本发明涉及新型杂环衍生物及其药物组合物，特别是作为CDK4/6或HDAC抑制剂的新型杂环衍生物及其药物组合物。本发明还涉及这些化合物和组合物在治疗过度增殖性紊乱如癌症中的用途。
背景技术：
：周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependentkinase，CDK）是一类丝氨酸（Ser）/苏氨酸（Thr）激酶，作为细胞内重要的信号转导分子，和周期素（cyclin）形成的CDK-cyclin复合物，参与细胞的生长、增殖、休眠或者进入凋亡。细胞周期的过程中，cyclins周期性连续的表达和降解，并分别结合到由它们瞬时活化的CDK上，通过CDK活性，催化不同底物磷酸化，实现对细胞周期不同时相的推进和转化作用。CDK4/6-CyclinD复合物的底物为pRb。G1期早期,pRb被磷酸化,继而引起其与组蛋白脱乙酰基蛋白(HDAC)形成的复合物被破坏,其中的转录因子E2F-1和DP-1被释放出来,正反馈调节某些基因的转录,这些基因的蛋白产物，都是细胞在S期进程所必需的。在肿瘤细胞中，HDAC的过度表达导致去乙酰化作用的增强，通过恢复组蛋白正电荷,从而增加DNA与组蛋白之间的引力,使松弛的核小体变得十分紧密,不利于一些肿瘤抑制基因的表达。CDK4/6的高度活化以及HDAC过度表达同时促进了肿瘤细胞的增殖。靶向CDK4/6的同时靶向HDAC的抑制剂能够更加有效地抑制肿瘤细胞进入S期，阻滞在G1期。因此，同时靶向CDK4/6和HDAC的抑制剂具有更好的药效，能够降低耐药性和毒副作用。技术实现要素：本发明的化合物是CDK4/6或HDAC抑制剂，可用于治疗受CDK4/6或HDAC介导的疾病和紊乱，例如癌症、包括乳癌、肝癌、套细胞淋巴瘤、脂肉瘤、非小细胞肺癌、黑素瘤、鳞状细胞食管癌等。本发明还涉及使用本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物来治疗与其有关的紊乱。本发明涉及新的具有式(I)的新型杂环衍生物及其盐、包括可药用盐：其中：R1选自H、、、、、、、、、、烯基、炔基、杂环基、芳基、杂芳环，其中R4和R5分别是氢基、烃基、环烷基、杂原子环烷基、芳基或杂芳环；R2是C3-7烷基；任选被一个选自C1-6烷基和OH的取代基取代的C4-7环烷基；任选被一个选自C1-6烷基、C(CH3)2CN和OH的取代基取代的苯基；任选被一个环丙基或C1-6烷基取代的哌啶基；任选被一个环丙基或C1-6烷基取代的四氢吡喃基；或二环[2.2.1]庚烷基；R3选自取代或未取代的芳基，取代或未取代的吡啶基，取代或未取代的嘧啶基，取代或未取代的氧化嘧啶基，取代或未取代的吡嗪基，取代或未取代的吡咯基，取代或未取代的吡唑基，取代或未取代的咪唑基，取代或未取代吲哚基，取代或未取代异吲哚基，取代或未取代呋喃基，取代或未取代噻唑基，取代或未取代噁唑啉基，取代或未取代噻吩基；R4选自、、、、、、、、、、、、、、、、、、、其中n=3~7，A、D各自独立选自价键、O、NH、NR7、CO、C(S)NH2、C(O)NH2、NH2C(O)、NH2C(S)、CH2或S(O)1~2，R5、R6、R7可各自独立的选自H、OH、C1-C8烷烃、-(CH2)t(C6-C10烷烃)、-(CH2)t(C6-C10杂烷烃)、-(CH2)t(C3-C10)环烷烃)、-(CH2)t(C6-C10环杂烷烃)，其中t代表数字0-4，所有的烷烃可选择被一个或更多的F或Cl取代；L是价键、O、NH、C(O)、C(S)NH2、C(O)NH2、NH2C(O)、NH2C(S)、CH2或S(O)1~2；X和Z各自独立选自CH、N，当Z选N时，R1为无取代基。本发明所述新型杂环衍生物可以根据常规药物配制技术与药物载体或赋形剂(例如药学上可接受的载体和赋形剂)混合形成药物制剂。可以将所述新型杂环衍生物作为活性成分混合在任何常用的口服剂型中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂和液体制剂(例如酏剂和混悬剂)，其中包含着色剂、矫味剂、稳定剂和掩盖味道的物质。对于混合口服剂型来说，所述新型杂环衍生物作为活性成分可以与各种普通片剂材料(例如淀粉、碳酸钙、乳糖、蔗糖和磷酸二钙)混合以助于压片和装入胶囊。可以将所述新型杂环衍生物在药学上可接受的无菌液体载体例如无菌水、无菌有机溶剂或者两者的混合物中溶解或混悬。液体载体可以是适合注射剂的载体，比如生理盐水、丙二醇或者聚乙二醇水溶液。在其他情况下，还可以将微粉化的活性成分分散在淀粉或羧甲基纤维素钠的水溶液中或分散在适当的油(例如花生油)中来制得。液体药物制剂(指无菌溶液或混悬剂)可以用于静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射或者皮下注射。本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含至少一种作为活性成分的本发明所述新型杂环衍生物。除此之外，所述药物组合物还可以包含一种或多种无机或有机、固体或液体的药学上可接受的载体或者赋形剂。术语“药学上可接受的”是指当给药至动物例如哺乳动物(例如人类)时生理学上可耐受且通常不会产生过敏或类似的不良反应(例如头晕等)的添加剂或组合物。药物载体和赋形剂可以包括但不限于稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、甘露糖和/或甘油；润滑剂；聚乙二醇；粘合剂，例如硅酸铝镁、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；并且，如果需要的话，还包括崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠；和/或吸附剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂和甜味剂。具体实施方式下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。本文所用的缩略语通常为本领域技术人员所熟知的，或者可以是根据基础知识易于理解的。在本发明化合物的制备中所采用的起始原料是已知的、能够根据已知方法制备的或者可商购获得的。本发明还涉及新的中间体和/或起始原料。特别优选与实施例中提到的那些相同或者相似的反应条件和新中间体。中间体和终产物都可以根据常规方法进行后处理和/或纯化，所述常规方法包括调节pH、萃取、过滤、干燥、浓缩、色谱法、研磨、结晶等。另外，本发明化合物还可以通过本领域已知的各种方法或者本文所述方法的变通方法进行制备。下列实施例仅用于举例说明本发明，不以任何方式对本发明进行限制。实施例18-((4-((7-环戊基-6-(二甲氨基甲酰基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯的制备步骤1.1：8-((4-氨基苯胺)氨基)-8-氧代辛酸甲酯的制备在500mL单口瓶中加入辛二酸单甲酯（3.97g，21.3mmol），对苯二胺(2.31g,21.3mmol），DMF30mL及DIPEA(13mL,74.4mmol)。室温搅拌5分钟。加入EDCI（4.5g，23.4mmol），室温搅拌过夜。反应结束后缓慢滴加氯化铵水溶液（30g氯化铵，300mL水），滴毕，室温搅拌2h，过滤，收集固体，真空干燥，得粉红色固体3.19g，产率=51%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.42(s,1H),7.19(d,J=8.5Hz,2H),6.47(d,J=8.5Hz,2H),4.82(s,2H),3.57(s,3H),2.29(t,J=7.4Hz,2H),2.19(t,J=7.4Hz,2H),1.53(h,J=7.4Hz,4H),1.35–1.19(m,4H)；步骤1.2：8-((4-((7-环戊基-6-(二甲氨基甲酰基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯的制备在50mL两口瓶中加入2-氯-7-环戊基-N，N-二甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-甲酰胺（504mg，1.71mmol），8-((4-氨基苯胺)氨基)-8-氧代辛酸甲酯(524mg,1.88mmol），醋酸钯（10mg，0.045mmol）及BINAP(53mg，0.09mmol)及碳酸铯（616.8mg，1.88mmol）,充入氩气，加入1,4-二氧六环7.5mL，加热至100℃，反映过夜。反应结束后，加入乙酸乙酯200mL稀释，依次用饱和碳酸钠水溶液，水及饱和食盐水洗涤，干燥，过滤，除去有机溶剂，残余物柱层析纯化得476.2mg，产率=51.8%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.57(s,1H),7.77(s,1H),7.65–7.53(m,3H),7.37(d,J=8.4Hz,2H),6.36(s,1H),4.70(p,J=8.9Hz,1H),3.65(s,3H),3.14(s,6H),2.55(t,J=10.7Hz,2H),2.31(dt,J=11.1,7.5Hz,5H),2.08–1.93(m,5H),1.77–1.57(m,4H),1.36(dq,J=8.6,4.5Hz,4H)。实施例2N-1-(4-((7-环戊基-6-(二甲氨基甲酰基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)-N-8-羟氨氧代辛酸酰胺的制备在50mL两口瓶中加入8-((4-((7-环戊基-6-(二甲氨基甲酰基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（250mg，0.47mmol），羟胺水溶液（50%，2ml），甲醇5mL，加热回流，反映过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得199mg，产率=79.4%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.34(s,1H),9.74(s,1H),9.44(s,1H),8.72(s,1H),7.81–7.65(m,2H),7.60–7.44(m,2H),6.57(s,1H),4.83–4.64(m,1H),3.06(s,6H),2.47(m,2H),2.27(t,J=7.4Hz,2H),2.20(t,J=7.3Hz,1H),1.97(dq,J=14.6,7.4Hz,5H),1.73–1.45(m,6H),1.34–1.26(m,4H)。实施例38-(4-{6-[(7-环戊基-6-二甲氨基甲酰基-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基]吡啶基-3-基}哌嗪基-1-基)-8-氧代辛酸甲酯在50mL两口瓶中加入7-环戊基-N,N-二甲基-2-[[5-(1-哌嗪基)-2-吡啶]氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺（200mg,0.46mmol），DMF2mL，辛二酸单甲酯（109mg,0.55mmol），N,N-二异丙基乙胺（132mg,0.69mmol），及EDCI（134mg,0.69mmol)，室温搅拌4小时。反应结束后，加入乙酸乙酯100mL稀释，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、水、饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，除去有机溶剂，残余物通过柱层析纯化得棕色固体134.5mg，产率=48%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.73(s,1H),8.43–8.34(m,1H),8.02(d,J=2.9Hz,1H),7.33(dd,J=9.1,3.0Hz,1H),6.43(d,J=1.4Hz,1H),4.78(t,J=8.9Hz,1H),3.79(t,J=5.1Hz,2H),3.65(s,5H),3.14(s,6H),3.13–3.07(m,4H),2.63–2.51(m,2H),2.39–2.33(m,2H),2.29(td,J=7.5,2.4Hz,2H),2.12–1.98(m,4H),1.74–1.59(m,6H),1.36(dd,J=7.3,3.7Hz,4H)。实施例48-({6-[(7-环戊基-6-二甲氨基甲酰基-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基]吡啶基-3-基}氨基)-8-氧代辛酸甲酯在100mL两口瓶中加入2-氯-7-环戊基-N，N-二甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-甲酰胺（322mg，1.1mmol），8-((6-氨基吡啶-3-基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯(279mg,1mmol），醋酸钯（5.6mg，0.025mmol）及BINAP(31mg，0.05mmol)及碳酸铯（489mg，1.5mmol）,充入氩气，加入1,4-二氧六环10mL，加热至100℃，反应3小时。反应结束后，加入乙酸乙酯200mL稀释，依次用饱和碳酸钠水溶液，水及饱和食盐水洗涤，干燥，过滤，除去有机溶剂，残余物柱层析纯化得244.3mg，产率=45.6%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.94(s,1H),9.61(s,1H),8.79(s,1H),8.49(s,1H),8.25(d,J=9.1Hz,1H),7.96(d,J=9.0Hz,1H),6.63(d,J=9.1Hz,1H),4.85–4.63(m,1H),3.57(s,3H),3.05(d,J=10.3Hz,6H),2.30(t,J=7.5Hz,4H),1.98(m,6H),1.71–1.47(m,6H),1.37–1.24(m,4H)。实施例58-((4-((9-环戊基-9H-嘌呤-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯步骤5.1：在250mL两口瓶中加入2-氯-5-氨基-4-环戊胺基嘧啶（2.13g，10mmol），无水硫酸镁（1.2g，10mmol），原甲酸三乙酯（10.4mL，100mmol）及DMF50ml。加热至120℃，反应过夜。TLC检测，反应完毕后加入乙酸乙酯500mL，依次用水，饱和碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤2次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压除去有机溶剂，残余物柱层析纯化得棕黄色固体1.38g，产率=62%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.94(s,1H),8.13(s,1H),5.08–4.73(m,1H),2.38–2.22(m,2H),2.05–1.89(m,4H),1.86–1.73(m,2H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ154.07,153.20,150.03,144.33,133.45,56.14,32.73,23.85；步骤5.2：在100mL两口瓶中加入2-氯-9-环戊基-9H-嘌呤（445mg，2mmol），8-((4-氨基苯胺)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（559mg，2mmol），醋酸钯（11.2mg，0.05mmol），BINAP（62.3mg，0.1mmol），碳酸铯（717mg，2.2mmol），抽真空置换氩气三次，然后加入二氧六环20mL，加热至100℃，反应过夜。TLC检测，反应完毕后加入乙酸乙酯300mL，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，水，饱和食盐水洗涤，有机相干燥，过滤，减压除去有机溶剂，残余物通过柱层析纯化，得类白色固体714.5mg，产率=76.9%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.74(s,1H),7.84(s,1H),7.82–7.67(m,2H),7.67–7.60(m,2H),7.53–7.47(m,2H),4.81(p,J=7.5Hz,1H),3.64(s,3H),2.29(ddt,J=19.5,12.2,6.6Hz,6H),2.12–1.99(m,2H),1.94(tt,J=6.9,3.7Hz,2H),1.85–1.65(m,4H),1.60(p,J=7.3Hz,2H),1.35(qd,J=8.1,5.1,4.6Hz,4H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ174.29,171.31,156.10,152.58,149.25,141.42,136.29,132.60,128.91,120.64,119.25,55.98,51.53,37.44,33.95,32.28,28.82,28.77,25.45,24.71,24.11。实施例6N1-(4-((9-环戊基-9H-嘌呤-2-基)氨基)苯基)-N8-羟氨氧代辛酸酰胺在50mL两口瓶中加入8-((4-((9-环戊基-9H-嘌呤-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（350mg，0.75mmol），羟胺水溶液（50%，5ml），甲醇5mL，加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得白色固体156.9mg，产率=33.7%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.35(s,1H),9.75(s,1H),9.53(s,1H),8.73(d,J=35.5Hz,2H),8.26(s,1H),7.73(d,J=8.4Hz,2H),7.50(d,J=8.6Hz,2H),4.99–4.73(m,1H),2.37–2.00(m,6H),2.00–1.81(m,4H),1.71(s,2H),1.53(d,J=31.4Hz,4H),1.28(s,4H)。13CNMR(101MHz,DMSO)δ171.15,169.56,156.47,152.46,149.46,142.99,136.75,133.46,128.80,119.91,119.03,55.87,36.74,32.72,31.90,28.92,28.89,25.59,25.52,24.22。实施例78-((4-((3-环戊基-3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶-5-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯步骤7.1；在50mL两口瓶中加入2-氯-5-氨基-4-环戊胺基嘧啶（2.13g，10mmol）和浓盐酸（20mL），放入0℃下搅拌10分钟，将亚硝酸钠（828mg，12mmol）溶于水5ml中，缓慢滴加到反应瓶中。加入完毕后搅拌30分钟后移至室温搅拌2小时。TLC检测，反应完毕后将反应液倒入饱和碳酸氢钠水溶液中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相依次用水，饱和碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤1次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压除去有机溶剂，残余物柱层析纯化得白色固体1.45g，产率=65%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.34(s,1H),5.32(p,J=7.1Hz,1H),2.40–2.18(m,J=6.5Hz,4H),2.10–1.96(m,2H),1.90–1.66(m,2H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ158.34,153.04,150.47,135.13,59.53,32.70,24.42；步骤7.2；在100mL两口瓶中加入5-氯-3-环戊基-3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶（335.7mg，1.5mmol），8-((4-氨基苯胺)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（462.4mg，1.65mmol），醋酸钯（8.6mg，0.038mmol），BINAP（47.1mg，0.08mmol），碳酸铯（538mg，1.65mmol），抽真空置换氩气三次，然后加入二氧六环15mL，加热至100℃，反应过夜。TLC检测，反应完毕后加入乙酸乙酯300mL，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，水，饱和食盐水洗涤，有机相干燥，过滤，减压除去有机溶剂，残余物通过柱层析纯化，得黄色固体516mg，产率=73.9%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.09(s,1H),7.93(s,1H),7.66(d,J=8.8Hz,3H),7.59–7.51(m,2H),5.21(p,J=7.3Hz,1H),3.65(s,3H),2.35(t,J=7.5Hz,2H),2.29(q,J=6.4,5.5Hz,6H),2.09–1.95(m,3H),1.86–1.66(m,4H),1.61(p,J=7.3Hz,2H),1.36(dt,J=8.5,5.1Hz,4H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ174.32,171.40,158.02,152.57,150.11,135.07,133.60,132.23,120.59,120.04,58.87,51.56,37.47,33.95,32.25,28.81,28.76,25.42,24.70,24.66。实施例8N1-(4-((3-环戊基-3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶-5-基)氨基)苯基)-N8-羟氨氧代辛酸酰胺在50mL两口瓶中加入8-((4-((3-环戊基-3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶-5-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（150mg，0.32mmol），羟胺水溶液（50%，3ml），乙醇3mL，加热回流，反应过夜。反应结束后，除去溶剂，残余物柱层析纯化得白色固体48.4mg，产率=32.3%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.96(s,1H),10.16(s,1H),9.82(s,1H),9.31(s,1H),7.76(d,J=8.6Hz,2H),7.56(d,J=8.7Hz,2H),5.24(p,J=7.3Hz,1H),2.34–2.15(m,8H),2.01–1.85(m,2H),1.76(p,J=7.8,5.6Hz,2H),1.54(dt,J=32.4,7.0Hz,4H),1.40–1.24(m,4H)。13CNMR(101MHz,DMSO)δ175.02,171.31,158.48,153.36,149.97,135.36,134.68,131.90,120.11,119.80,58.71,36.76,34.15,32.11,28.90,28.82,25.52,24.89,24.76。实施例97-环戊基-2-((4-(8-羟基辛酰胺)苯基)氨基)-N,N-二甲胺-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺在25mL两口瓶中加入8-((4-((7-环戊基-6-(二甲氨基甲酰基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（268mg,0.5mmol)及四氢呋喃5mL，-10℃下搅拌5分钟。小心缓慢加入四氢锂铝（29mg,0.75mmol)，加料完毕后，升温至0℃，反应2小时。TLC检测反应结束后加入2NNaOH(0.03mL)和水(0.1mL)。搅拌30分钟，硅藻土过滤，用二氯甲烷洗涤。滤液分层，有机相用水及饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤减压除去有机溶剂，残余物柱层析纯化得淡黄色固体144.1mg，产率57%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.82–9.64(m,1H),9.54–9.36(m,1H),8.71(q,J=5.5,4.6Hz,1H),7.84–7.66(m,2H),7.50(d,J=7.2Hz,2H),6.56(q,J=6.1,5.0Hz,1H),4.70(q,J=9.4,8.7Hz,1H),4.34(d,J=6.8Hz,1H),3.03(s,6H),2.48(s,2H),2.25(d,J=8.1Hz,2H),1.96(dd,J=13.7,7.3Hz,4H),1.60(d,J=30.4Hz,4H),1.39(s,2H),1.27(d,J=8.2Hz,6H)。13CNMR(101MHz,DMSO)δ171.18,163.37,156.02,152.57,151.71,136.75,133.40,131.80,119.78,118.92,111.72,101.19,61.15,57.39,36.78,35.14,32.99,30.02,29.25,29.22,25.89,25.65,24.64。实施例108-((4-((7-环戊基-6-(二甲氨基甲酰胺)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸在25mL两口瓶中加入8-((4-((7-环戊基-6-(二甲氨基甲酰基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（536mg,1mmol)及四氢呋喃/甲醇/水各5mL，室温搅拌，加入氢氧化钠（60mg，1.5mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后用乙酸乙酯50mL稀释，倒入到饱和氯化铵水溶液中，用乙酸乙酯30mL*2萃取，合并有机相，用水及饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压除去有机溶剂。残余物用乙醇和甲苯重结晶得桔黄色固体484.1g，产率=92.7%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.01(s,1H),9.75(s,1H),9.46(s,1H),8.71(s,1H),7.75(d,J=8.4Hz,2H),7.52(d,J=8.5Hz,2H),6.55(s,1H),4.72(p,J=8.9Hz,1H),3.04(d,J=7.5Hz,6H),2.50–2.39(m,2H),2.27(t,J=7.4Hz,2H),2.20(t,J=7.3Hz,2H),2.02–1.90(m,4H),1.70–1.54(m,4H),1.55–1.46(m,2H),1.35–1.25(m,4H)。13CNMR(101MHz,DMSO)δ174.47,170.66,162.89,155.54,152.04,151.24,136.28,132.92,131.31,119.33,118.44,111.24,100.69,56.91,36.25,34.55,33.61,29.55,28.43,28.34,25.06,24.38,24.16。实施例11N1-(4-((7-环戊基-6-(二甲氨基甲酰胺)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)-N8，N8-二甲基辛酰胺在50mL两口瓶中加入8-((4-((7-环戊基-6-(二甲氨基甲酰胺)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸（110mg，0.21mmol），HOBT（34mg，0.045m.mol），DIPEA(54mg，0.42mmol)及四氢呋喃（5mL），加入EDCI(61mg,0.32mmol），搅拌5分钟后加入二甲胺（0.21mL，0.42mmol，2M/THF），室温搅拌过夜。反应结束后，加入乙酸乙酯50mL稀释，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，水及饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压除去有机溶剂，残余物通过柱层析纯化得土黄色固体70.2mg，产率=60.5%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.76(s,1H),9.46(s,1H),8.71(s,1H),7.74(d,J=8.5Hz,2H),7.52(d,J=8.5Hz,2H),6.56(s,1H),4.72(p,J=8.8Hz,1H),3.04(s,6H),2.92(s,3H),2.78(s,3H),2.49–2.41(m,2H),2.26(q,J=8.0Hz,4H),2.04–1.88(m,4H),1.72–1.52(m,4H),1.48(t,J=7.3Hz,2H),1.35–1.21(m,4H)。13CNMR(101MHz,DMSO)δ172.32,171.17,163.38,156.04,152.54,151.73,136.76,133.42,131.81,119.79,118.91,111.73,101.18,57.40,37.12,36.76,35.19,35.06,32.74,30.03,29.07,25.59,25.02,24.65。生物学测定。HDAC1酶活性测定。体外检测化合物HDAC1酶的生物学活性是在384孔板进行的。实验中，使用全长的HDAC1蛋白，在Km的浓度下，于荧光标记的多肽Ac-peptide-AMC（Ac：乙酰基，AMC：7-氨基-4-甲基香豆素）中孵化。在Tris-based测定缓冲液中反应，随后在去乙酰基酶和胰蛋白酶作用下，底物释放荧光团7-氨基-4-甲基香豆素，使用多标记微孔板检测仪进行荧光检测(355nm激发,460nm发射)。数据进行荧光随时间的线性分析。软件进行数据处理计算IC50值。实验材料：HDAC1(BPSBioscience,USA,Cat.No.50051)；384-wellplate(fromPerkinElmer,Cat.No.6007279)。实验方法：首先准备1x实验缓冲液(Tris缓冲液)；将溶于DMSO中的抑制剂，四倍连续稀释加入到多孔板中；准备酶溶液:在1x实验缓冲液中准备酶溶液；准备底物溶液：在1x实验缓冲液中加入胰蛋白酶和乙酰基修饰的多肽底物；将15μL的酶溶液加入到多孔板中；室温孵化15分钟；每个孔中加入10μL底物溶液，反应开始；室温孵化60分钟。在SynergyMX仪上，355nm激发和460nm发射波长下读板。在Excel中使用下列公式进行数据处理计算抑制率(1)公式(1):抑制率%=(最大值-读数)/(最大值-最小值)*100使用软件GraphPadPrismV5.0和公式（2）处理数据得到IC50值(2)，公式(2):Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*面积阙值))。Y是抑制率%，X是化合物浓度。CDK4/6酶活性测定。采用CaliperMobilityShiftAssay方法测试化合物对CDK4/6酶的抑制活性，该技术将毛细管电泳的基本理念应用到微流体环境中，在不加入中止试剂的情况下检测酶学实验。用于实验的底物是带有荧光标记的多肽，在反应体系中酶的作用下，底物转变为产物，其所带的电荷也发生了相应的变化，Mobility-ShiftAssay利用底物和产物所带电荷的不同，将二者进行分离，并分别进行检测。实验材料：CDK4/CycD3(Carna,Cat.No04-105,Lot.No10CBS-0429C,GST-CDK4(1-303end)/GSTCycD3(1-292end));PeptideFAM-P8(GLBiochem,Cat.No.112396,Lot.No.P100804-XZ112396);ATP(Sigma,Cat.No.A7699-1G,CASNo.987-65-5);DMSO(Sigma,Cat.No.D2650,Lot.No.474382)；EDTA(Sigma,Cat.No.E5134,CASNo.60-00-4);96-wellplate(Corning,Cat.No.3365,Lot.No.22008026);384-wellplate(Corning,Cat.No.3573,Lot.No.12608008)。实验方法：测定MobilityShift上的ATP表观Km,384微孔板中加入5μL/孔的2×enzyme&peptide混合液。加入5μL/孔三倍梯度稀释的2×ATP溶液，启动反应。室温离心1min，放入23°C培养箱反应60min后，加入5uL/孔3×stopbuffer（100mMHEPES,pH7.5；0.015%Brij-35；0.2%CoatingReagent#3；50mMEDTA）终止反应，置于CaliperEZReaderI上进行检测；在96微孔板中对化合物在5μM浓度进行4倍梯度稀释,加入100μL,100％DMSO作为无化合物无激酶对照组，取10μL化合物加入到一个新的96孔微孔板，再加入90μL,1×kinasebasebuffer(20mMHEPES,pH7.5;0.01%TritonX-100;10mMMgCl2;2mMDTT)，将该板放置在摇床上10分钟以将化合物混匀；每孔取5μL混合液加入到384孔微孔板中。384孔微孔板各孔中加10μL，2.5×enzymesolution。室温下孵育10分钟后再在各孔中再加10μL,2.5×的多肽溶液(1×kinasebasebuffer中加入FAM-labeledpeptide和ATP）。激酶反应，指定时间停止，孵育30℃。加25μLstopbuffer终止反应。置于CaliperEZReaderI上进行检测。表1为化合物对HDAC1激酶的抑制效力表2为化合物对CDK4激酶的抑制效力表1实施例编号HDAC1(μM)实施例编号HDAC1(μM)1>57>520.002280.4333>59>54>510>55>511>560.0026表2实施例编号CDK4(μM)实施例编号CDK4(μM)10.01270.85720.008881.14030.01390.0140.047100.0185>5110.0166>5当前第1页1 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