一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素的方法与流程

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素(fumagillin)的方法。

背景技术：

烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)是一种重要的真菌，在自然界广泛分布，存在于土壤和动物腐烂的毛皮。烟曲霉是条件致病菌和重要的病原，产生的分生孢子在空气中，通过人的呼吸道进入人体，导致免疫功能低下或菌群失调等特殊状态患者感染。另一方面，饲料中烟曲霉产生的如胶霉毒素(gliotoxin)、烟曲霉素(fumagillin)等多种真菌毒素严重伤害动物的健康并降低生产能力，威胁着人类的食品安全和健康。近年来，烟曲霉全基因组测序的完成为烟曲霉来源的真菌毒素研究提供了有力的工具。研究发现，烟曲霉素也可以作为药物用于人类疾病的治疗和农业生产中的生物防治。

烟曲霉素可作为一种血管生成抑制剂(angiogenesis)，具有较强抗肿瘤血管生成作用。血管新生与肿瘤生长密切相关，对于肿瘤生长、浸润和转移具有重要意义，阻止肿瘤血管的形成也就可能抑制肿瘤的生长。人们已研究和开发了能破坏和抑制血管生成、有效地阻止肿瘤生长和转移的药物，其中烟曲霉素可特异性抑制血管内皮细胞的增殖，其作用靶标为甲硫氨酸氨基肽酶2(MetAP-2)。研究发现，烟曲霉素可完全抑制碱性成纤维细胞生长因子存在状态下的血管内皮细胞的生长和小鼠肿瘤血管生成，但具有引起体重减轻等明显的毒副作用。烟曲霉素碱水解产生烟曲霉醇及在此基础上人工合成的衍生物可作为一种血管抑制剂可起到抗肿瘤血管生成，对肝纤维化和肝癌、口腔鳞状上皮细胞癌、内皮细胞增殖和迁移、结肠癌裸鼠腹水瘤LOVO细胞生长、骨肉瘤(osteosarcoma)等起到抑制作用。合成的烟曲霉素衍生物(TNP-470,PPI-2458,CKD-732)已用于治疗人类癌症的临床试验，通过以甲硫氨酸胺基肽酶2为作用靶标破坏肿瘤血管；TNP-410用于治疗前列腺癌(prostate cancer)、非小细胞肺癌(NSCLC)和黑素瘤(melanoma)等癌症。烟曲霉素的神经毒性在一定程度上限制了其在临床诊断上的应用，而新发现的烟曲霉素衍生物PPI-2458和CKD-732表现出了较轻的神经毒性。烟曲霉素及其衍生物TNP-470和CKD-732能减少食物吸收、体重、脂肪量和脂肪细胞的大小，从而作为治疗肥胖症的潜在药物。烟曲霉素还可以有效抑制阿米巴病(amebiasis)和其他原生动物寄生感染，并可作为治疗风湿性关节炎和肥胖症等多种疾病的潜在药物。

烟曲霉素可用于抗微孢子虫感染，特别是在养蜂业中具有防治蜜蜂微孢子虫病的作用，也用于鱼类微孢子虫感染治疗。蜜蜂孢子虫病在世界各养蜂发达国家都有发生，是由蜜蜂孢子虫寄生在蜜蜂肠上皮细胞所引起的一种蜜蜂成虫寄生虫病。微孢子虫破坏中肠肠壁，为其他微生物的入侵开辟了道路，微孢子虫病长伴随着马氏管变形虫病、慢性麻痹病、黑蜂王病毒、螺旋体病以及白垩病等，形成所谓的“爬蜂病”混合感染。工蜂、母蜂和雄蜂都能感染蜜蜂孢子虫病，引起机体功能衰弱，采蜜能力降低，寿命缩短。蜜蜂微孢子虫病可能迁延几年才使整个蜂群死亡。烟曲霉素是可成功应用于防治蜜蜂微孢子虫病，它虽不杀死微孢子虫孢子，但能大大减少蜜蜂微孢子的产生，降低蜂群中蜜蜂总的感染率，从而减少蜂群的损失，增加了蜜蜂及幼虫的数量，使蜂蜜获得增产。

关于烟曲霉菌产生次级代谢产物烟曲霉素及其衍生物的优化培养方法，仅有很少的报道(Wen Yang,Carbon and nitrogen source nutrition of fumagillin biosynthesis by Aspergillus fumigatus,Current Microbiology,2003,275–279)，但该报道中的烟曲霉素其产量低，很难用于工业化生产或应用。

技术实现要素：

本发明提供了一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素(fumagillin)的方法，针对影响烟曲霉生长及烟曲霉素的碳氮源以及微量元素进行了筛选，并对相应的微量元素浓度进行优化，获得了较高的烟曲霉素产量。

本发明提供一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将所述烟曲霉菌接种于GMM固体培养基进行菌种活化，所述GMM培养基pH值为6.5；

将活化后的菌种孢子制备孢子悬液后接种于CYA固体培养基、CXMA固体培养基或LMM液体培养基，所述CYA固体培养基、所述CXMA固体培养基pH值自然，所述LMM液体培养基pH值调节为5-7，在25℃至37℃条件下培养；

收集培养的烟曲霉菌及培养基提取烟曲霉素及烟曲霉素衍生物。

在上述技术方案中，所述GMM固体培养基每升包括：葡萄糖10g，硝酸盐母液50mL，微量元素母液1mL，酵母抽提物1g，琼脂15-20g，余量为蒸馏水。

在上述技术方案中，所述CYA固体培养基每升包括：NaNO3 2-5g，K2HPO4·3H2O 0.5-2g，MgSO4·7H2O 0.3-1g，KCl 0.3-1g，FeSO4·7H2O 0.01-0.03g，蔗糖20.0-40.0g，酵母抽提物3-8g，琼脂15-20g，余量为蒸馏水。

在上述技术方案中，所述CXMA固体培养基每升包括：MgSO4·7H2O 0.3-0.5g，KCl 0.3-0.8g，FeSO4·7H2O 0.01-0.02g，木聚糖20-40g，甘露糖30-80g，谷氨酸5-12g，琼脂15-20g，余量为蒸馏水。

在上述技术方案中，所述LMM液体培养基每升包括：葡萄糖10g，酵母抽提物10g，微量元素母液1mL，硝酸盐母液50mL，余量为蒸馏水。

在上述技术方案中，所述硝酸盐母液每升包括：NaNO3 120g，KCl 10.4g，MgSO4·7H2O 10.4g，K2HPO4·3H2O 30.4g，余量为蒸馏水。

在上述技术方案中，所述微量元素母液每100mL包括ZnSO4·7H2O 2.2g，H3BO31.1g，MnCl2·4H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.16g，CoCl2·5H2O 0.16g，CuSO4·5H2O 0.16g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.11g，Na2EDTA 5.0g，余量为蒸馏水。

在上述技术方案中，所述烟曲霉菌为Aspergillus fumigatus af293(可通过商业途径购买得到)。

在上述技术方案中，所述烟曲霉素的结构式如式1所示。

在上述技术方案中，所述烟曲霉素衍生物包括fumagiringillin，所述fumagiringillin的结构式如式2所示，还包括RK-95113，所述RK-95113的结构式如式3所示。

本发明利用烟曲霉菌生产烟曲霉素的方法通过选择合适的培养基配方及培养条件，大大提高了烟曲霉素的产量并获得了部分烟曲霉素衍生物，为烟曲霉素的工业化生产及应用奠定了基础，也为烟曲霉素及其衍生物在制备新生血管抑制剂、新生血管抑制剂前体化合物、抗肿瘤药物或其前体化合物、治疗阿米巴病和其他原生动物寄生感染的药物或制备治疗风湿性关节炎和肥胖症的药物方面的应用提供了前提条件。

附图说明

图1为烟曲霉素的HPLC分析检测图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本发明所用的菌种活化培养基为GMM培养基，每1L所述固体培养基按如下方法配制：葡萄糖10g，硝酸盐母液50mL，微量元素母液1mL，酵母抽提物1g，琼脂15-20g，上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至1L，pH值调至6.5，121℃高压湿热灭菌20-30分钟。倒90mm平板，划线接种，37℃静置培养3天至4天。灭菌水收集孢子，每个平板收集孢子，制成终体积为2mL的孢子悬液，4℃保存用于培养接种。

其中，硝酸盐母液配制(1L)方法如下：硝酸钠NaNO3 120g，氯化钾KCl 10.4g，硫酸镁MgSO4·7H2O 10.4g，磷酸氢二钾K2HPO4·3H2O 30.4g，上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至1L，pH值自然，121℃高压湿热灭菌20-30分钟，室温保存；

微量元素母液配制(100mL)方法如下：硫酸锌ZnSO4·7H2O 2.2g，硼酸H3BO3 1.1g，氯化锰MnCl2·4H2O 0.5g，硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.16g，氯化钴CoCl2·5H2O 0.16g，硫酸铜CuSO4·5H2O 0.16g，钼酸铵(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.11g，EDTA钠盐Na2EDTA 5.0g，上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至100mL，121℃高压湿热灭菌20-30分钟，室温保存。

实施例2

所用的发酵培养基为CYA培养基，每1L所述CYA固体培养基按如下方法配制：硝酸钠NaNO3 2-5g，磷酸氢二钾K2HPO4·3H2O 0.5-2g，硫酸镁MgSO4·7H2O 0.3-1g，氯化钾KCl 0.3-1g，硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.01-0.03g，蔗糖20.0-40.0g，酵母抽提物3-8g，琼脂15-20g，上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至1L，pH值自然。121℃高压湿热灭菌30分钟，倒90mm平板，划线接种。所述培养温度为25至37℃，培养基为固体培养基，静置培养，培养时间为4天至6天。

通过HPLC指纹图谱分析检测峰面积计算方法结合实际分离计算方法测得：每升CYA培养基获得烟曲霉素产量约为34-50mg。

实施例3

所用的发酵培养基为CXMA培养基，每1L所述固体培养基按如下方法配制：硫酸镁MgSO4·7H2O 0.3-0.5g，氯化钾KCl 0.3-0.8g，硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.01-0.02g，木聚糖20-40g，甘露糖30-80g，谷氨酸5-12g，琼脂15-20g。上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至1L，pH值自然。121℃高压湿热灭菌30分钟，倒90mm平板，划线接种。所述培养温度为25℃至37℃，培养基为固体培养基，静置培养，培养时间为4天至6天。

通过HPLC指纹图谱分析检测峰面积计算方法结合实际分离计算方法测得：每升CXMA培养基获得烟曲霉素产量约为25-35mg。

实施例4

所用的发酵培养基为LMM培养基，每1L所述液体培养基按如下方法配制：葡萄糖10g，酵母抽提物10g，微量元素母液1mL，硝酸盐母液50mL。上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至1L，pH值调至6.5。其中微量元素母液与硝酸盐母液的成分和制备方法与实施例1中相同。121℃高压湿热灭菌30分钟，倒20mL培养基至90mm平板，每板接种0.2-0.5mL孢子悬液，摇匀。所述培养温度为25℃至37℃，培养基为液体培养基，静置培养，培养时间为4天至6天。

通过HPLC指纹图谱分析检测峰面积计算方法结合实际分离计算方法测得：每升LMM培养基获得烟曲霉素产量约为50-60mg。

实施例5

上述实施例中发酵培养产物的HPLC分析检测方法为：将1个平板的培养物分成小块置于三角瓶中，加入20-40mL MEA(乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸＝89:10:1)进行超声萃取(超声频率80Hz，时间为1小时)；收集提取液进行旋转蒸发(温度30℃，转速100rpm，真空度<3mmHg)；蒸干后用0.30-0.60mL甲醇溶解，稀释适当浓度进样20-40ul，20-100％甲醇冲柱，进行HPLC分析鉴定，鉴定结果如附图1所示，波长为350nm，出峰时间15分钟的化合物为烟曲霉素(fumagillin)。

实施例6

上述实施例中发酵培养产物的HPLC分离纯化方法为：将大量培养的多个平板(3L培养基)的培养物分成小块置于较大玻璃容器中，加入3-5L MEA(乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸＝89:10:1)进行超声萃取(超声频率80Hz，时间为1小时)，收集提取液，重复上述操作3次；将3次萃取液合并，进行旋转蒸发(温度30℃，转速100rpm，真空度<3mmHg)，得到3g粗浸膏；将3g粗浸膏用甲醇溶解进行HPLC制备(RP-18,YMC-Pack,250×10mm Column,5μm，流速3ml/min)，选择中层析柱添加反相硅胶(ODS)，流动相为甲醇和水，体积比为20：80-100：0甲醇梯度洗脱。

经分离制备的产物为式1表示的化合物烟曲霉素(fumagillin)：

该菌和该培养方法还可产生式2表示的烟曲霉素衍生物fumagiringillin和式3表示的烟曲霉素衍生物RK-95113；

最后应说明的是：上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。