本发明涉及药物制备领域，特别涉及内酯水解达托霉素的制备方法，具体的说涉及一种采用达托霉素树脂层析液一定条件转换及制备色谱方法制备高纯度内酯水解达托霉素。
背景技术：
随着抗生素的发展及抗生素的滥用，病原菌对抗生素的耐药性是当今社会面临的最严峻挑战。除了控制抗生素滥用外，目前寻找一种有效的对抗耐药菌的抗生素成了解决这一问题的最佳途径，万古霉素曾被认为是对抗革兰氏阳性菌的最后一道防线，但现在全世界临床已发现越来越多的耐此药菌。
达托霉素(Daptomycin)是由Lilly(礼来)公司最初研究，Cubist制药公司开发的一环脂肽类抗生素。应病人对新型耐药抗生素的迫切需求，2003年底，美国食品与药物管理局(FDA)经过快速审理程序批准注射用达托霉素(Daptomycin)(商品名cubicin)用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感染和皮肤溃疡。达托霉素的作用机制与其他抗生素不同，它通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的，因此细菌对达托霉素产生耐药性可能会比较困难。
达托霉素虽然已经在美国实现工业化生产，但在达托霉素产品中常包含有脱水达托霉素、异构达托霉素、达托霉素内酯水解物等杂质，严重影响产品质量，为此能够单独分离纯化出达托霉素中的杂质并进行研究是非常必要的。
现有的达托霉素提取方法，例如欧洲专利1586580A2所描述的达托霉素杂质归属，并未具体涉及达托霉素杂质分离方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种操作简便、成本低廉且能快速得到高纯度达托霉素内酯水解物的制备方法。
根据欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法对达托霉素进行检测，结合欧洲专利1586580A2所描述的达托霉素杂质归属，对达托霉素杂质归属命名和定位情况如图1所示，图1中DT代表达托霉素(保留时间38.555min)， 达托霉素内酯水解物峰位于保留时间27.250min处。
本发明提供的达托霉素内酯水解物制备方法，包括如下步骤：
1)将达托霉素发酵液过滤，滤液经过树脂层析，得到达托霉素内酯水解物树脂层析液；
2)将步骤1)所得树脂层析液调节pH2～6，4～50℃保存1～2天，得到含较高色谱纯度达托霉素内酯水解物的溶液；
3)将步骤2)所得溶液经过制备色谱柱分离纯化，得色谱纯度>90％的达托霉素内酯水解物的制备液；
4)将步骤3)所得制备液冻干，得到达托霉素内酯水解物。
优选的，上述步骤1)中滤液经FPDA13树脂层析，得到色谱纯度>5％(优选>10％)的达托霉素内酯水解物的树脂层析液。其中滤液上FPDA13树脂层析柱后，先用0.03N氯化钠、0.06N醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液冲洗柱子，然后用0.3N氯化钠、0.06N的醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液洗脱，收集色谱纯度>5％(优选>10％)的达托霉素内酯水解物树脂层析液。上述步骤2)优选将树脂层析液调节pH3～6，保存温度优选为10～40℃。
上述步骤3)采用制备色谱分离系统进一步分离纯化达托霉素内酯水解物的溶液，流动相采用甲醇和三氟乙酸溶液的混合液，具体色谱条件是：
色谱柱：LP-C8、250×21.2mm
波长：214nm
流动相：甲醇、三氟乙酸溶液
流速：19mL/min
柱温：20～30℃室温
其中，三氟乙酸溶液浓度为0.01％～0.2％，优选0.01％～0.05％；
流动相比例为甲醇:三氟乙酸溶液＝20:80～60:40(体积比，下同)，优选20:80～40:60。
在本发明方法中，达托霉素发酵液经树脂层析、破坏、制备色谱分离系统处理后，得到的达托霉素内酯水解物，其色谱纯度在96％以上。该方法简单易行，成本低廉。
附图说明
图1是达托霉素HPLC检测图谱，其中显示了达托霉素各杂质的归属和定位情况。
具体实施方式
以下通过实施例进一步描述本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
达托霉素发酵液过滤后滤液上FPDA13树脂层析，用0.03N氯化钠、0.06N醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液2BV冲洗柱子，0.3N氯化钠、0.06N的醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液洗脱，收集色谱纯度大于10％的达托霉素内酯水解物层析液，调节pH2.5，20℃恒温保存24h，得到色谱纯度20％的达托霉素内酯水解物溶液。
达托霉素内酯水解物溶液经制备色谱(流动相为甲醇:0.01％三氟乙酸＝25:75)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)，收集色谱纯度>90％的达托霉素内酯水解物的制备液。
制备液真空冻干，所得固体采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素内酯水解物纯度，其纯度在96％。
实施例2
达托霉素发酵液过滤后滤液上FPDA13树脂层析，0.03N氯化钠、0.06N醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液2BV冲洗柱子，0.3N氯化钠、0.06N的醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液洗脱，收集色谱纯度大于10％的达托霉素内酯水解物层析液，调节pH3，20℃恒温保存24h，得到色谱纯度25％的达托霉素内酯水解物溶液。
达托霉素内酯水解物溶液经制备色谱(流动相为甲醇:0.01％三氟乙酸＝25:75)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)，收集色谱纯度>90％的达托霉素内酯水解物的制备液。
制备液真空冻干，所得固体采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素内酯水解物纯度，其纯度在96.5％。
实施例3
达托霉素发酵液过滤后滤液上FPDA13树脂层析，0.03N氯化钠、0.06N醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液2BV冲洗柱子，0.3N氯化钠、0.06N的醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液洗脱，收集色谱纯度大于10％的达托霉素内酯水解物层析液，调节pH4，20℃恒温保存24h，得 到色谱纯度37％的达托霉素内酯水解物溶液。
达托霉素内酯水解物溶液经制备色谱(流动相为甲醇:0.01％三氟乙酸＝25:75)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)，收集色谱纯度>90％的达托霉素内酯水解物的制备液。
制备液真空冻干，所得固体采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素内酯水解物纯度，其纯度在96.3％。
实施例4
达托霉素发酵液过滤后滤液上FPDA13树脂层析，0.03N氯化钠、0.06N醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液2BV冲洗柱子，0.3N氯化钠、0.06N的醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液洗脱，收集色谱纯度大于10％的达托霉素内酯水解物层析液，调节pH5，20℃恒温保存24h，得到色谱纯度25％的达托霉素内酯水解物溶液。
达托霉素内酯水解物溶液经制备色谱(流动相为甲醇:0.01％三氟乙酸＝25:75)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)，收集色谱纯度>90％的达托霉素内酯水解物的制备液。
制备液真空冻干，所得固体采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素内酯水解物的纯度，其纯度在97％。
实施例5
达托霉素发酵液过滤后滤液上FPDA13树脂层析，0.03N氯化钠、0.06N醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液2BV冲洗柱子，0.3N氯化钠、0.06N的醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液洗脱，收集色谱纯度大于10％的达托霉素内酯水解物层析液，调节pH4.5，30℃恒温恒湿箱保存24h，得到色谱纯度30％的达托霉素内酯水解物溶液。
达托霉素内酯水解物溶液经制备色谱(流动相为甲醇:0.01％三氟乙酸＝25:75)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)，收集色谱纯度>90％的达托霉素内酯 水解物的制备液。
制备液真空冻干，所得固体采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)检测内酯水解达托霉素纯度，其纯度在97％。
实施例6
达托霉素发酵液过滤后滤液上FPDA13树脂层析，0.03N氯化钠、0.06N醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液2BV冲洗柱子，0.3N氯化钠、0.06N的醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液洗脱，收集色谱纯度大于10％的达托霉素内酯水解物层析液，调节pH4.5，40℃恒温保存24h，得到色谱纯度18％的达托霉素内酯水解物溶液。
达托霉素内酯水解物溶液经制备色谱(流动相为甲醇:0.01％三氟乙酸＝25:75)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)，收集色谱纯度>90％的达托霉素内酯水解物的制备液。
制备液真空冻干，所得固体采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素内酯水解物纯度，其纯度在96％。
实施例7
达托霉素发酵液过滤后滤液上FPDA13树脂层析，0.03N氯化钠、0.06N醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液2BV冲洗柱子，0.3N氯化钠、0.06N的醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液洗脱，收集色谱纯度大于10％的达托霉素内酯水解物层析液，调节pH4.5，20℃恒温保存24h，得到色谱纯度27％的达托霉素内酯水解物溶液。
达托霉素内酯水解物溶液经制备色谱(流动相为甲醇:0.01％三氟乙酸＝30:70)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)，收集色谱纯度>90％的达托霉素内酯水解物的制备液。
制备液真空冻干，所得固体采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素内酯水解物纯度，其纯度在99％。
实施例8
达托霉素发酵液过滤后滤液上FPDA13树脂层析，0.03N氯化钠、0.06N醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液2BV冲洗柱子，0.3N氯化钠、0.06N的醋酸钠、醋酸调节pH6.5-7.0的溶液洗脱，收集色谱纯度大于10％的达托霉素内酯水解物层析液，调节pH4.5，20℃恒温保存24h，得到色谱纯度27％的达托霉素内酯水解物溶液。
达托霉素内酯水解物溶液经制备色谱(流动相为甲醇:0.01％三氟乙酸＝33:77)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)，收集色谱纯度>90％的达托霉素内酯水解物的制备液。
制备液真空冻干，所得固体采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素内酯水解物纯度，其纯度在96％。
本发明采用制备色谱技术提供一种快速简便、成本低廉的制备高纯度达托霉素内酯水解物的工艺技术。其中达托霉素内酯水解物的破坏pH和温度以及制备流动相中甲醇和三氟乙酸溶液比例及三氟乙酸浓度更是高纯度内酯水解物达托霉素制备的关键工艺控制点。虽然本文已经对该发明进行了详尽的描述，但可以理解，在不违背本发明精神和实质的基础上，本领域技术人员可以做一些修改或变动，这些修改或变动均在本发明要求保护的范围之内。