本发明涉及一种用于预防和治疗肝病特别是肝纤维化、由肝纤维化导致的肝硬化的药物组合物，其含有咪唑并吡啶类化合物作为有效成分。
背景技术：
：随着世界科技、经济的发展，人们生活节奏的加快和生活水平的不断提高，脂肪肝、酒精肝、肝癌等肝脏疾病的发病率也随之不断上升。我国是肝病大国，在肝病患者中有一部分会转化为肝硬化或肝癌。保肝类药物成为当今世界新药研究与开发的最热门领域之一。肝细胞的损伤导致细胞坏死，坏死后肝细胞会再生，这归功于它们优秀的先天再生能力。然而，反复发生坏死和再生会触发肝纤维化，并进一步发展为肝硬化。肝纤维化由胶原蛋白，即一种纤维发生物质，在肝脏中的积累所导致。肝脏细胞由肝细胞、窦状隙内皮细胞、Kupper细胞和肝星状细胞组成，肝细胞一且受到损伤，Kupper细胞开始消灭损伤的肝细胞，并分泌细胞因子(TGF-beta，PDGF，FGF，HGF，PAF和ET-1)来增殖肝星状细胞，此时肝星状细胞分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞合成胶原蛋白，所述胶原蛋白在细胞外基质中累积并导致肝纤维化。这意味着肝星状细胞的活化在肝纤维化的发展中扮演基本角色。肝硬化归因于肝纤维化，肝硬化是通过连续积累的胶原蛋白的聚合，并将积累的胶原蛋白改变为不溶性纤维发展而成的。肝硬化还能通过肝内连续的炎症所诱导，该过程伴随着肝细胞的破坏、再生和瘢疤形成。作为结果，肝尺寸减小，并且肝表面变得崎岖不平。严重的肝硬化会引起致命并发症的严重疾病，如门静脉高血压、肝细胞瘤等。本发明提供了一种用于预防和治疗肝病特别是肝纤维化、由肝纤维化导致的肝硬化的药物组合物，其含有咪唑并吡啶类化合物作为有效成分，所述化合物具有良好的胶原蛋白合成抑制作用，能够抑制肝纤维化，具有预防和治疗肝硬化的作用。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种用于预防和治疗肝病的药物组合物，其含有式I所示的咪唑并吡啶类化合物作为其有效成分。式I所示的咪唑并吡啶类化合物结构如下：其中：每个X各自独立地选自N和CR3，条件是至少有一个X为N；Het表示任选被取代的含1-3个选自O、N及S(O)m的杂原子的5或6元杂环；R1表示H或(C1-4)烷基；R2、R3各自独立地表示是H、卤素、羟基、氰基、硝基、(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、-C(O)-Rx、-S(O)2-Rx或-NH-C(O)-Rx，其中Rx表示H或(C1-4)烷基；R4表示H或(C1-4)烷基；m表示0、1或2；n表示0、1、2或3。在一个实施方案中，所述式I化合物包括具有以下结构的式II化合物：在一个实施方案中，所述式I化合物包括具有以下结构的式III化合物：在一个实施方案中，所述5或6元杂环任选被卤素、OH、氧代、(C1-4)烷基、羟基(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基羰基取代。在一个实施方案中，所述5或6元杂环是具有1-3个选自O、N及S(O)m的杂原子的5或6元的饱和杂环烷基。在一个实施方案中，所述5或6元杂环是具有1-3个选自O、N及S(O)m的杂原子的5或6元的杂芳基。在一个实施方案中，所述卤素选自氟、氟、溴及碘。在一个实施方案中，所述5或6元杂环是具有1-3个选自O、N及S(O)m的杂原子的5或6元的饱和杂环烷基选自：四氢吡喃基、四氢呋喃基、1，4-二噁烷基、吗啉基、硫吗啉基、硫吗啉亚砜基、硫吗啉砜基、哌啶基、硫杂己环基。在一个实施方案中，所述5或6元杂环是具有1-3个选自O、N及S(O)m的杂原子的5或6元的杂芳基选自：吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻吩基、呋喃基、异噁唑基。在一个实施方案中，所述化合物为：本发明范围内所提及的任何上述式I所示的咪唑并吡啶类化合物其可能存在的任何药学上可接受的盐，特别是药学上可接受的酸加成盐。根据本发明，可由式I所示的咪唑并吡啶类化合物形成的生理上或药学上可接受的酸加成盐是指选自下列的可药用盐：盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、过氯酸盐、富马酸盐、马来酸盐、磷酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、甲苯对硫酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、丙二酸盐与苯磺酸盐。本发明还包括式I所示的咪唑并吡啶类化合物的所有溶剂化物、式I化合物的前药和衍生物，所述前药和衍生物在体外可能不一定显示出药理学活性，但在体内转化成药理学活性化合物。本发明所述的药物组合物包括式I所示的咪唑并吡啶类化合物、其可药用盐、溶剂化物、前药和衍生物，以及药学上可接受的载剂或赋形剂。术语“药学上可接受的载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些载体和稀释剂。“药学上可接受的赋形剂”是指与活性成分一同给药的、有利于活性成分的给药的惰性物质。“药学上可接受的载体或赋形剂”包括但不限于可用于人或家畜动物的任何载体、赋形剂、助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、崩解剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。所述赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇等等。以纯的形式或以适宜的药物组合物形式的本发明化合物的给药可通过提供类似用途的药剂的任何可接受给药模式来进行。本发明的药物组合物可通过将本发明的化合物与适宜的药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合而制备，且可配制成固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等等。给予本发明化合物或其药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、透黏膜、经肠给药，或者局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、鼻内、眼内、肌内、皮下、静脉内给药。优选的给药途径是口服给药。本发明的药物组合物可以采用本领域众所周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等等。本发明另一个目的为提供一种制备式I所示的咪唑并吡啶类化合物的方法，所述方法概述如下：其中X、Het、R1、R2、R3、R4、n如上文所述。本发明的再一个目的，在于提供式I所示的咪唑并吡啶类化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或衍生物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和治疗肝纤维化或肝硬化。本发明的再一个目的是提供肝纤维化抑制剂。本发明的再一个目的是提供一种通过抑制肝纤维化用于预防和治疗肝硬化的药物组合物。具体实施方式在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。实施例1：1-{2-[4-(2H-1，2，3-三唑-4-基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基]嘧啶-5-基}胍(化合物1)将4-氯-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶(3.8g，25mmol)、CuI(95mg，0.5mmol)和K2CO3(7.3g，52.5mmol)放入装有磁性搅拌棒的干燥压力管中，然后加入1-(2-溴嘧啶-5-基)胍(6.4g，30mmol)和溶剂二氧六环(50ml)，用氮气鼓泡5min。将压力管密封，并在搅拌下加热至100℃，持续12小时。将反应混合物冷却至室温，过滤，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩后用硅胶柱层析分离，使用环己烷和乙酸乙酯(20∶1-15∶1)作为洗涤剂，将含产物的馏分浓缩得到灰白色固体1-[2-(4-氯-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基)嘧啶-5-基]胍5.6g，产率78％，ESI-MS：289.06[M+H]+。将1-[2-(4-氯-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基)嘧啶-5-基]胍(2.9g，10mmol)、K2CO3(2.1g，15mmol)和CuO(39mg，0.5mmol)放入装有磁性搅拌棒的三颈瓶中，然后再加入2H-1，2，3-三唑-4-胺(1.0g，12mmol)和溶剂甲苯(100ml)，加热回流反应8小时，将反应混合物冷却至室温，过滤，用二氯甲烷洗涤，滤液浓缩后用硅胶柱层析分离，使用环己烷和乙腈(25∶1-15∶1)作为洗涤剂，将含产物的馏分浓缩得到白色固体1-{2-[4-(2H-1，2，3-三唑-4-基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基]嘧啶-5-基}胍2.7g，产率81％。ESI-MS：337.13[M+H]+元素分析：理论值/实测值，C(46.43/46.29)，H(3.60/3.70)，N(49.97/50.01)1HNMR(400MHz，CDCl3)δ11.51(s，1H)，9.50(s，1H)，8.97(s，1H)，8.53(s，2H)，7.99(d，1H)，7.78(s，1H)，6.87(d，1H)，7.15(s，1H)，6.61(s，2H)，4.05(s，1H)。实施例2：1-{5-[4-(2-羟甲基哌嗪-4-基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基]嘧啶-2-基}胍(化合物2)按照实施例1的方法，用1-(吡嗪-2-基)胍代替1-(2-溴嘧啶-5-基)胍，用4-氨基哌嗪-2-基代替2H-1，2，3-三唑-4-胺，得到浅黄色固体，总产率52％，ESI-MS：383.20[M+H]+。实施例3：1-{5-[4-(吡啶-4-基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基]吡嗪-2-基}胍(化合物3)按照实施例1的方法，用1-(吡嗪-2-基)胍代替1-(2-溴嘧啶-5-基)胍，用4-氨基哌啶-2-基代替2H-1，2，3-三唑-4-胺，得到浅黄色固体，总产率55％，ESI-MS：347.14[M+H]+。生物活性测定实施例：1.利用肝星状细胞研究式I所示的咪唑并吡啶类化合物对胶原蛋白合成的抑制作用肝星状细胞分离自SD白色雄性大鼠(重量约300g，n＝10)。首先，将氯胺酮注射到其腹腔内，从而麻醉该大鼠。打开其腹部，并将肝素注射到门静脉中。然后，将含有0.02％链霉蛋白酶和0.015％胶原蛋白酶的Hank’s缓冲溶液经肝灌注一段必需的时间，从而将肝制备为切片。将摘除的肝在无菌培养皿上碾碎，再将其放入含有链霉蛋白酶和DNA酶的缓冲溶液，并对该碾碎的肝在无菌培养皿上进行均化。利用100μm尼龙网在50ml的管中过滤所制备的样品。以50g离心2分钟，从而分离上清液中的非实质细胞。再一次在4℃以450g进行离心10分钟。使该沉淀漂浮在含有25μg/ml的DNA酶的缓冲溶液中，随后在4℃以450g离心10分钟，该过程重复两次。使最终沉淀漂浮在21ml缓冲溶液中，再将其与17ml的25％OptiPrep混合，从而制备11.2％OptiPrep的最终溶液(1.058g/cm3)。将与OptiPrep混合的细胞混悬液溶液小心地分配到4个装有3ml17％OptiPrep的15ml管中，向其中加入1ml的缓冲溶液。在4℃以1400g离心17分钟，作为结果，从所述缓冲溶液和11.8％OptiPrep间的不透明层中获得纯肝星状细胞。将分离的肝星状细胞悬浮于DMEM(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedia)中，随后洗涤。将该细胞再一次悬浮于添加了10％FBS(胎牛血清)和抗生素的DMEM中，然后接种在培养瓶中，将其培养在37℃，5％CO2的培养箱中。首先在24小时后更换该培养基，然后每48小时进行更换，从而进行继代培养。继代培养了8次的肝星状细胞以2×105进行分组，所述肝星状细胞经过25ng/ml的PDGF(血小板衍生生长因子)预处理24小时。在那时，将测试化合物及阳性对照辛伐他汀和西地那非以0，3，5和10ng/ml的不同的浓度加入，进行反应。提取总RNA并对胶原蛋白进行RT-PCR(反转录酶多聚酶链式反应)。基于与β-肌动蛋白的相对浓度，将靶物质与其它测试样品进行比较。为了确定靶样品对胶原蛋白合成的抑制作用，研究了抑制浓度50％(IC50)并将结果示于表1中。表1目标化合物对胶原蛋白合成的抑制作用测试对象IC50(nm)化合物10.6化合物21.2化合物31.6辛伐他汀7.9西地那非13.2如表1中所示，本发明化合物的IC50低于1.6nm，其胶原蛋白合成的抑制作用与辛伐他汀和西地那非相比，分别是其至少5倍和8倍，甚至可以达到13倍和22倍。可见，本发明化合物与现有药物如辛伐他汀和西地那非相比，对胶原蛋白合成具有更显著的抑制作用，并且从而对肝纤维化也具有显著的抑制作用以及由此的显著的肝保护作用，可用于肝硬化的预防和治疗。2.利用肝纤维化动物模型研究式I所示的咪唑并吡啶类化合物的肝保护作用将SD白色大鼠(体重大约300g)随机分为7组(每组10只)，并在除野生型对照组以外的实验组中诱导肝纤维化。将DMN(二甲基亚硝胺)以10mg/kg的剂量注射到腹腔中，以每周3次的剂量频率连续注射2周。将三唑缓冲剂中的化合物1-3和阳性对照辛伐他汀和西地那非以10mg/kg/天经口施用2周(DMN诱导期)。仅将三唑缓冲剂施用于所述溶剂对照组。2周后，摘除肝，在10％中性福尔马林中固定，包埋在石蜡中，并以4m切片。用二甲苯处理每个切片，从而去除石蜡，随后用酒精和0.1％过氧化氢处理。经PBS处理后，用以1∶500稀释的针对胶原蛋白类型I的多克隆抗血清和以1∶100稀释的针对胶原蛋白类型III的多克隆抗血清，在37℃处理所述切片1小时。洗涤后，用以1∶200稀释的生物素缀合山羊抗兔IgG处理样品。通过所述样品与抗生物素蛋白-生物素复合物反应进行免疫组织学染色，然后用3-氨基-9-乙基咔唑标记抗原-抗体复合物，其图像利用光学显微镜获取。结果表明，在所述溶剂对照组的肝门静脉内和门静脉附近观察到了与野生型动物相比，高水平的胶原蛋白的合成，而在化合物1-3和阳性对照辛伐他汀和西地那非的试验组中未观察到高水平的胶原蛋白的合成。这说明胶原蛋白的合成受到本发明式I所示的咪唑并吡啶类化合物、辛伐他汀和西地那非的显著抑制。以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。当前第1页1 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