的还是不可测量的，并且没有新的病变)；。·部分反应(irPR)被定义为通过在第一次记录后至少6周的连续评估确认肿瘤负荷相对于基线下降>50％。·疾病进展(irPD)被定义为通过自从治疗开始或一个或多个新的病变出现而记录的病变第一次被记录的日期起不少于6周的重复连续评估确认肿瘤负荷相对于最低点(记录的最小肿瘤负荷)增加>25％。·病情稳定(irSD)被定义为在不存在irPD的情况下不满足irCR或irPR的标准。实体瘤的非靶病变当可测量的肿瘤已经满足反应或irSD的标准时，在治疗期间出现或恶化的任何渗出物的肿瘤起源的细胞学确认，对于区分反应或irSD与irPD是必要的。肿瘤反应的确认为指定为irPR或irCR状态，患有反应性肿瘤的患者的肿瘤测量值的改变必须通过重复研究来确认，该重复研究应当在第一次满足反应标准后≥6周进行。在irSD的情况下，随访的测量值在研究开始后在6周的最小间隔下必须至少一次满足irSD标准。当靶病变和非靶病变均存在时，将分别记录单独的评估。反应的总体评估将包含如表III中描述的所有参数。最佳的总反应是从治疗开始直到疾病进展/复发期间记录的最佳反应(将从治疗开始记录的最小测量值作为肿瘤进展的参考)。患者的最佳反应指定将依赖于测量值和确认标准两者的达成。如果没有后续的随机肿瘤学评估，患者将被定义为是反应不可评价的(NE)。这些患者在肿瘤反应数据的分析中将被看作是失败的。临床疗效评价：性能状态。根据Karnofsky性能状态量表将患者分级。肿瘤标志物反应评估方法尽管在许多恶性肿瘤中没有充分验证的疗效测量，但是肿瘤标志物的系列测定可以允许对作为潜在附加手段的容易进行的、便宜的、定量的临床工具的评价以用于追踪治疗期间的疾病过程。肿瘤标志物减少或增加不会被评定为客观的结果测量。特别地，升高的肿瘤标志物值将不在肿瘤进展的定义中考虑，但是应当提示重复的放射影像学评价以记录是否已经发生了放射影像学肿瘤进展。计算终点定义存活期被定义为从首次研究药物治疗的日期到死亡日期之间的时间。在没有确认死亡的情况下，存活时间将在随访的最后日期进行排除。肿瘤反应率被定义为具有任何客观irCR或irPR证据的患者的比例。TTP定义为从治疗到肿瘤进展的第一次确认记录或到由于任何原因导致的死亡的时间。对于没有肿瘤进展的客观证据以及从研究治疗中排除或给予除研究治疗之外的抗肿瘤治疗的患者，将排除TTP。满足肿瘤标志物进展的标准的肿瘤标志物增加并不构成肿瘤进展的充分客观证据。然而，这样的肿瘤标志物增加应当提示重复的放射影像学评价以证明是否已经发生了客观的肿瘤进展。TTF被定义为从治疗到肿瘤进展的第一次确认记录，或到停止治疗的日期，或到由于任何原因导致的死亡(以先到的时间为准)的时间。在分析时仍然在治疗的患者，以及在客观反应期间被他们的医师排除治疗的患者，以及在停止治疗的日期没有客观肿瘤进展的证据的患者，将不会被认为是治疗失败，除非由于医疗事件的发生而撤出。对于这些患者，TTF将在停止研究的日期进行排除。还将在客观肿瘤进展、停止研究的日期或死亡三者最先发生的之前，对给予除研究治疗之外的抗肿瘤治疗的那些患者进行TTF排除。满足肿瘤标志物进展的标准的肿瘤标志物增加并不构成治疗失败的充分客观证据。然而，这样的肿瘤标志物增加应当提示重复的放射影像学评价以证明客观的肿瘤进展(以及由此造成的治疗失败)是否已经发生。第一确定性能状态恶化的时间为在没有确定的确认性能状态恶化的先前记录的情况下，从治疗到性能状态不比基线差的最后时间或到由于任何原因导致的死亡之间的时间。对于没有确定的性能状态恶化的患者以及从研究中排除或给予除了研究治疗之外的抗肿瘤治疗的患者，将排除确定的性能状态恶化。第一确定体重减轻的时间定义为在没有确定的体重减轻的先前记录的情况下，从治疗到重量百分比从基线减少<5％的最后时间或者到由于任何原因导致的死亡之间的时间。对于没有确定的体重减轻的患者以及从研究中排除或给予除研究治疗之外的抗肿瘤治疗的患者，将排除确定的体重减轻。附加的数据评价可以包括最佳客观反应、确认和不确认的客观反应率、研究治疗的持续时间、新病变首次发生的时间、肿瘤反应时间、24周病情稳定以及24周无进展存活率。如果需要，可以通过RECIST1.1标准来评价数据。治疗施用评估对于IA期和IB期两个阶段：剂量强度被定义为总剂量/周期乘以从治疗开始到最后治疗加13天之间的周数。相对剂量强度百分比被定义为实际剂量强度除以相同时间段的计划剂量强度的比例。实施例7：RxC2-GCV杀伤试验杀伤试验如下进行。在用RxC2处理后细胞被GCV杀伤的百分比取决于测试的癌细胞的可感染性(可转导性)。每种细胞系的细胞在6孔皿中接种。次日，将细胞用包含1:5稀释的EGFP(增强绿色荧光蛋白基因)的逆转录病毒载体转导。48小时后收集细胞。荧光和非荧光细胞使用自动荧光细胞计数器计数以确定转导的百分比。使用携带绿色荧光蛋白的基因的病毒检查转导的效率，其中转导效率以递减的顺序显示。组织来源细胞系EGFP+细胞(％)乳房Hs578T66+/-5乳房HCC-3859+/-2.3皮肤A37557.7+/-7.1肺NCI-H46025.9+/-1.7肝SkHep121.4+/-4胰腺MIAPaca-219.7+/-2胰腺Su868619.6+/-3.3肝HepG218.4+/-4.3肺A54916.3+/-1.5胰腺BxPC313.8+/-3.2肺NCI-H237.9+/-1.2结肠DLD-13.9+/-2.3结肠HT-290.7+/-0.3结肠HCT-150.3+/-1.5结肠RKO0.13+/-0.2针对这里显示的所有细胞系使用相同的病毒制品(滴度2.72E+10TVP)实施例8：表达PiT-2的细胞系的Reximmune-C2介导的GCV杀伤的分析表达PiT-2的细胞系通过用含有PiT-2和新霉素抗性基因的E-Rex表达逆转录病毒载体转导靶细胞而建立。然后药物选择(G418)稳定的细胞系以建立PiT-2表达细胞的纯群体。该细胞系通过将LUC-2基因经双嗜性逆转录病毒载体转导至PiT2表达细胞中接着进行生物发光分析来验证。针对Reximmune-C2细胞杀伤分析，然后将PiT2表达细胞系接种在48孔板中。次日，用Reximmune-C2逆转录病毒载体转导细胞。转导后，将细胞暴露于每日剂量20-40μMGCV。在GCV处理四天后，使用PrestoBlue试剂分析细胞的细胞活力。此试剂是基于刃天青(resazurin)的溶液，其在活细胞的还原环境的存在下将试剂转换成使用吸光度测量定量的荧光。在Reximmune-C2转导和GCV暴露后，人结肠癌系HCT-15表现出差的HSV-TK-GCV杀伤且RKO细胞系没有表现出细胞杀伤。生成表达PIT-2的HCT-15和RKO系并检查其转导效率；结果在下表中提供。细胞系EGFP+细胞(％)PiT-2-CHO-K134+/-2.9PiT-2-MIA-PaCa-278.6+/-2.2PiT-2-HA-HCT-1514.9+/-1.2PiT-2-RKO43.1+/-1.6在所有PiT-2表达细胞系中观察到LNCE-RVE转导效率的显著提高，表明当靶细胞表达PiT2时杀伤活性增高。使用表达PiT-2的细胞系，数据显示LNCE-RVE转导对PiT-2受体的存在的需要由通过荧光显微镜检查分析的细胞中EGFP表达的水平(数据未显示)来反映。Reximmune-C2感染性对PiT-2的存在的需要也已通过GCV细胞杀伤试验得到证明。因此，PiT-2代表了Reximmune-C2的良好生物标记。已确定Pit2表达与Reximmune-C2介导的GCV细胞杀伤相关。CHO-K1亲本系的HSV-TK-GCV杀伤对比表达PIT2的CHO-K1系。图25和26提供了在不存在PiT-2的情况下(各图的图A)或在PiT-2的存在下(各图的图B)，在单次或三次转导后在各种细胞系中单次或三次转导后HSV-TK-GCV杀伤的图形结果。图27提供了在用Reximmune-C2三次转导后在MIA-PACA-2人胰腺癌细胞系中TK-GCV杀伤的结果。GCV杀伤在较高浓度的TVP下是有效的。图28提供了在用Reximmune-C2三次转导PIT-2-MIA-PACA-2细胞后HSV-TK-GCV杀伤的结果。RxC2三次转导的PiT-2-MIA-PaCa2人胰腺癌细胞系的GCV杀伤。PiT-2的存在在较低的TVP浓度下显著地增加了细胞杀伤的量。图32示出了在GCV中4天后RxC2转导的CHO-K1细胞系的图。图33示出了在GCV中4天后RxC2转导的PiT-2-HA-CHO-K1细胞系的图。非常明显地，即使在最低的GCV浓度下，PiT-2的存在允许显著更高的转导和细胞杀伤。实施例9：在ReximmuneC2三次转导后的转导效率与GCV杀伤为了证明转导效率和GCV杀伤，将细胞接种在48孔板中。第二天，用在1:40至1:5120范围内稀释的Reximmune-C2转导细胞。在三次转导的最后一次后，将细胞暴露于日剂量的GCV(20-40μM)持续4天。在GCV的最后剂量后一天，使用Prestoblue试剂分析细胞的细胞活力。此试剂是基于刃天青的溶液，其在活细胞的还原环境的存在下将试剂转化为使用吸光度测量定量的荧光。结果报告为基于未转导的细胞活力的百分比杀伤。细胞系EGFP+细胞(％)HCC-3859+/-2.3A37557.7+/-7.1NCI-H46025.9+/-1.7A54916.3+/-1.5BxPC313.8+/-3.2HCT-150.3+/-1.5图31是描绘在各种癌细胞系的Reximmune-C2三次转导后GCV杀伤的百分比的图。该图证明了在不同的细胞系之间GCV杀伤的变化。在转化为总病毒颗粒/mL的每个稀释度相对于百分比细胞杀伤之间，细胞系是可比的。该表给出了在图中所表示的细胞系的转导效率。百分比效率显示不具有与细胞杀伤的直接关联，但其中更高的效率导致更高的细胞杀伤的趋势是明显的。实施例10：突变HSV-TK细胞蛋白质表达的免疫组织化学(IHC)将ReximmuneC1或C2质粒瞬时转染至293T细胞中并在标准条件下在组织培养载玻片装置上温育，两天后，将细胞用约2％的福尔马林固定，用PBS洗涤，并用0.1％的tritonx100或等效去污剂透化。有效稀释度的第一抗HSV-TK抗体(SantaCruzBiotechnology)与这些细胞在4℃温育过夜。洗涤细胞并在环境室温下与辣根过氧化物酶(HRPO)偶联的抗第一抗体的第二抗体温育1-2小时。将细胞再次洗涤并在室温下施加HRPO检测染色试剂5-30分钟。用配有CCD数码相机的光学显微镜获取IHC图像，照片用图像分析软件捕获。注意：IHC在本实施例中也可以被描述为免疫细胞化学(ICC)。发现野生型载体位于细胞核(如用融合至野生型HSV-TK的荧光基因所确定的)，数据未示出。RexC1在荧光融合(数据未示出)中分布在细胞核和细胞质之间，但在免疫组织化学(IHC；参见图34，左图)中大多数在核中。RexC2在荧光融合(数据未示出)中几乎完全在细胞质中，在IHC中见到向细胞质的一些位移(参见，图34，右图)。实施例11：改进的突变体各种突变的效果与以前公开的构建体例如MargaretBlack描述的那些进行了比较。HSV-TK变体pET构建体对BL21DE3tk(-)细胞的拯救示于下表中：下表描绘了BL21DE3tk(-)细胞被HSV-TK变体pET构建体拯救后的GCV杀伤。在于37C下24小时温育后生长IPTG-+-+-+-+2xYTGCV--2μg/ml2μg/ml20μg/ml20μg/ml50μg/ml50μg/ml-pTK1-++-++-++-+++++pTK2--------+++pTK3-++-++-+/---+++pTK4--------+++pTK5-++-+-+-++++pET24a--------+++关键：PTK#＝编码HSV-TK基因或变体的基于pET30a的细菌蛋白质表达载体；pTK1＝野生型HSV-TK；PTK2＝HSV-TKNESdmNLSA167Y(SR39)；pTK3＝HSV-TK(SR39)(如在Reximmune-C1中)；pTK4＝HSV-TK-NESdmNLSA167F；pTK5＝HSV-TK-NESdmNLSA168H(如在Reximmune-C2中)；pET24a＝空表达载体，作为阴性对照；GCV＝更昔洛韦(在指定浓度下)，IPTG＝异丙基b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(thiogalactopyranoside)(如针对HSV-TK蛋白表达的lac操纵子诱导物)；2xYT＝在琼脂板中的2x酵母/胰蛋白胨细菌培养基，其中在如此标记的列中的试验缺乏IPTG和GCV。所有这些HSV-TK都针对在原核生物中的表达进行了密码子优化，并在IPTG可诱导的pET30a质粒中表达。注意：不具有胸苷酶活性的HSV-TK突变体将不支持这些TK-细菌细胞的生长。实施例12：体外旁观者试验在我们的实验室进行实验，以证明对表达多种TK突变体的癌细胞与非表达细胞的混合物的体外旁观者效应。建立了含有A168H突变HSV-TK-m2基因的A375人黑色素瘤和C6大鼠神经胶质瘤稳定纯群体细胞系。通过与亲本非HSV-TK-m2细胞与相应的范围为0-100％HSV-TK-m2的HSV-TK-m2细胞系的混合物一起接种癌细胞来进行旁观者试验。癌细胞的混合物随后暴露于5-20μMGCV且在下图中绘制细胞杀伤。结果清楚地显示，在混合群体中相比理论上所认为的有显著的增加，而没有旁观者效应。采用不同的突变TK和克隆群体进行超过40个旁观者试验。数据与GCV灵敏度和酶动力学测量以及具有潜力的突变体的生产的病毒滴度进行编辑。图29提供了来自针对多种突变体的一个旁观者体外试验的图形结果。数据支持该突变的HSV-TKA168H基因具有比HSV-TK167或MargaretBlack突变体更高的细胞杀伤和旁观者效应。图30提供了来自旁观者体外试验的图形，其中C6-Hygro-TK克隆用20mMGCV处理。该数据进一步支持了HSV-TKMargaretBlack突变体相比测试的其他突变体具有最低的细胞杀伤。对所有突变体的分析确定了突变TK168dmNES是ReximmuneC-2中的TK基因的首要候选物。实施例13：修饰的TK分子的序列HSV-TK剪接位点去除；密码子优化的TK1(剪接位点校正)ATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCCCTGCGCCCCCGCCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGCCCCCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATCACCATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCCCCCCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCCCCCCCCCCCGCCCTGACCATCTTCCTGGACCGCCACCCCATCGCCTTCATGCTGTGCTACCCCGCCGCCCGCTACCTGATGGGCAGCATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCCCCCACCCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCCCCCCAGGGCGCCGAGCCCCAGAGCAACGCCGGCCCCCGCCCCCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGCGCCCCCGAGCTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCAGCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGAGCCCCGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACCACCCCCGGCAGCATCCCCACCATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAA具有RE’s,+Kozak,2xTKA168H(LIF…AHL)的密码子优化的、全部推定剪接受体位点消融的TK1gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaCTGCGgCCaCGgCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtcaHSV-TK剪接位点去除改善了密码子优化gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaCTGCGgCCaCGgCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtcaHSV-TKNLS去除和在NES中置换gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaCTGCGgCCaCGgCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtcaHSV-TKNLS去除gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaCTGCGgCCaGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtcaHSV-TK定制密码子优化gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGCTCTTATCCTGGACATCAGCATGCTTCTGCTTTTGATCAGGCTGCCAGATCTAGAGGACATTCTAATGGCAGCACAGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAAGCTACAGAAGTGAGACCTGAACAGAAAATGCCTACACTGCTGAGAGTGTATATTGATGGACCACATGGAATGGGAAAAACAACCACAACCCAGCTGCTGGTGGCTCTCGGATCTAGAGATGATATTGTGTATGTGCCTGAACCTATGACATATTGGAGAGTGCTGGGAGCTTCTGAAACAATTGCTAATATCTATACAACACAGCATAGACTGGATCAAGGAGAAATTTCTGCCGGAGATGCTGCCGTGGTGATGACATCTGCTCAGATTACAATGGGAATGCCTTATGCTGTGACAGATGCTGTGCTGGCACCACATATTGGAGGCGAAGCTGGAAGCTCTCATGCACCACCACCAGCACTGACACTGATTTTTGATCGGCATCCAATTGCACATCTGCTGTGTTATCCGGCAGCAAGATATCTGATGGGAAGCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCTTTTGTGGCTCTGATTCCACCAACACTGCCTGGAACAAACATCGTGCTGGGAGCTCTGCCTGAAGATAGACATATCGATCGGCTGGCCAAACGGCAGAGACCTGGAGAACGGCTGGATCTGGCCATGCTGGCTGCCATTCGGAGAGTGTATGGCCTGCTGGCTAACACAGTGAGATATCTGCAGTGTGGAGGCTCTTGGAGAGAGGATTGGGGACAGCTGTCTGGCACAGCTGTGCCACCACAGGGAGCCGAACCACAGAGCAATGCTGGACCACGACCACATATCGGAGACACACTGTTTACACTGTTTCGGGCACCAGAACTGCTGGCACCAAATGGAGACCTGTACAACGTGTTTGCCTGGGCTCTGGATGTGCTGGCTAAACGGCTGAGATCTATGCATGTGTTTATCCTGGACTATGATCAGTCACCGGCCGGATGTCGCGATGCCCTGCTGCAGCTGACATCTGGGATGGTGCAGACACATGTGACAACACCTGGATCTATCCCAACAATCTGTGATCTGGCTAGAACATTCGCTAGGGAGATGGGAGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtcaHSV-TKNLS去除NES和添加gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaCTGCGgCCaGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtcaHSV-TK定制密码子优化gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGCTCTTATCCTGGACATCAGCATGCTTCTGCTTTTGATCAGGCTGCCAGATCTAGAGGACATTCTAATGGCAGCACAGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAAGCTACAGAAGTGAGACCTGAACAGAAAATGCCTACACTGCTGAGAGTGTATATTGATGGACCACATGGAATGGGAAAAACAACCACAACCCAGCTGCTGGTGGCTCTCGGATCTAGAGATGATATTGTGTATGTGCCTGAACCTATGACATATTGGAGAGTGCTGGGAGCTTCTGAAACAATTGCTAATATCTATACAACACAGCATAGACTGGATCAAGGAGAAATTTCTGCCGGAGATGCTGCCGTGGTGATGACATCTGCTCAGATTACAATGGGAATGCCTTATGCTGTGACAGATGCTGTGCTGGCACCACATATTGGAGGCGAAGCTGGAAGCTCTCATGCACCACCACCAGCACTGACACTGATTTTTGATCGGCATCCAATTGCACATCTGCTGTGTTATCCGGCAGCAAGATATCTGATGGGAAGCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCTTTTGTGGCTCTGATTCCACCAACACTGCCTGGAACAAACATCGTGCTGGGAGCTCTGCCTGAAGATAGACATATCGATCGGCTGGCCAAACGGCAGAGACCTGGAGAACGGCTGGATCTGGCCATGCTGGCTGCCATTCGGAGAGTGTATGGCCTGCTGGCTAACACAGTGAGATATCTGCAGTGTGGAGGCTCTTGGAGAGAGGATTGGGGACAGCTGTCTGGCACAGCTGTGCCACCACAGGGAGCCGAACCACAGAGCAATGCTGGACCACGACCACATATCGGAGACACACTGTTTACACTGTTTCGGGCACCAGAACTGCTGGCACCAAATGGAGACCTGTACAACGTGTTTGCCTGGGCTCTGGATGTGCTGGCTAAACGGCTGAGATCTATGCATGTGTTTATCCTGGACTATGATCAGTCACCGGCCGGATGTCGCGATGCCCTGCTGCAGCTGACATCTGGGATGGTGCAGACACATGTGACAACACCTGGATCTATCCCAACAATCTGTGATCTGGCTAGAACATTCGCTAGGGAGATGGGAGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtca实施例14：HAT试验RexRedSuperTKA168H和RexRedTK167F的逆转录病毒载体在293T细胞中生成并用于转导3T3(TK-)细胞。对这些转导的细胞进行HAT选择7-14天。未转导的3T3(TK-)细胞会在HAT选择后死亡。用RexRedSuperTKA168H转导的这些相同细胞却从HAT选择中幸存，但用RexRedTK167F转导的3T3(TK-)细胞没有从HAT选择中幸存。这是+/-细胞存活试验，存活的细胞被固定并用在甲醇中的1％亚甲蓝染色。基于先前的转导的HAT细胞杀伤试验揭示了对于在包含RFP标记物的逆转录病毒载体中的A167FHSV-TK突变体，GCV相比胸苷的特异性。该特异性在1xHAT剂量的72小时和7天试验中在NIH3T3细胞中发现。基于当前转导的HAT细胞杀伤试验揭示了对于在包含RFP标记物的逆转录病毒载体中的A167FHSV-TK突变体，GCV相比胸苷的特异性。该特异性在2xHAT剂量的7天试验中在NIH3T3细胞中发现。基于转导的HAT细胞杀伤试验揭示了对于在包含RFP标记物的逆转录病毒载体中的A167FHSV-TK突变体，GCV相比胸苷的特异性。该特异性在1xHAT剂量的72小时试验和7天试验中在NIH3T3细胞中发现。基于转导的HAT细胞杀伤试验揭示了对于在包含HygroR标记物的逆转录病毒载体中的A167FHSV-TK突变体，GCV相比胸苷的特异性。该特异性在1xHAT剂量的72小时和7天试验中在NIH3T3细胞中发现。实施例15：GCV杀伤试验将细胞接种在24孔皿中。细胞在第二天用逆转录病毒载体的6个稀释液(1：4-4096)转导。第二天将0-200μM的GCV加入到细胞中。在GCV处理7天后，固定细胞，且活细胞用在甲醇中的1％亚甲蓝染色。病毒突变体的效力越高，会导致更多的细胞杀伤。基于先前转导的HSV-TK/GCV细胞杀伤试验揭示了在包含RFP标记物的逆转录病毒载体中的A168F、A167F和A168HHSV-TK突变体的效力顺序。当在72小时和7天试验中以高GCV剂量(1mM–125mM)在RgA375细胞中测试时，此顺序是A168H>A168F＝A167F。基于当前转导的HSV-TK/GCV细胞杀伤试验揭示了在包含RFP标记物的逆转录病毒载体中的A167F和A168HHSV-TK突变体的效力顺序。当在7天的测定中以高GCV剂量(0.2mM–0.05mM)在RgA375细胞中测试时，此顺序是A168H>A167F。dmNLS或NES的加入并没有显示改变此顺序。JCO的使用确实显示降低滴度和聚集HSV-TK细胞杀伤活性。基于转导的HSV-TK/GCV细胞杀伤试验揭示了在包含RFP标记物的逆转录病毒载体中的A168F、A167F和A168HHSV-TK突变体的效力顺序。当在72小时试验中在高GCV剂量(1mM–125mM)下在A375和RgA375细胞中测试时，此顺序是A168H>A168F＝A167F。基于转导的HSV-TK/GCV细胞杀伤试验揭示了在包含RFP标记物的逆转录病毒载体中的A168F、A167F和A168HHSV-TK突变体的效力顺序。当在72小时试验中在高GCV剂量(1mM–500mM)下在NIH3T3细胞中测试时，该顺序是A168H>A168F＝A167F。基于转导的HSV-TK/GCV细胞杀伤试验揭示了在包含RFP标记物的逆转录病毒载体中的A168F、A167F和A168HHSV-TK突变体的效力顺序。当在72小时和7天测定中在高GCV剂量(1mM–125mM)下在RgA375细胞中测试时，该顺序是A168H>A168F＝A167F。基于转导的HSV-TK/GCV细胞杀伤试验揭示了在包含RFP或HygroR标记物的逆转录病毒载体中的A168F、A167F和A168HHSV-TK突变体的效力顺序。当在72小时试验中在高GCV剂量(1mM–125mM)下在A375、RgA375或NIH3T3细胞中测试时，该顺序是A168H>A168F＝A167F。基于转导的HSV-TK/GCV细胞杀伤试验揭示了在包含HygroR标记物的逆转录病毒载体中的A168F、A167F和A168HHSV-TK突变体的效力顺序。当在72小时试验中在高GCV剂量(1mM–125mM)下在A375和RgA375细胞中测试时，该顺序是A168H>A168F＝A167F。基于转导的HSV-TK/GCV细胞杀伤试验揭示了在包含HygroR标记物的逆转录病毒载体中的A168F、A167F和A168HHSV-TK突变体的效力顺序。当在72小时试验中在高GCV剂量(1mM–500mM)下在NIH3T3细胞中测试时，该顺序是A168H>A168F＝A167F。实施例16：Hygro抗性在潮霉素的存在下选择用逆转录病毒载体Hygro-HSV-TK突变体转导的细胞系以产生含有Hygro-HSV-TK突变体和表达潮霉素抗性基因的纯细胞群体。A375Reximmune-C2样细胞系：A375Hygro选择的HSV-TKdmNESA168H细胞系已被转化为Luc(+)。上述细胞系具有与亲本系相同的GCV杀伤。仅A375Luc(+)细胞系具有与上述细胞系相同的Luc活性。C6Reximmune-C2样细胞系：C6Hygro选择的HSV-TKdmNESA168H细胞系已被转化为Luc(+)。上述细胞系具有与亲本系相同的GCV杀伤。仅C6Luc(+)细胞系具有与上述细胞系相同的Luc活性。尽管本文已经示出并描述了优选的实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离所公开的实施方案的情况下，本领域技术人员现将会想到很多变化、改变和替代。应理解，本文中所述的实施方案的各种替代方案可用于实施该实施方案。旨在以下述权利要求限定实施方案的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。缩写ALT丙氨酸转氨酶ANC嗜中性粒细胞绝对计数AST天冬氨酸转氨酶AUC血浆浓度-时间曲线下面积BSA体表面积(mg/m2)CL全身血浆清除率Cmax血浆峰值浓度CR完全反应CRF病例报告表CT计算机断层扫描CTC常见毒性标准DLT剂量限制性毒性EOI输注结束FDA美国食品与药品管理局G-CSF粒细胞集落刺激因子(非格司亭(filgrastim)，)GCP优良临床规范GM-CSF粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(沙格司亭(sargramostim)，)HIV人类免疫缺陷病毒HR风险比IEC独立伦理委员会i.p.腹膜内IRB机构审查委员会IV静脉内，通过静脉内LD10或使10％或50％的动物致死的剂量LD50LDH乳酸脱氢酶MAD最大施用剂量MRI磁共振成像MTD最大耐受剂量NCI国立癌症研究所NE肿瘤反应不可评价NOAEL未观察到不良作用水平Non-CR非完全反应Non-PD非疾病进展PBMC外周血单核细胞PCE丙二醇：EL：乙醇PD疾病进展PR部分反应SAER-S严重不良事件报告-研究SC皮下的，通过皮下SD病情稳定STD10对10％的动物为严重毒性的剂量TTP进展时间TTF失败时间T1/2半衰期Tmax最大血浆浓度时的时间Vss稳态分布体积参考文献1.Lentivirus-basedDsRed-2-transfectedpancreaticcancercellsfordeepinvivoimagingofmetastaticdisease.YuZ,ZhouJ,HoffmanRM.,MethodsMolBiol.2012；872:69-83.doi:10.1007/978-1-61779-797-2_5.2.Color-codedreal-timesubcellularfluorescenceimagingoftheinteractionbetweencancerandhostcellsinlivemice.YamauchiK,TomeY,YamamotoN,HayashiK,KimuraH,TsuchiyaH,TomitaK,BouvetM,HoffmanRM.AnticancerRes.2012Jan；32(1):39-43.3.Lentivirus-basedDsRed-2-transfectedpancreaticcancercellsfordeepinvivoimagingofmetastaticdisease.ZhouJ,YuZ,ZhaoS,HuL,ZhengJ,YangD,BouvetM,HoffmanRM.JSurgRes.2009Nov；157(1):63-70.doi:10.1016/j.jss.2008.08.027.Epub2008Oct9.4.FluorescentLYVE-1antibodytoimagedynamicallylymphatictraffickingofcancercellsinvivo.McElroyM,HayashiK,Garmy-SusiniB,KaushalS,VarnerJA,MoossaAR,HoffmanRM,BouvetM.JSurgRes.2009Jan；151(1):68-73.doi:10.1016/j.jss.2007.12.769.Epub2008Jan18.5.LentiviralreporterconstructsforfluorescencetrackingofthetemporospatialpatternofSmad3signaling.StueltenCH,KamarajuAK,WakefieldLM,RobertsAB.Biotechniques.2007Sep；43(3):289-90,292,294.6.Subcellularimaginginthelivemouse.HoffmanRM,YangM.NatProtoc.2006；1(2):775-82.7.Invivocolor-codedimagingoftheinteractionofcoloncancercellsandsplenocytesintheformationoflivermetastases.BouvetM,TsujiK,YangM,JiangP,MoossaAR,HoffmanRM.CancerRes.2006Dec1；66(23):11293-7.8.Dual-colorimagingofnuclear-cytoplasmicdynamics,viability,andproliferationofcancercellsintheportalveinarea.TsujiK,YamauchiK,YangM,JiangP,BouvetM,EndoH,KanaiY,YamashitaK,MoossaAR,HoffmanRM.CancerRes.2006Jan1；66(1):303-6.9.FL-CTLassay:fluorolysometricdeterminationofcell-mediatedcytotoxicityusinggreenfluorescentproteinandredfluorescentproteinexpressingtargetcells.ChenK,ChenL,ZhaoP,MarreroL,KeoshkerianE,RamsayA,CuiY.JImmunolMethods.2005May；300(1-2):100-14.10.Murineleukemiavirus(MLV)replicationmonitoredwithfluorescentproteins.SlivaK,ErlweinO,BittnerA,SchnierleBS.VirolJ.2004Dec20；1:14.11.Real-timewhole-bodyimagingofanorthotopicmetastaticprostatecancermodelexpressingredfluorescentprotein.YangM,JiangP,YamamotoN,LiL,GellerJ,MoossaAR,HoffmanRM.Prostate.2005Mar1；62(4):374-9.12.Cellulardynamicsvisualizedinlivecellsinvitroandinvivobydifferentialdual-colornuclear-cytoplasmicfluorescent-proteinexpression.YamamotoN,JiangP,YangM,XuM,YamauchiK,TsuchiyaH,TomitaK,WahlGM,MoossaAR,HoffmanRM.CancerRes.2004Jun15；64(12):4251-6.13.Invivoimagingwithfluorescentproteins:thenewcellbiology.HoffmanRM.ActaHistochem.2004；106(2):77-87.14.Real-timeimagingofindividualfluorescent-proteincolor-codedmetastaticcoloniesinvivo.YamamotoN,YangM,JiangP,XuM,TsuchiyaH,TomitaK,MoossaAR,HoffmanRM.ClinExpMetastasis.2003；20(7):633-8.15.YaghoubiS,BarrioJR,DahlbomM,IyerM,NamavariM,SatyamurthyN,GoldmanR,HerschmanHR,PhelpsME,GambhirSS.Humanpharmacokineticanddosimetrystudiesof[(18)F]FHBG:areporterprobeforimagingherpessimplexvirustype-1thymidinekinasereportergeneexpression.JNuclMed.2001Aug；42(8):1225-34.16.A,CollantesM,BeattieSG,OtanoI,SnapperJ,TimmermansE,GuembeL,PetryH,LanciegoJL,BenitoA,PrietoJ,Rodriguez-PenaMS,I,Gonzalez-AseguinolazaG.Adeno-associatedviruslivertransductionefficiencymeasuredbyinvivo[18F]FHBGpositronemissiontomographyimaginginrodentsandnonhumanprimates.HumGeneTher.2011Aug；22(8):999-1009.doi:10.1089/hum.2010.190.Epub2011Apr6.17.JohnsonM,KaranikolasBD,PricemanSJ,PowellR,BlackME,WuHM,CzerninJ,HuangSC,WuL.TitrationofvariantHSV1-tkgeneexpressiontodeterminethesensitivityof[18F]FHBGPETimaginginaprostatetumor.JNuclMed.2009May；50(5):757-64.doi:10.2967/jnumed.108.058438.Epub2009Apr16.18.I,MazzoliniG,BoánJF,SangroB,Martí-ClimentJ,RuizM,RuizJ,SatyamurthyN,QianC,BarrioJR,PhelpsME,RichterJA,GambhirSS,PrietoJ.PositronEmissionTomographyImagingofAdenoviral-MediatedTransgeneExpressioninLiverCancerPatientsGastro(2005)128:1787.19.SangroB,MazzoliniG,RuizM,RuizJ,QuirogaJ,HerreroI,QianC,BenitoA,LarracheJ,OlagüeC,BoanJ,I,SádabaB,PrietoJ.AphaseIclinicaltrialofthymidinekinase-basedgenetherapyinadvancedhepatocellularcarcinomaCan.GeneTher.(2010)17:837–843.20.WillmannJK,PaulmuruganR,Rodriguez-PorcelM,SteinW,BrintonTJ,ConnollyAJ,NielsenCH,LutzAM,LyonsJ,IkenoF,SuzukiY,RosenbergJ,ChenIY,WuJC,YeungAC,YockP,RobbinsRC,GambhirSS.Imaginggeneexpressioninhumanmesenchymalstemcells:fromsmalltolargeanimals.Radiology.2009Jul；252(1):117-27.doi:10.1148/radiol.2513081616.Epub2009Apr14.PubMedPMID:19366903；PubMedCentralPMCID:PMC2702468.21.YaghoubiSS,JensenMC,SatyamurthyN,BudhirajaS,PaikD,CzerninJ,GambhirSS.NoninvasivedetectionoftherapeuticcytolyticTcellswith18FFHBGPETinapatientwithglioma.NatClinPractOncol.2009Jan；6(1):53-8.doi:10.1038/ncponc1278.Epub2008Nov18.PubMedPMID:19015650；PubMedCentralPMCID:PMC3526373.22.RoelantsV,LabarD,deMeesterC,HavauxX,TabilioA,GambhirSS,DiIanniM,BolA,BertrandL,VanoverscheldeJL.ComparisonbetweenadenoviralandretroviralvectorsforthetransductionofthethymidinekinasePETreportergeneinratmesenchymalstemcells.JNuclMed.2008Nov；49(11):1836-44.doi:10.2967/jnumed.108.052175.Erratumin:JNuclMed.2009Jan；50(1):17.PubMedPMID:18984872.23.LeeSW,PadmanabhanP,RayP,GambhirSS,DoyleT,ContagC,GoodmanSB,BiswalS.Stemcell-mediatedacceleratedbonehealingobservedwithinvivomolecularandsmallanimalimagingtechnologiesinamodelofskeletalinjury.JOrthopRes.2009Mar；27(3):295-302.doi:10.1002/jor.20736.PubMedPMID:18752273.24.ChinFT,NamavariM,LeviJ,SubbarayanM,RayP,ChenX,GambhirSS.Semiautomatedradiosynthesisandbiologicalevaluationof[18F]FEAU:anovelPETimagingagentforHSV1-tk/sr39tkreportergeneexpression.MolImagingBiol.2008Mar-Apr；10(2):82-91.Epub2007Dec22.PubMedPMID:18157580.25.YaghoubiSS,GambhirSS.PETimagingofherpessimplexvirustype1thymidinekinase(HSV1-tk)ormutantHSV1-sr39tkreportergeneexpressioninmiceandhumansusing[18F]FHBG.NatProtoc.2006；1(6):3069-75.PubMedPMID:17406570.26.DerooseCM,DeA,LoeningAM,ChowPL,RayP,ChatziioannouAF,GambhirSS.Multimodalityimagingoftumorxenograftsandmetastasesinmicewithcombinedsmall-animalPET,small-animalCT,andbioluminescenceimaging.JNuclMed.2007Feb；48(2):295-303.PubMedPMID:17268028；PubMedCentralPMCID:PMC3263830.27.KimSJ,DoudetDJ,StudenovAR,NianC,RuthTJ,GambhirSS,McIntoshCH.Quantitativemicropositronemissiontomography(PET)imagingfortheinvivodeterminationofpancreaticisletgraftsurvival.NatMed.2006Dec；12(12):1423-8.Epub2006Dec3.PubMedPMID:17143277.28.YaghoubiSS,CoutoMA,ChenCC,PolavaramL,CuiG,SenL,GambhirSS.Preclinicalsafetyevaluationof[18F]FHBG:aPETreporterprobeforimagingherpessimplexvirustype1thymidinekinase(HSV1-tk)ormutantHSV1-sr39tk'sexpression.JNuclMed.2006Apr；47(4):706-15.PubMedPMID:16595506.29.XiongZ,ChengZ,ZhangX,PatelM,WuJC,GambhirSS,ChenX.Imagingchemicallymodifiedadenovirusfortargetingtumorsexpressingintegrinalphavbeta3inlivingmicewithmutantherpessimplexvirustype1thymidinekinasePETreportergene.JNuclMed.2006Jan；47(1):130-9.PubMedPMID:16391197.30.ShuCJ,GuoS,KimYJ,ShellySM,NijagalA,RayP,GambhirSS,RaduCG,WitteON.Visualizationofaprimaryanti-tumorimmuneresponsebypositronemissiontomography.ProcNatlAcadSciUSA.2005Nov29；102(48):17412-7.Epub2005Nov17.PubMedPMID:16293690；PubMedCentralPMCID:PMC1283986.31.SenL,GambhirSS,FurukawaH,StoutDB,LinhLamA,LaksH,CuiG.Noninvasiveimagingofexvivointracoronarilydeliverednonviraltherapeutictransgeneexpressioninheart.MolTher.2005Jul；12(1):49-57.PubMedPMID:15963920.32.YaghoubiSS,BarrioJR,NamavariM,SatyamurthyN,PhelpsME,HerschmanHR,GambhirSS.Imagingprogressofherpessimplexvirustype1thymidinekinasesuicidegenetherapyinlivingsubjectswithpositronemissiontomography.CancerGeneTher.2005Mar；12(3):329-39.PubMedPMID:15592447.33.MiyagawaM,AntonM,HaubnerR,SimoesMV,C,ErhardtW,RederS,LehnerT,WagnerB,NollS,NollB,GroteM,GambhirSS,GansbacherB,SchwaigerM,BengelFM.PETofcardiactransgeneexpression:comparisonof2approachesbasedonherpesviralthymidinekinasereportergene.JNuclMed.2004Nov；45(11):1917-23.PubMedPMID:15534063.34.GreenLA,NguyenK,BerenjiB,IyerM,BauerE,BarrioJR,NamavariM,SatyamurthyN,GambhirSS.Atracerkineticmodelfor[18F]FHBGforquantitatingherpessimplexvirustype1thymidinekinasereportergeneexpressioninlivinganimalsusingPET.JNuclMed.2004Sep；45(9):1560-70.PubMedPMID:15347725.35.WuJC,ChenIY,WangY,TsengJR,ChhabraA,SalekM,MinJJ,FishbeinMC,CrystalR,GambhirSS.Molecularimagingofthekineticsofvascularendothelialgrowthfactorgeneexpressioninischemicmyocardium.Circulation.2004Aug10；110(6):685-91.PubMedPMID:15302807.36.SuH,ForbesA,GambhirSS,BraunJ.Quantitationofcellnumberbyapositronemissiontomographyreportergenestrategy.MolImagingBiol.2004May-Jun；6(3):139-48.PubMedPMID:15193248.37.ChenIY,WuJC,MinJJ,SundaresanG,LewisX,LiangQ,HerschmanHR,GambhirSS.Micro-positronemissiontomographyimagingofcardiacgeneexpressioninratsusingbicistronicadenoviralvector-mediatedgenedelivery.Circulation.2004Mar23；109(11):1415-20.Epub2004Mar8.PubMedPMID:15007006.38.SundaresanG,PaulmuruganR,BergerF,StilesB,NagayamaY,WuH,GambhirSS.MicroPETimagingofCre-loxP-mediatedconditionalactivationofaherpessimplexvirustype1thymidinekinasereportergene.GeneTher.2004Apr；11(7):609-18.PubMedPMID:14724687.39.GreenLA,YapCS,NguyenK,BarrioJR,NamavariM,SatyamurthyN,PhelpsME,SandgrenEP,HerschmanHR,GambhirSS.Indirectmonitoringofendogenousgeneexpressionbypositronemissiontomography(PET)imagingofreportergeneexpressionintransgenicmice.MolImagingBiol.2002Jan；4(1):71-81.PubMedPMID:14538050.40.Miller,A.andWolgamot,G.MurineretrovirusesuseatleastsixdifferentreceptorsforentryintoMusdunnicells.J.Virol.1997June；9:4531-35.41.ChaudryG.J.等人GibbonapeleukemiavirusreceptorfunctionsofTypeIIIphosphatetransportersfromCHOK1cellsaredisruptedbytwomechanisms.J.Virol.1999Apr.；73:2916-20.42.XuandEiden.PrimategammaretrovirusesrequireanancillaryfactornotrequiredformurinegammaretrovirusestoinfectBHKcells.J.Virol.2011April；85:3498-506.43.Zeijl等人Ahumanamphotrophicretrovirusreceptorisasecondmemberofthegibbonapeleukemiavirusreceptorfamily.Proc.Nat’lAcad.Sci.1994Feb.；91:1168-72.44.Feldman等人IdentificationofanextracellulardomainwithintheHumanPiT-2receptorthatisrequiredforamphotrophicmurineleukemiavirusbinding.J.Virol.2004Jan；78:595-602.45.MacDonald等人EffectofchangesintheexpressionoftheamphotrophicretroviralreceptorPiT-2ontransductionefficiencyandviraltiter:Implicationsforgenetherapy.Hum.GeneTher.2000March；11:587-95.46.Farrell等人NewstructuralarrangementoftheextracellularregionsofthephosphatetransporterSLC20A1,thereceptorforgibbonapeleukemiavirus.J.Biol.Chem.2009Oct.；284:29979-987.47.Farrell等人Fusiondefectivegibbonapeleukemiavirusvectorscanberescuedbyhomologousbutnotheterologoussolubleenvelopeproteins.J.Virol.2002May；76:4267-74.48.Orlic等人ThelevelofmRNAencodingtheamphotrophicretrovirusreceptorinmouseandhumanhematopoieticstemcellsislowandcorrelateswithwiththeefficiencyofretrovirustransduction.Proc.Nat’lAcad.Sci1996Oct；93:11097-102.49.Naviaus等人pCLvectorsystem:rapidproductionofhelper-free,high-titer,recombinantretroviruses.J.Virol.1996Aug；70:5701-5.50.Fuchita等人Bacterialcytosinedeaminasemutantscreatedbymolecularengineeringshowimproved5-fluorocytosine-mediatedcellkillinginvitroandinvivo.CancerRes.2009Jun；69:4791-9.51.Stolworthy等人Yeastcytosinedeaminasemutantswithincreasedthermostabilityimpartsensitivityto5-fluorocytosine.J.Mol.Biol.2008Mar；377:854-69.52.Grabarczyk等人ExpressionofPiT-1andPiT-2retroviralreceptorsandtransductionefficiencyoftumorcells.ActaBiochim.Pol.2002；49:333-9.53.Miller和Rosman.Improvedretroviralvectorsforgenetransferandexpression.Biotechniques1989Oct；7:980-2；984-6；989-90.54.Chalmers等人Eliminationofthetruncatedmessagefromtheherpessimplexvirusthymidinekinasesuicidegene.Mol.Ther.4:146-8(2001).序列SEQIDNO:1:野生型HSV1-TK核苷酸序列atggcttcgtaccccggccatcaacacgcgtctgcgttcgaccaggctgcgcgttctcgcggccatagcaaccgacgtacggcgttgcgccctcgccggcagcaagaagccacggaagtccgcccggagcagaaaatgcccacgctactgcgggtttatatagacggtccccacgggatggggaaaaccaccaccacgcaactgctggtggccctgggttcgcgcgacgatatcgtctacgtacccgagccgatgacttactggcgggtgctgggggcttccgagacaatcgcgaacatctacaccacacaacaccgcctcgaccagggtgagatatcggccggggacgcggcggtggtaatgacaagcgcccagataacaatgggcatgccttatgccgtgaccgacgccgttctggctcctcatatcgggggggaggctgggagctcacatgccccgcccccggccctcaccctcatcttcgaccgccatcccatcgccgccctcctgtgctacccggccgcgcggtaccttatgggcagcatgaccccccaggccgtgctggcgttcgtggccctcatcccgccgaccttgcccggcaccaacatcgtgcttggggcccttccggaggacagacacatcgaccgcctggccaaacgccagcgccccggcgagcggctggacctggctatgctggctgcgattcgccgcgtttacgggctacttgccaatacggtgcggtatctgcagtgcggcgggtcgtggcgggaggactggggacagctttcggggacggccgtgccgccccagggtgccgagccccagagcaacgcgggcccacgaccccatatcggggacacgttatttaccctgtttcgggcccccgagttgctggcccccaacggcgacctgtataacgtgtttgcctgggccttggacgtcttggccaaacgcctccgttccatgcacgtctttatcctggattacgaccaatcgcccgccggctgccgggacgccctgctgcaacttacctccgggatggtccagacccacgtcaccacccccggctccataccgacgatatgcgacctggcgcgcacgtttgcccgggagatgggggaggctaactgaSEQIDNO:2:野生型HSV1-TK氨基酸序列MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRSMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEANSEQIDNO:3:Reximmune-CHSV-TK中的HSV-TK；NLS的SR39突变体和R25G-R26S突变atggcctcgtaccccggccatcaacacgcgtctgcgttcgaccaggctgcgcgttctcgcggccatagcaacggatccacggcgttgcgccctcgccggcagcaagaagccacggaagtccgcccggagcagaaaatgcccacgctactgcgggtttatatagacggtccccacgggatggggaaaaccaccaccacgcaactgctggtggccctgggttcgcgcgacgatatcgtctacgtacccgagccgatgacttactggcgggtgctgggggcttccgagacaatcgcgaacatctacaccacacaacaccgcctcgaccagggtgagatatcggccggggacgcggcggtggtaatgacaagcgcccagataacaatgggcatgccttatgccgtgaccgacgccgttctggctcctcatatcgggggggaggctgggagctcacatgccccgcccccggccctcaccatcttcctcgaccgccatcccatcgccttcatgctgtgctacccggccgcgcggtaccttatgggcagcatgaccccccaggccgtgctggcgttcgtggccctcatcccgccgaccttgcccggcaccaacatcgtgcttggggcccttccggaggacagacacatcgaccgcctggccaaacgccagcgccccggcgagcggctggacctggctatgctggctgcgattcgccgcgtttacgggctacttgccaatacggtgcggtatctgcagtgcggcgggtcgtggcgggaggactggggacagctttcggggacggccgtgccgccccagggtgccgagccccagagcaacgcgggcccacgaccccatatcggggacacgttatttaccctgtttcgggcccccgagttgctggcccccaacggcgacctgtataacgtgtttgcctgggccttggacgtcttggccaaacgcctccgttccatgcacgtctttatcctggattacgaccaatcgcccgccggctgccgggacgccctgctgcaacttacctccgggatggtccagacccacgtcaccacccccggctccataccgacgatatgcgacctggcgcgcacgtttgcccgggagatgggggaggctaactgaSEQIDNO:4(由SEQIDNO:3编码的氨基酸序列)MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNGSTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTIFLDRHPIAFMLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRSMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEANSEQIDNO:5:待突变的HSV-TK位点以粗体下划线显示(HSV-TK核定位序列，RR，和底物结合域，LIF和AAL)SEQIDNOS:6和7:SacI-KpnI(SR39)突变区CACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCTCTCTCGACCGCCATCCCATCGCC-TCGAGTGTACGGGGCGGGGGCCGGGAGTGGAGAGAGCTGGCGGTAGGGTAGCGG-SacI-CTCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTAC(SEQIDNO:6)-GAGACACGATGGGCCGGCGCGC(SEQIDNO:7)KpnISEQIDNOS:8和9:SacI-KpnI(SR39)突变区(切割)CACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCTCTCTCGACCGCCATCCCATCGCCCTTCGAGTGTACGGGGCGGGGGCCGGGAGTGGAGAGAGCTGGCGGTAGGGTAGCGGSacI(切割)CTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTAC(SEQIDNO:8)GAGACACGATGGGCCGGC(SEQIDNO:9)KpnI(切割)SEQIDNOS:10和11：引物SR39sackpnF15’CACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCTCTCTCGACCGCCATCCCATCGCCCTCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTAC3’(SEQIDNO:10)SR39sackpnR15’CGCGCGGCCGGGTAGCACAGAGGGCGATGGGATGGCGGTCGAGAGAGGTGAGGGCCGGGGGCGGGGCATGTGAGCT3’(SEQIDNO:11)SEQIDNO:12基因#3mHSV-TKCOA168H(LIF...AHL):长度:1185GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCACGGCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTCGACCGGCACCCAATCGCACACCTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCACCACAGGGCGCCGAGCCACAGAGCAACGCCGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTCACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACAACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCASEQIDNO:13基因#4mHSV-TKCOTKA167F(LIF...FAL):长度:1185GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCACGGCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTCGACCGGCACCCAATCTTCGCACTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGC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