在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的试剂盒及其引物对组的制作方法与工艺

本发明涉及利用外周血游离DNA进行肿瘤筛查、疗效评估以及预后预测的试剂盒。属生物技术领域。

背景技术：
随着肿瘤的发病率的逐年提高，肿瘤正在成为常态化的疾病，而肿瘤治疗的有效性取决于早期发现，目前肿瘤的筛查手段主要依赖于影像学，但影像学由于受制于物理学的分辨率限制，使肿瘤难以真正做到早时期发现，于是就出现了要么检测结果正常要么已经是中晚期的尴尬局面，所以临床迫切需要建立新的有助于肿瘤早期发现的手段，这样肿瘤的分子检测就应运而生。传统的肿瘤标志物主要是肿瘤代谢相关的蛋白分子，多年来的临床资料表明，其敏感性与特异性较低，其中在部分肿瘤患者中这些指标没有变化，限制了其在肿瘤筛查中的应用，目前仅用于对这些指标有明显异常患者的疗效评估上，所以迫切需要推出新型的肿瘤标志物。研究表明肿瘤的发生发展过程中，均不同程度涉及基因突变、缺失以及染色体移位的等变化，而且这些变化是一个持续性的过程，即不同类型肿瘤以及同一肿瘤不同进展阶段，其基因的异常各不相同，是造成突变具有肿瘤广泛的异质性的重要原因,尽管近年来针对这些基因异常的检测已成为肿瘤风险预测、靶向药物用药指导以及疗效评估的重要手段,但由于基因变异的异质性特点,造成了检测的困难与高成本，需要探索新的检测方法。进一步对肿瘤细胞基因组研究发现，这些突变并非随机的，其中绝大部分突变发生在胞嘧啶碱基上，这种序列特异性正是胞嘧啶脱氨酶作用的位点，可见胞嘧啶脱氨酶就是造成基因突变的始作俑者。目前发现导致胞嘧啶脱氨的酶包括：Apobec3s家族(ApolipoproteinBmRNA-editingcatalyticpolypeptide)，AID(Activation-inducedCytidineDeaminase)，其作用底物是单链DNA中的胞嘧啶。通过脱氨基作用形成尿嘧啶(U)，导致C>U的突变，如突变不能及时切除则在随后的复制中出现由C:G向A:T的突变；如C>U的突变被UNG(UracilNucleotideGlicosylase)识别，则随后启动切除修复，在此修复过程中，受制于多种因素的影响，同时也可能在切除U碱基留下的空缺位置上随机添加任何碱基，导致出现多种可能的突变，进一步还可导致基因断裂、缺失、融合以及染色体转位等异常。这就是为什么肿瘤基因组中经常出现基因突变、异常融合以及染色体转位的原因。胞嘧啶脱氨酶是细胞应激反应基因，Apobec3家族在人类共发现有七个成员(Apobec3A,Apobec3B,Apobec3C,Apobec3D,Apobec3F,Apobec3G,Apobec3H),其主要功能是限制病毒的感染以及基因组内自主性转座子的活性，研究发现这些成员(特别是Apobec3B)的过量表达将导致包括TP53和APC等在内的肿瘤相关基因出现大量的突变，最终导致的癌症的发生。这样也就从机制上阐明了病毒长期感染最终导致肿瘤形成的原因。AID在B细胞抗体多样性调控中具有重要的作用，正是由于其造成的突变，才使B细胞产生多样化的抗体，如在非B细胞中激活则会提高其它基因出现突变的风险，报道显示：转基因动物中AID过表达可导致Myc基因突变，同时还介导IGH-MYC易位，形成淋巴瘤；幽螺门杆菌也被发现可上调AID，增加TP53的突变率，可能也是幽螺门杆菌诱发胃癌的重要机制。另外，UNG作为细胞对胞嘧啶突变修复的重要酶分子，在肿瘤细胞中也常表现为高表达，但活性不高，不能有效修复胞嘧啶脱氨引起的突变。可见细胞在进化过程中，通过采取对入侵者基因突变的方式，限制其活性，但同时作为双刃剑，也增加了自身DNA出现突变的风险，其持续性的高表达是造成细胞转化以及肿瘤进展的重要原因，同时也是造成肿瘤细胞异质性的根源。在临床应用过程中，特别是对肿瘤发病风险评估的检测中，血液标本以其无创、快速、方便的特点无疑是最好的素材。研究表明，外周血中含有大量的游离DNA(血浆或血清中的DNA)，这些DNA可能来自于正常细胞死亡的释放物，也可能来自于肿瘤或癌前病变细胞的死亡释放物，通过对肿瘤来源的游离DNA检测将为肿瘤风险性以及疗效评估带来的可行性。这样在外周血中，通过对胞嘧啶脱氨酶及其相关基因表达的检测，将可用于对肿瘤发病风险以及治疗有效性的评估。综上所述，通过该检测将有助于肿瘤早期风险的预测，同时也可评估肿瘤的疗效以及复发的危险性，所以该检测在肿瘤预防以及治疗均具有重大的指导意义。

技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的引物对组。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：针对Apobec3s、AID以及UNG基因表达状况的检测方法，我们采取对其进行启动子甲基化分析，在此过程中我们采取甲基化敏感的限制性内切酶处理方法，比较酶切前后的Ct值的差值，评估酶切位点的甲基化程度。其中针对Apobec3家族，我们选择了在肿瘤细胞中广泛高表达的成员Apobec3B、Apobec3C、Apobec3F和Apobec3G，在对其启动子序列分析发现，Apobec3B与Apobec3C的有部分完全同源，而Apobec3F与Apobec3G与也有部分完全同源，这样，我们分别选取这些同源部分序列，进行甲基化程度分析；另外，我们也对AID和UNG基因启动子甲基化程度进行了分析。通过采用对游离DNA高富集方法，我们成功实现了在外周血中对上述靶基因启动子甲基化程度的检测。在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的引物对组，该引物对组如序列表SEQIDNo：1至SEQIDNo：8所示。其中，序列SEQIDNo：1和SEQIDNo：2分别为扩增Apobec3B/C基因的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo：3和SEQIDNo：4分别为扩增Apobec3F/G基因的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo：5和SEQIDNo：6分别为扩增AID基因的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo：7和SEQIDNo：8分别为扩增UNG基因的上游引物和下游引物。具体序列如下：Apobec3B/C上游引物：5’-GCCAGAGCCAGAGAAACATGAAG-3’(SEQIDNO：1)Apobec3B/C下游引物：5’-TGCTTACAGCGTCCTTGCAGTTG-3’(SEQIDNO：2)Apobec3F/G上游引物：5’-TTGTGCTCTGCTGGCTCAGC-3’(SEQIDNO：3)Apobec3F/G下游引物：5’-GGACCCAAGGCAATTGCAAAG-3’(SEQIDNO：4)AID上游引物：5’-TTGAAGTGTCTACTGTTACTGCC-3’(SEQIDNO：5)AID下游引物：5’-CTGTCATAGGCAGAGTCACACA-3’(SEQIDNO：6)UNG上游引物：5’-TGCCTGAGGAAAGCGGAGATG-3’(SEQIDNO：7)UNG下游引物：5’-CACGTGGAGGCTATTTGGAAAG-3’(SEQIDNO：8)在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的试剂盒，包括由序列表SEQIDNo：1至SEQIDNo：8所示的引物对组。所述试剂盒进一步包括限制性内切酶以及酶切反应液。其中所述限制性内切酶以及酶切反应液包括：HpaII内切酶、NheI内切酶和酶切反应缓冲液(10×酶切反应缓冲液，10×buffer)其中所述实时荧光定量PCR扩增是针对四种靶基因分别进行的，即Apobec3B/C片段的扩增；Apobec3F/G片段的扩增；AID片段的扩增；UNG片段的扩增。其中所述实时荧光定量PCR扩增反应液，其中包括SYBRGreen。可选自商品化试剂，例如：SYBRPremixExTaqTM(购自TaKaRaBioInc)。所述试剂盒进一步包括阴性对照DNA样品和扩增阴性对照DNA的引物对(其序列参照专利，201310741282.6)，阴性对照DNA样品酶切前后实时荧光定量PCR扩增的△△Ct的变化小于临界值。所述试剂盒进一步包括阳性对照DNA样品和扩增阳性对照DNA的引物对(其序列参照专利，201310741282.6)，阳性对照DNA样品酶切前后荧光定量PCR的△△Ct的变化大于临界值。所述试剂盒进一步包括内参DNA和扩增内参DNA的引物对，所述内参DNA为Alu基因片段，其序列参照专利，201310741282.6。本发明还提供了一种检测外周血游离DNA的试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤：提取外周血游离DNA；使用HpaII内切酶对外周血游离DNA进行酶切；使用NheI内切酶对外周血游离DNA进行酶切；进行实时荧光定量PCR扩增；结果的计算与判定。HpaII内切酶酶切后进一步对内切酶进行灭活，灭活条件为：65℃灭活10-40min，灭活后的产物用于Apobec3B/C、Apobec3F/G和UNG基因实时荧光定量PCR(qPCR)反应的模板。NheI内切酶酶切后进一步对内切酶进行灭活，灭活条件为：65℃灭活10-40min。灭活后的产物用于AID基因qPCR反应的模板。其中结果判定按如下的方法进行计算：将PCR结果中的数据导出，按照下述公式进行计算，得到相应的值。△△Ct＝∣(Ct-Xprecut–Ct-Yprecut)-(Ct-Xpostcut–Ct-Ypostcut)∣的绝对值；其中：Ct：循环次数；X:靶基因(Apobec3B/C、Apobec3F/G、AID或UNG)；Y：内参基因(Alu基因)；Precut:酶切前；postcut：酶切后。由于这些基因都是具有胞嘧啶脱氨及其相关的功能，所以细胞中胞嘧啶的脱氨基总体效果取决于这些基因的整体活性，我们采取对不同靶基因的△△Ct进行求和，这样可大大降低因单个基因表达差异导致的误差，使量化评估更加精准。由于这些基因对肿瘤的贡献度是不同的，对其结果进行了加权计算。针对肿瘤患者以及正常人群的Ct值的差异的统计学分析(T检验以及ROC曲线分析)，找出具有统计学意义的临界值(CutOff值)，公式如下：△△Ct加权值＝2×△△Ct(Apobec3B/C)+△△Ct(Apobec3F/G)+△△Ct(AID)+△△Ct(UNG)。我们初步的研究显示，该检测方法具有极高的其敏感性与特异性(ROC曲线的覆盖面积>90％)，显著优于目前临床上使用的经典肿瘤标志物的检测方法(单项指标的敏感性一般不超过60％)。本发明的有益效果如下：1、高敏感性：外周血游离DNA检测试剂盒，通过具有相同功能的多种指标的联合评判，极大地提高了检测的灵敏度。2、特异性：由于我们选择的靶基因在所有肿瘤细胞中均出现过量表达(细胞对病毒有害环境的应激反应，也可导致其一过性的激活)，这样在排除病毒感染的情况下对其进行检测增加了肿瘤的特异性。3、直接性：常规的蛋白肿瘤标志物通常是检测代谢指标的异常，是间接指标，而外周血游离DNA是直接来自于细胞本身，是直接性指标，更加真实可信。4、实时性：同时由于外周血游离DNA在体内的代谢很快(可在几分钟内代谢清除)，这样可以对治疗效果进行实时的评价。5、稳定性：相对于蛋白质标志物而言，DNA的稳定性较好，对样本的储存运输等条件要求相对较低。6、预警性：基础医学研究认为肿瘤的发生的根本原因是基因组的不稳定性，胞嘧啶脱氨酶诱导的胞嘧啶脱氨突变是导致基因组变异的主要因素，也是造成肿瘤出现大量基因突变的根本原因。所以检测胞嘧啶脱氨酶的激活程度对预测肿瘤发病的风险具有非常重大的意义。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。图1示出甲基化敏感限制性酶切酶联合PCR扩增目的DNA片段示意图。图2示出正常人与肿瘤患者中△△Ct加权值分布范围。图3示出肿瘤患者检测结果的ROC曲线分析，其中Areaundercure为曲线下面积，纵坐标为灵敏度(sensitivity)，横坐标为特异性(1-specificity)。具体实施方式为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例1：建立检测方法1)样本制备：抽提外周血并提取游离DNA；使用HpaII内切酶对外周血游离DNA进行酶切，酶切体系见表1；酶切条件为酶切条件为：37℃2h；HpaII内切酶酶切后进一步对酶切反应体系进行灭活，灭活条件为：65℃灭活20min。灭活后的产物用于Apobec3B/C、Apobec3F/G和UNG基因实时荧光定量PCR(qPCR)扩增反应的模板。使用NheI内切酶对外周血游离DNA进行酶切，酶切体系见表2；酶切条件为：37℃2h；NheI内切酶酶切后进一步对酶切反应体系进行灭活，灭活条件为：65℃灭活20min。灭活后的产物用于AID基因实时荧光定量PCR(qPCR)扩增反应的模板。表1：样本酶切体系表2样本酶切体系所述样本制备进一步包括阳性对照DNA的制备，其中阳性对照DNA酶切体系见表3：表3阳性对照酶切体系阳性DNA片段*：LINE-1基因片段(含有内切酶HpaII/NheI位点的片段与不含有内切酶HpaII/NheI位点的片段的比例为8:1)+Alu基因片段(不含有内切酶HpaII/NheI位点的片段)。LINE-1与Alu基因片段基因片段的序列参见专利：201310741282.6。所述样本制备进一步包括阴性对照DNA的制备，其中阴性对照DNA酶切体系见表4：表4阴性对照酶切体系阴性DNA片段**：LINE-1基因片段(含有内切酶HpaII/NheI位点的片段与不含有内切酶HpaII/NheI位点的片段的比例为1:8)+Alu基因片段(不含有内切酶HpaII/NheI位点)LINE-1与Alu基因片段的序列参见专利：201310741282.62)进行实时荧光定量PCR(qPCR)扩增其中使用序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物对扩增Apobec3B/C基因，反应体系见表5：表5：Apobec3B/C序列qPCR反应体系扩增条件为：预变性95℃30秒，3步骤扩增程序：95℃5秒；57℃25秒；72℃25秒；40个循环。使用序列表SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的引物对扩增Apobec3F/G基因，反应体系见表6：表6：Apobec3F/G序列qPCR反应体系扩增条件为：预变性95℃30秒，3步骤扩增程序：95℃5秒；55℃25秒；72℃25秒；40个循环。使用序列表SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的引物对扩增AID基因，反应体系见表7：表7：AID序列qPCR反应体系扩增条件为：预变性95℃30秒，3步骤扩增程序：95℃5秒；57℃25秒；72℃25秒；40个循环。使用序列表SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的引物对扩增UNG基因，反应体系见表8：表8：UNG序列qPCR反应体系扩增条件为：预变性95℃30秒，3步骤扩增程序：95℃5秒；55℃25秒；72℃25秒；40个循环。实时荧光定量PCR(qPCR)扩增进一步包括内参基因(Alu序列)的扩增，其反应体系如表9：表9内参基因Alu序列qPCR反应体系扩增条件为：预变性95℃30秒，3步骤扩增程序：95℃5秒；55℃25秒；72℃25秒；40个循环。Alu基因序列及其上下游引物参见专利：201310741282.6。表10：阳性对照qPCR反应体系扩增条件为：预变性95℃30秒，3步骤扩增程序：95℃5秒；55℃25秒；72℃25秒；40个循环。注：LINE-1基因的上下游序列参见专利：201310741282.6表11阴性对照qPCR反应体系扩增条件为：预变性95℃30秒，3步骤扩增程序：95℃5秒；55℃25秒；72℃25秒；40个循环。注：LINE-1基因的上下游序列参见专利：201310741282.63)结果判定按照下述公式进行计算，得到相应的值。△△Ct＝∣(Ct-Xprecut–Ct-Yprecut)-(Ct-Xpostcut–Ct-Ypostcut)∣的绝对值；其中：X:靶基因(样品：Apobec3B/C、Apobec3F/G、AID或UNG；阳性/阴性对照：LINE-1)；Y：内参基因(Alu基因)；Precut:酶切前；postcut：酶切后。结果评判阳性对照：△△Ct≧3.5阴性对照：△△Ct≦0.5样品：△△Ct加权值＝2×△△Ct(Apobec3B/C)+△△Ct(Apobec3F/G)+△△Ct(AID)+△△Ct(UNG)。2、实施例2：按照实施1的方法对正常人和肿瘤患者Apobec3B/C、Apobec3F/G、UNG和AID基因突变情况进行检测，并计算△△Ct加权值。其中肿瘤患者的△△Ct加权值见表12，肿瘤患者的△△Ct加权值见表13。表12：对照组(30例)：表13：肿瘤组患者肺癌11例，肝癌10例，胃癌9例，结直肠癌5例，食管癌3例，胰腺癌2例，乳腺癌1例，其它肿瘤10例。根据统计分析，设定CutOff值为13，这样30例正常人中有6例(样本8、12、14、17、20和23)△△Ct加权值稍高于13；50例肿瘤患者中有4例(样本8、9、38和40)△△Ct加权值低于13。据此结果，本检测方法的敏感性和特异性如表14：表14：△△Ct加权值阈值结果显示，本发明的方法检测的敏感性90.2％；特异性80％；符合率86.4％。对上述结果进行统计学检验，见表15：表15：正常人和肿瘤患者检验的统计学计算：本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。