一种基于微流芯片与智能手机的快速活菌计数系统的制作方法

本发明属于生物技术和仪器科学领域，具体的说是一种基于微流芯片与智能手机的快速活菌计数系统。

背景技术：

活菌数是指一定质量/体积样品中能够正常生长繁殖的细菌数，该指标能有效反映生产环节安全与产品质量，例如对纯净水制取过程中大肠杆菌的检测计数、奶制品中乳酸杆菌的检测计数。因而活菌数是多种生产领域如食品、饮料、药品、化妆品产品质量与评价体系(如HACCP)中一项关键监测项目，且越来越多地被应用到诸如医学诊断、污水处理评价等新领域。

针对细菌检测计数方法已有诸多报道，如PCR法、电阻抗法、自动免疫技术、生物荧光法等，以上方法通过测定细菌中核酸或某些代谢物含量间接得出细菌数，因而从原理上无法直接反映活菌数量，亦无法区分开活菌和包括凋亡细菌在内的无活力细菌。流式细胞术可实现对活菌的快速直接计数，但仪器和试剂价格昂贵，导致单次检测成本较高，推广难度较大。目前活菌计数的通行标准依然是基于细菌培养的平板涂布法，但该方法要求制备培养基、人工涂布和菌落计数加之长时间细菌培养以形成可见菌落导致耗时长(24h以上)，操作繁琐工作量大，不适合于现场检测操作。

基于微流芯片发展而来的液滴技术具有快速分离包裹单个细菌、封闭无交叉污染、培养周期短(4-6小时)等特点，结合广泛使用的智能手机平台可实现现场自动化快速活菌绝对计数，具有简易、低廉、易推广的特点。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述不足之处，本发明将液滴技术结合智能手机平台实现活菌绝对计数，提出一种基于微流芯片与智能手机的快速活菌计数系统，

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种基于微流芯片与智能手机的快速活菌计数系统，包括：

液滴发生装置，用于对细菌悬浮液进行液滴包裹、培养和增殖；

液滴识别计数装置，用于增殖后液滴的成像，并对液滴图像进行处理，识别出指定大小的液滴并判断其是否有菌，计算得出细菌悬浮液的CFU值。

所述液滴发生装置包括基于真空微流的微流控芯片，该微流控芯片包括：

连续油相入口，用于接入取有氟碳油的移液器枪头，将氟碳油导入微流控芯片内的通道中；

细菌悬浮液入口，用于接入取有细菌悬浮液的移液器枪头，将细菌悬浮液导入微流控芯片内的通道中；

第一非线性流阻，通过微流控芯片的通道连通连续油相入口，用于流速制动，为均一液滴发生提供稳定的两相流速比；

第二非线性流阻，通过微流控芯片的通道连通细菌悬浮液入口，用于流速制动，为均一液滴发生提供稳定的两相流速比；

十字形夹流汇口，用于通过微流控芯片的通道连通第一非线性流阻和第二非线性流阻，借助油相对水相的剪切作用产生均一油包水微液滴，完成对细菌的分离和单个包裹；

流储矩阵，包括若干个顺序连通的流储单元，用于通过和最终储存产生的液滴，是细菌液滴内在线培养和后期手机成像的基本单元；

第三非线性流阻，通过微流控芯片的通道将一端连通流储单元的出口，另一端连通出口，用于流速制动，为恒定高频液滴发生提供稳定的总体流速；

所述液滴发生装置还包括：

导管，用于将出口连通注射器，

注射器，用于产生源负压并经导管、出口传递至微流芯片内；

夹子，用于固定拉伸后的注射器活塞形成稳定负压。

所述流储单元为矩形，非连通部位的两对角为圆角。

所述微流控芯片是由上层和下层有机硅、塑料、玻璃或石英基片键和而成的。

所述上层基片包含通过湿法刻蚀得到的微米级微通道网络，

所述第一非线性流阻、第二非线性流阻和第三非线性流阻的基本单元为U形，尺寸在微米级。

所述液滴识别计数装置包括：

面阵光源，用于产生采集液滴浊度信息的平行入射光线，使入射光线从液滴识别计数装置底片一侧垂直射入，经过液滴间质、液滴及其内含物后，形成总出射光；

透镜片，用于放大出射光信息；

智能手机，用于收集放大后的出射光信息，经内部的感光元件处理后形成液滴图像，并采用手机App加载液滴图像，经过图像灰度变换、阈值分析、边缘提取、特征识别，识别指定大小的液滴，然后对识别的液滴进行有菌和无菌的判断，然后经统计显示最终菌液样本CFU值。

本发明具有以下优点及有益效果：

1.本发明有效利用微流控芯片的微液滴包裹技术，通过液滴包裹取代传统涂布的方法分散样本中活菌个体，有效地利用液滴微培养器(皮升至纳升)优势，创新性地结合智能手机实现活菌计数的目的。

2.本发明运用VM液滴发生技术，通过引入非线性流阻设计实现高效均一液滴细菌包裹的目的，无外部动力装置如注射泵的限制；微流芯片检测完成后及时清洗可重复使用，以上均降低了检测成本。

3.本发明液滴发生和图像处理过程均为自动化处理，相比平板涂布法制备培养基、多板涂布和菌落计数，操作简易快捷。

4.本发明直接计数量程在1,000cfu/ml～100,000cfu/ml，借助浓缩或稀释的方法可将有效检测范围扩展至1cfu/ml～10,000,000,000cfu/ml。

5.本发明方法相比于传统平板涂布的方法具有操作简、耗时短、成本低、可扩展性强等优点。

附图说明

图1为基于VMC和iphone6plus平台的快速大肠杆菌绝对计数流程示意图；

图2为真空微流控芯片示意图；

其中，1、连续油相入口；2、细菌悬浮液入口；3、第一非线性流阻；4、第二非线性流阻；5、十字形夹流汇口；6、流储单元；7、流储矩阵；8、出口；9、导管；10、注射器；11、夹子；12、第三非线性流阻。

图3为智能手机采集VMC中液滴浊度信息装置示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明。

如图1所示，本发明包括微流控芯片、注射器、导管、氟碳油、高效液体培养基、智能手机、透镜片、面光源、图像识别与分析软件。该系统工作过程如下：通过微流控芯片出口外接注射器在芯片内产生用于驱动液滴发生的负压，驱动氟碳油(连续相)与菌液(分散相)由入口进入芯片通道，两相液体经芯片内置非线性流阻后在芯片十字形夹流处获得稳定流速比，利用油水剪切力产生稳定均一高频皮升至纳升级液滴，该随机包裹过程形成的空液滴与包裹有单个细菌的液滴符合泊松分布规律。所有液滴在芯片流储单元进行在线适温培养，经细菌生长分裂后在有菌液滴与空液滴之间形成明显空或非空的二元浊度差异。借助自行搭建的面光源-透镜片-智能手机成像平台对培养后液滴进行图像采集，采集图片后自动加载到自主开发的液滴识别计数App软件系统中进行总液滴与总非空液滴初始值统计，经计算处理后得出最终样本CFU值。本发明提供了一套简易快速活菌检测计数的系统和方法，相比于通行的平板涂布计数法具有操作简、耗时短、成本低等优点。

本发明所用液滴发生装置为基于真空微流(vacuum microfluidics,VM)的微流控芯片(vacuum microfluidics chip,VMC)(如图2所示)。微流控芯片包括连续油相入口1、细菌悬浮液入口2、第一非线性流阻3、第二非线性流阻4、十字形夹流汇口5、流储单元6、流储矩阵7、出口8、导管9、注射器10、夹子 11和第三非线性流阻12；连续油相入口1、细菌悬浮液入口2用于分别接入取有氟碳油和菌液的移液器枪头，由此将两相流体导入微流芯片内；芯片通道用于引导液体和液滴的定向流动；第一非线性流阻3、第二非线性流阻4分别用于连续相与分散相的流速制动，为高频均一液滴发生提供稳定的两相流速比；十字形夹流汇口5用于借助油相对水相的剪切作用产生均一油包水微液滴，完成对细菌的分离和单个包裹；流储单元6用于通过和最终储存产生的液滴，是细菌液滴内在线培养和后期手机成像的基本单元，并组成流储矩阵7；出口8用于通过导管9连接注射器10，在注射器10管内产生源负压并经导管9、出口8传递至微流芯片内，夹子11固定拉伸后注射器10活塞形成稳定负压，同理，负压撤销，液滴发生自动停止。所述微流控芯片是由上层和下层基片键和而成的，材质均可为有机硅、塑料、玻璃或石英。微流控芯片内部通道(含十字形夹流汇口结构)尺寸均为微米级。微流控芯片的非线性流阻基本单元为U形设计，尺寸在微米级。

液滴识别计数装置包括面阵光源、透镜片、智能手机。面阵光源用于产生采集液滴浊度信息的平行入射光线；入射光线从微流芯片底片一侧垂直射入，经过液滴间质、液滴及其内含物后，形成总出射光；透镜片与智能手机分别用于放大和收集出射光信息，该信息经手机内部CMOS感光元件等处理后形成液滴图像；液滴计数识别软件App用于加载处理液滴图像，经过图像灰度变换、阈值分析、边缘提取、特征识别，识别指定大小的液滴，然后对识别的液滴进行有菌和无菌的判断，然后经统计处理显示最终菌液样本CFU值。

实施例：基于VMC液滴发生的单细菌包裹与培养和iphone6plus平台液滴图像采集与处理的快速大肠杆菌绝对计数方法(如图1)

如图2所示，本发明的系统包括微流控芯片、注射器、导管、氟碳油、高效液体培养基、智能手机、透镜片、面光源、图像处理与识别软件。微流控芯片(图2)由上层PDMS和下层玻璃基片键和而成，其中上层为微米级微通道网络(含U形非线性流阻)，采用湿法刻蚀而得。芯片上下层键合完成后需对芯 片十字形夹流汇口进行亲氟处理，以便于液滴的正常发生。具体实施方法如下：首先用氟碳油置换出芯片内气体，用白色移液器枪头吸取2X TB培养基等体积悬浮的样本菌液(上样量在5-20微升)接入水相入口，相同方法吸取氟碳油接入油相入口；连接注射器、导管和微流芯片出口，抽拉注射器活塞并用夹子固定产生稳定注射器管内负压，该负压经导管、出口传导至芯片内并造成进口处液体内外压强差，驱动氟碳油(连续相)与大肠杆菌菌液(分散相)进入芯片内通道；两相液体经芯片内置非线性流阻制动后在芯片夹流处获得稳定流速比，产生稳定均一液滴，连接出口处的非线性流阻控制液滴生成速率，最终完成对大肠杆菌个体的高频随机包裹；该过程形成的空液滴与包裹有单个细菌的液滴符合泊松分布规律；通过夹子阻断连接注射器与芯片出口的导管，芯片内负压来源被撤销，细菌的液滴包裹过程结束；随后，将储存有液滴的微流芯片置于37℃培养箱培养，经4-6h细菌分裂生长后在有菌液滴与空液滴之间形成明显空或非空的二元浊度差异。利用自行搭建的面光源-透镜片-智能手机成像平台(见图3)对培养后全部液滴浊度信息进行图像采集，采集后图片加载到自主开发液滴识别计数App软件系统进行总液滴与总非空液滴计数，经计算处理后得出样本CFU值。

液滴识别计数软件系统是自行开发的图像处理及分析软件，可以对所采集的液滴进行预处理及后期数据分析，拥有完整知识产权的手机软件系统，软件针对的手机平台可以是基于Android、ios、Blackberry、Symbian、windows mobile平台的任意一种智能手机。液滴识别计数App软件系统可以实现对所采集的液滴进行预处理及后期数据分析,进行总液滴与总非空液滴初始值统计，经计算处理后得出最终样本CFU值。具体工作流程是首先对图像进行灰度变换；然后进行图像锐化，目的是使灰度反差增强，从而增强图像中边缘信息，有利于轮廓抽取；进而对图像进行平滑滤波，以滤除噪声源(如电子噪声、光子噪声、斑点噪声和量化噪声等)，从而提高图像的信噪比，方便进行图像轮廓的查找；最后查找图像中灰度变化率最大的地方，从而得到细胞图像的闭合轮廓，进而提 取轮廓中的特征。然后根据闭合轮廓大小计算出总液滴数目，并根据闭合轮廓中的特征判断是否为非空液滴，从而计算出非空液滴数目，计算得出最终样本CFU值。