集核酸扩增和微阵列检测于一体的微流控装置的制作方法

本发明涉及生物分析领域中一种用于核酸分析芯片的微流控装置，特别是一种集核酸扩增和微阵列检测于一体的微流控装置。

背景技术：
随着生物技术的发展，对于核酸的检测和分析被越来越多的应用于各种检测目标，包括医疗诊断、司法鉴定、食品检测、学术研究等。通常，用于核酸分析的样品都是微量的，所以需要将含有目标核酸分子的基因片段进行扩增，然后再用于定性和定量检测。聚合酶链反应(PCR)是核酸扩增反应最常见的一种。扩增产物的检测通常有实时荧光检测、凝胶电泳、毛细管电泳以及微阵列检测。其中微阵列技术能够同时检测多个核酸目标序列，为实施样品的复杂分析提供了很好的平台。通常微阵列分析有如下步骤：核酸扩增，将扩增产物与杂交试剂混合，将杂交混合物转移到微阵列系统，孵化杂交反应，洗液清洗，检测。传统的方法中每一步操作都需要相配套的仪器，以及人工操作来完成试剂的转移和添加。在打开反应管的过程中会将反应试剂暴露在空气中，极易造成样品与环境的交叉污染。这对检测环境及操作人员都提出了要求。目前，很多公司推出了集成核酸扩增和杂交检测的产品。一类平台利用大型设备中的机械手完成各个反应步骤间的操作，包括核酸扩增、杂交检测以及扩增前的核酸提取。如TruSentryTMSystem(AkonniBiosystems)，Prove-itTMStripArray(Mibidiag)，但仍然在开放的体系中实现溶液的转移，无法解决体系封闭的问题。另一类平台是在封闭的卡盒或芯片中设置不同的反应腔室，借助外部设备及卡盒或芯片的特殊设计操纵液体在不同反应腔室之间的转移。如iCubateSystem(Icubate)利用卡盒内部的移液枪转移液体；UnyveroTMSolution(CuretisAG)将微阵列探针固定在PCR反应室上端的特殊的多孔膜上，通过气压控制液体上下移动；RheonixCARDTM(Rheonix)借助于气动阀和气动泵完成试剂的添加和反应室间的溶液转移。这些设备都需要复杂的泵阀设计以完成液体的转移，且卡盒式装置难以借助微流控系统内密闭的流体环境实现流体往复运动以加快杂交反应的进程，而微流控芯片装置中设置核酸扩增室则需要复杂的加工工艺使装置能够承受PCR反应过程中的热压。因此，仍需要改进技术使诊断装置在保证检测灵敏度的同时，具有更短的检测时间以及更低的成本。

技术实现要素：
本发明的目的是提供一种集核酸扩增和微阵列检测于一体的微流控装置，本发明将核酸扩增反应设在外置的扩增反应管内减少了对微流控芯片加工的要求，且配合微流控体系内动态杂交的技术，能够大大缩短检测的时间。本发明所提供的一种集核酸扩增和微阵列检测于一体的微流控装置，包括微流控芯片、扩增反应管和杂交检测室；所述微流控芯片上设有若干个样品池、若干个杂交试剂池和若干个混合池，所述样品池和所述杂交试剂池均通过盖子进行密封；所述扩增反应管的数量与所述样品池相同，所述扩增反应管设于所述微流控芯片的上部，所述扩增反应管的一端通过接头装置和设于所述微流控芯片内的流体通道Ⅰ相连接，且所述流体通道Ⅰ和所述样品池相连通，另一端通过所述接头装置和设于所述微流控芯片内的流体通道Ⅱ相连接，且所述流体通道Ⅱ与所述混合池相连通；所述混合池的顶部设有一通孔Ⅰ；所述杂交检测室设于所述微流控芯片内，所述杂交检测室包括2个流体入口和1个流体出口，一个所述流体入口通过设于所述微流控芯片内的流体通道Ⅲ与设于所述微流控芯片上的一通孔Ⅱ相连通，另一个所述流体入口通过设于所述微流控芯片内的流体通道Ⅳ与所述混合池相连通；所述流体出口通过设于所述微流控芯片上的流体通道Ⅴ与设于所述微流控芯片上的一通孔Ⅲ相连通；所述杂交试剂池通过设于所述微流控芯片内的流体通道Ⅵ与所述混合池相连通。上述的微流控装置中，所述盖子上设有一气孔，所述气孔靠近所述样品池和所述杂交试剂池一侧贴附有一疏水透气膜，所述气孔能够保证所述微流控装置内的气压与外界保持相对平衡，所述疏水透气膜则能够防止核酸扩增的污染物进入大气中。上述的微流控装置中，所述流体通道Ⅰ、所述流体通道Ⅱ、流体通道Ⅳ和流体通道Ⅵ上均设有一阀结构；所述阀结构可分别控制所述流体通道Ⅰ、所述流体通道Ⅱ、流体通道Ⅳ和流体通道Ⅵ的开闭。上述的微流控装置中，所述扩增反应管的材质可为玻璃、石英、橡胶或塑料等。上述的微流控装置中，所述扩增反应管通过硅胶软管与所述接头装置相连接。上述的微流控装置中，所述微流控装置还包括一支撑平台，所述支撑平台上设有金属板，所述金属板上设有若干个凹槽，所述扩增反应管设于所述凹槽内；使用本发明时，所述金属板与加热冷却元件紧密贴合，借助于所述金属板良好的导热性能够实现所述扩增反应管内溶液温度的快速升降。上述的微流控装置中，所述混合池的容积大于所述样品池和所述杂交试剂池的总容积，以避免所述混合池内溶液通过其顶部设置的通孔进入外围流路。上述的微流控装置中，所述接头装置为螺纹接头或套管接头；所述阀结构为膜片阀、相变阀或扭矩阀。本发明微流控装置应用于核酸扩增和杂交检测中。本发明微流控装置应用时，所述核酸为DNA或RNA。使用本发明的微流控装置进行试验时，将微流体芯片上的通孔与外围流路相连通。所述外围流路上设有至少一个驱动流体流动的泵，至少一个控制外围流体流路的阀。所述泵可以为柱塞泵或蠕动泵。所用泵连接有步进电机，可以精密地控制微升级单位体积。芯片内液体的位置可通过泵的步进距离精确控制，所用阀可以为夹管阀。外围流路连接至少一个清洗液室和一个废液室，用于杂交孵育完成后，检测室的清洗操作。所述微流体装置上的通孔与外围流路的连接可以通过接口装置实现紧密贴合，接口装置内有O型圈以增强密封效果。连接后的整个流路系统形成相对闭合的体系，以避免分析检测过程中的污染问题。本发明微流体装置与上述外围流路连接好后，与检测仪器进行配合工作。使用时，用户只需要将样品和试剂加入样品池和杂交试剂池中，然后将该装置插入仪器中。仪器经过预先设定好的工作流程完成指令，给出实验结果。本发明提供的微流控装置实现了自动化的核酸扩增和杂交检测，减少了对操作人员的要求并且整体实验环境密封，避免了环境污染问题；该装置将核酸扩增反应设在外置的扩增反应管内，从而减少了对微流控芯片加工的要求，降低制作成本。且配合微流控体系内动态杂交的技术，能够大大缩短检测的时间。附图说明图1为本发明微流控装置的结构示意图。图2为本发明微流控装置使用时的系统控制示意图。图3为本发明微流控装置检测的耳聋基因的实验结果，其中图3(a)为微阵列芯片探针排布图，图3(b)为完成操作后采集的图像。图中各标记如下：1微流控芯片、11样品池、111盖子、112气孔、113疏水透气膜、12杂交试剂池、13接头装置、14支撑平台、15混合池、2核酸扩增反应平台、21扩增反应管、22硅胶软管、23金属板、3微阵列检测平台、31杂交检测室、32流体入口、33流体入口、34流体出口、40阀结构、51通孔Ⅰ、52通孔Ⅱ、53通孔Ⅲ。具体实施方式下面结合附图对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。如图1所示，本发明提供的微流控装置包括微流控芯片1、核酸扩增反应平台2和微阵列检测平台3。微流控芯片1上设有2个样品池11、1个杂交试剂池12和1个混合池15。样品池11通过可拆卸的盖子111进行密封，盖子111上有一个气孔112，盖子111内侧贴有防气溶胶的疏水透气膜113。使用时打开盖子111，将扩增反应的样品和杂交试剂加入相应的样品池11和杂交试剂池12(通过盖子密封)中，再将盖子111扣紧。样品池11与扩增反应管21相连通。在该实施例中，扩增反应管21为不透气的硅胶硬管，一端通过硅胶软管22连接在微流控芯片1上凸起的接头装置13上，然后通过设置于微流控芯片1内的流体通道Ⅰ与样品池11相连通；另一端通过硅胶软管22连接在微流控芯片1上凸起的接头装置13上，然后通过设置于微流控芯片1内的流体通道Ⅱ与混合池15相连通。硅胶软管22的内径比扩增反应管21的接头装置13的外围尺寸略小，硅胶软管22的弹性张力保证其与扩增反应管21及接头装置13的连接口紧密闭合。硅胶软管22还将配合仪器中压管阀装置用来控制扩增反应管21中流体的流入和流出。也可通过在流体通道Ⅰ上设置阀结构40来控制通道的开闭。此外，该实施例还包括有金属板23，可将扩增反应管21包埋在其上设置的凹槽(图中未标)内。微流控芯片1上可加工有支撑平台14以支撑金属板23和硅胶软管22，金属板23也可固定在仪器中，扩增反应管21放到金属板23的槽(图中未示)。该微流控芯片1插入仪器后，金属板23与加热冷却元件紧密贴合，借助于金属板良好的导热性能实现反应室内溶液温度的快速升降。扩增后的反应液通过设有压管阀的硅胶软管22进入混合池15。杂交试剂池12通过设置于微流控芯片1内的流体通道Ⅵ与混合池15相连通，在该流体通道Ⅵ上设有阀结构40以控制通道的开闭。所用阀为常开的膜片阀。当没有外力作用时，管道为连通状态；当外力作用管道上方的弹性膜时，膜发生形变从而堵塞管道的连接口。微阵列检测平台3上设有杂交检测室31，它包括2个流体入口32和33，一个流体出口34，流体入口33通过设于微流控芯片1内的流体通道Ⅲ与设于微流控芯片1上的一通孔Ⅱ52相连通，流体入口32通过设于微流控芯片1内的流体通道Ⅳ与混合池15相连通；流体出口34通过设于微流控芯片1上的流体通道Ⅴ与设于微流控芯片1上的通孔Ⅲ53相连通。混合池15的顶部设有通孔Ⅰ51，与外围流路的泵相连。核酸扩增后的产物与杂交试剂在泵阀装置驱动下顺序流入混合池15中，并通过泵的往复运动使其充分混合。混合后的溶液输送至杂交检测室31中。杂交检测室31也将与仪器中温控元件、光学检测元件以及外围流路的连接装置协调放置。杂交室的流体入口33将通过芯片上通孔Ⅱ52与外围流路连接，流体出口34将通过芯片通孔Ⅲ53与外围流路连接。外围流路设有洗液室、废液室以及泵、阀等装置。杂交过程中可以通过控制加热元件实现对杂交腔体的温度控制，同时也可以通过泵控制杂交腔体内流体的往复运动来加快杂交反应的进程。杂交反应完成后，在外围流路的控制下实现杂交腔室的清洗，干燥等步骤。图2为本发明上述微流控装置的一种分析系统的示意图。该系统包括：微流体装置；用于控制扩增平台2和检测平台3的温控装置61和62；配合微流体装置中阀结构40和硅胶软管22的下压阀装置41、42、43、44、45和46，以及控制外围流路的夹管阀47、48和49；驱动液体流动的蠕动泵8；外围流路的液体存储装置71、72和73。液体存储装置71、72可以为洗液池或空气池，通过通孔Ⅱ52流入杂交检测室31。流体存储装置73可以为废液池用于收集系统中的废液。驱动液体流动的泵8设置在系统的最末端，泵通过双向阀49分别通过混合池15顶部的通孔53和杂交检测室流体出口端的通孔Ⅲ53与微流控装置相连。杂交检测室31的上方还设有光学检测元件9，用来对反应结果进行检测。根据本发明上述提供的微流体装置和分析系统进行试验，试验过程如下：取晶芯九项遗传性耳聋基因检测试剂盒(微阵列芯片法)(博奥生物有限公司)。按照试剂盒说明书提取全血或滤纸干血斑中的基因组DNA。将提取的DNA按照一定的体积比例与试剂盒中PCR扩增反应体系混合。使用者打开本发明微流控装置上样品池的盖子，用移液器将混合的PCR反应液加入样品池中，再盖上盖。同样将杂交试剂加入试剂池中，再加盖闭合。将加完试剂后的装置在系统初始化完成后插入到仪器中，仪器将自动完成剩余操作。具体的系统操作过程如下：1、系统初始化：1)准备洗液：将洗瓶71中装入洗液1(0.3XSSC和0.1％SDS)，洗瓶72中装入洗液2(0.06XSSC)2)系统预充液：打开夹管阀47、将双向阀49切换至a端闭合，b端打开，洗液池71与废液池73之间通过与仪器内流路的连接(未显示)形成闭合流路，蠕动泵逆时针运动使该分支流路充满液体。关闭夹管阀47，打开夹管阀48，切换夹管阀49至另外一侧，将外围流路的另一条支路充满液体。2、装卡盒：将加完样品和试剂的卡盒装入仪器，仪器内的光学或磁性感应器验证卡盒的位置；同时，通过弹簧或卡槽设计将卡盒与加热原件紧密贴合；外围流路的接口也与相应的卡盒通孔贴紧。3、扩增：关闭所有阀，将连接泵的双向阀49切换至a端打开，b端闭合；打开阀41、42，将样品池中液体抽至扩增室中，关闭41、42；同理，控制阀43、44，将另一样品池中样品抽至相应扩增室；按照说明书要求设定PCR反应热循环程序进行PCR扩增反应。4、混合：顺序打开压管阀41、42和43、44，将扩增反应后的反应液抽至混合池，完成后关闭阀；打开阀45，将杂交液也抽至混合池；蠕动泵进一步通过正反向运动往复抽吸溶液以混合杂交反应液。5、杂交：打开阀46，将双向阀49切换至b侧打开，将混合的杂交反应液输送至杂交检测室31；设定温控模块的反应温度为60℃，进行杂交反应；且在杂交过程中，蠕动泵通过正反向的往复运动驱动杂交检测室内反应液往复运动，实现动态杂交。6、清洗：将温控装置60℃温度降至25℃；打开夹管阀47，抽取洗液池71中洗液，洗液经过杂交腔体流入废液室；同样，用洗液池72中洗液清洗杂交腔体。7、检测：通过LED光源和CCD相机装置采集图像或视频文件。图3(a)为微阵列芯片探针排布图，图3(b)为完成以上操作后采集的图像。图像中，参照点和样品点出现很强的荧光信号，表现出显著的检测功能。