一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法与流程

本发明涉及一种肝细胞的体外培养方法，特别是一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法。
背景技术：
：原代肝细胞不但是构建组织工程化肝脏的理想种子细胞来源，而且也是对药物体外ADME/T性质进行准确评价的重要模型。但肝细胞在传统的体外平面培养过程中极易出现“去分化”，即出现活性的降低，表型的改变以及功能活性（包括合成和代谢活性）的降低甚至完全丧失。研究证实：新鲜分离的人肝细胞在悬浮培养条件下，其P450酶活性仅维持4h；在胶原包被的培养板内，贴壁细胞的P450酶表达量及酶活性在24－48h后便会显著降低。而由于酶功能活性的降低，肝细胞单层培养法在肝毒性药物筛选中的灵敏度仅有50％。因此如何在体外培养中克服或延缓肝细胞的“去分化”现象，从而有效维持肝细胞的理想分化状态，即维持其表型及相关功能一直是肝细胞培养及应用研究中所亟待解决的“瓶颈”问题。技术实现要素：本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种能够理想维持肝细胞生长活性，并显著提高体外培养肝细胞表型及功能活性的新培养方法。本发明的技术解决方案是：一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：采用肝细胞为种子细胞，以多孔蚕丝蛋白支架作为肝细胞体外培养载体，将肝细胞、肝源性间质细胞和细胞外基质按一定比例接种到多孔蚕丝蛋白支架上，并将多孔蚕丝蛋白支架置于模拟肝细胞的体外培养微环境中进行培养，所述的将肝细胞、肝源性间质细胞和细胞外基质按一定比例接种到多孔蚕丝蛋白支架上的具体操作步骤如下：将新鲜分离的肝细胞和肝星形间质细胞按照细胞数3:1的比例混合，并将获得的混合细胞与细胞外基质混合，获得细胞-基质混合物，所述的细胞外基质由胶原和基质胶按照体积比为1:1的比例混合而成，然后将细胞-基质混合物多点接种至多个多孔蚕丝蛋白支架，并保证肝细胞数量为600,000cells/支架，基质胶的体积为30μL/支架，所述的将多孔蚕丝蛋白支架置于模拟肝细胞的体外培养微环境中进行培养的具体操作步骤如下：将接种完成的多孔蚕丝蛋白支架按照1个支架/孔的密度放置到多孔细胞培养板中，并将多孔细胞培养板置于细胞培养箱中，在37℃、5%CO2的条件下凝胶化2h，然后向多孔细胞培养板的每个孔中加入共培养基，所述的共培养基为肝细胞培养基和星形间质细胞培养基按照体积比为1:1的比例混合而成。本发明同现有技术相比，具有如下优点：本发明所公开的肝细胞的体外培养方法，该培养方法利用细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间复杂的相互作用，形成与体内肝细胞类似的微环境，使肝细胞的生长形态更接近体内三维生长模式；它采用多孔丝素蛋白作为培养支架，同时添加胶原和基质胶作为培养基质，构建出一个复合培养体系，该复合培养体系不但能够为肝细胞提供三维生长空间，而且其具有生物相容性、材料可塑性和支持肝细胞生长及组织化的特点，此外，其多孔特征也可大大提高培养体系内的物质传递，从而有利于肝细胞在体外培养过程中维持其活性；多孔蚕丝蛋白支架所特有的生物相容性、机械强度特征及生物降解特性，使得该培养体系易于实现肝细胞体内移植及回收，这不但可推进肝细胞替代治疗，而且还可能为探讨有关肝细胞移植的相关研究提供理想的研究模型体系；该培养方法所建立的模型内，细胞间彼此建立细胞通讯，且可分化形成毛细胆管结构，说明所构建的肝细胞培养体系更具备组织化特征，从而有利于肝细胞在体外培养过程中维持其表型及功能；该方法所建立的培养体系中，肝细胞的白蛋白分泌和尿素合成功能均显著高于平面培养组及“三明治”培养组，更接近在体肝细胞的功能活性，同时该培养体系内肝细胞的代谢酶活性显著高于传统培养方法（平面培养组和“三明治”培养组），更利于对药物代谢活性及肝毒性进行准确的体外评价，从而可能为新药研发提供新的评价工具。附图说明图1为多孔蚕丝蛋白支架的扫描电镜图（A：盐析法制备；B:有机溶剂法制备）。图2为利用活细胞荧光标记方法显示大鼠原代肝细胞（红色）和星形间质细胞（蓝色荧光）在多孔蚕丝蛋白支架上的生长形态（A：3D共培养组；B：对照组）和细胞活性（C）。图3为HE染色显示利用本发明所述方法培养的大鼠肝细胞的形态结构（A1-2：本发明培养组；B：对照组）。图4为扫描电镜（SEM）检测显示大鼠原代肝细胞在多孔蚕丝蛋白支架上的生长形貌及特征（A1-2）；透射电镜（TEM）检测显示大鼠原代肝细胞形成细胞连接（B）。图5为本发明所述方法培养的大鼠肝细胞的白蛋白分泌(A)和尿素合成功能(B)。图6为利用qRT-PCR方法检测本发明所述方法对大鼠原代肝细胞代谢酶基因表达水平的影响图例之一。图7为利用qRT-PCR方法检测本发明所述方法对大鼠原代肝细胞代谢酶基因表达水平的影响图例之二。图8为利用qRT-PCR方法检测本发明所述方法对大鼠原代肝细胞代谢酶基因表达水平的影响图例之三。图9为本发明所述方法对大鼠原代肝细胞代谢酶CYP3A1活性的影响。具体实施方式下面将结合附图说明本发明的具体实施方式。如图1至图7所示：多孔蚕丝蛋白支架的制备：首先制备浓度为6-7%的丝素蛋白溶液，采用盐析-干燥法制备多孔丝素蛋白支架，通过盐颗粒大小控制支架孔径为500-600μm,干燥后充分浸润于去离子水内，然后采用标准打孔器制备直径5mm，厚度3mm的三维支架（即多孔蚕丝蛋白支架）。多孔蚕丝蛋白支架在接种细胞前需经高温高压灭菌处理，且浸泡在培养基内进行预平衡12h。大鼠原代肝细胞的分离培养：大鼠经麻醉后采用胶原酶两步灌流法（0.5mg/ml,型胶原酶）分离获取大鼠（成年，雄性SpragueDawley大鼠）原代肝细胞，经过梯度percoll液分离后进行纯化、富集。通常可获得2×108细胞总量，且活性细胞>90%.新鲜分离的肝细胞培养于William’sE培养基添加0.5U/mL胰岛素(Invitrogen),7ng/mL胰高血糖素(Sigma),7.5μg/mL氢化考地松(Sigma)和1%抗生素(Invitrogen)，大鼠原代肝星形间质细胞购置美国ScienCell，培养于Stellate培养基，细胞生长至近90%融合度时进行1：3常规传代培养，所有细胞均培养于37℃，5%CO2细胞培养箱内。进行大鼠肝细胞的体外培养：以上述步骤中获得的大鼠原代肝细胞为种子细胞，以多孔蚕丝蛋白支架作为肝细胞体外培养载体，将肝细胞、肝源性间质细胞和细胞外基质按一定比例接种到多孔蚕丝蛋白支架上，并将多孔蚕丝蛋白支架置于模拟肝细胞的体外培养微环境中进行培养，将新鲜分离的肝细胞和肝星形间质细胞按照细胞数3:1的比例混合，并将获得的混合细胞与细胞外基质混合，获得细胞-基质混合物，所述的细胞外基质由胶原和基质胶按照体积比为1:1的比例混合而成（所述的胶原和基质胶均选用BDBiosciences的产品），然后将细胞-基质混合物多点接种至多个多孔蚕丝蛋白支架，并保证肝细胞数量为600,000cells/支架，基质胶的体积为30μL/支架，将接种完成的多孔蚕丝蛋白支架按照1个支架/孔的密度放置到多孔细胞培养板中，并将多孔细胞培养板置于细胞培养箱中，在37℃、5%CO2的条件下充分凝胶化2h，然后向多孔细胞培养板的每个孔中缓慢加入共培养基，所述的共培养基为肝细胞培养基和星形间质细胞培养基按照体积比为1:1的比例混合而成，通过上述步骤，构建出肝细胞的三维共培养模型。同批次新鲜分离的大鼠原代肝细胞以相同密度分别直接接种于经胶原包被的24孔板作为对照组1（平面培养组）；同时设定传统三明治培养组为对照组2。建立评价肝细胞三维共培养模型的形态学检测平台：肝细胞生长形态及活性检测：为了更好的观察三维共培养体系内不同细胞，首先采用活细胞标记染料DiI和DiD（Invitrogen）分别标记原代肝细胞和星形间质细胞，培养5天后于激光共聚焦显微镜下直接观察。细胞活性染色采用calcein-AM/EthD-1染色试剂盒(Invitrogen)，37℃孵育2h，其余操作按说明书进行。染色后于激光共聚焦显微镜下观察、拍照。H&E染色：样品收集后经PBS冲洗、4%多聚甲醛室温下固定24h，由形态学中心制备石蜡切片。再依次经过脱蜡、H&E染色以及封片，制备H&E染色切片。正视光学显微镜下观察，拍照。扫描电镜和透射电镜观察：所收集样品经PBS充分清洗后，2.5%戊二醛溶液前固定4-6h，PBS冲洗后，2%锇酸后固定2h，再次PBS充分清洗后，部分样品置于真空干燥箱内干燥过夜。干燥后样品经喷金15min后，于扫描电镜下观察拍照。其余样品送至透射电镜检测中心，经树脂包埋后制备超薄切片，于透射电镜下观察、拍照。建立评价肝细胞三维共培养模型的功能活性检测平台：白蛋白含量测定及尿素合成测定：在培养过程中定期收集各培养组内培养基，-80℃保存后批量测量白蛋白及尿素含量。其中，白蛋白测定采用大鼠白蛋白ELISA试剂盒，尿素合成的测定采用QuantiChrom尿素检测试剂盒。具体操作均依照说明书完成。定量RT-PCR测定代谢酶基因表达：定期收集样品，直接采用TRIZOL裂解细胞，RNAeasy试剂盒(Qiagen).提取总RNA后，采用PrimeScriptTMRT试剂盒和SYBRPremixExTaqTMII试剂盒（TaKaRa）进行定量RT-PCR扩增。依据各目的基因的Ct值及内参基因的Ct值进行定量分析（ABIsmartI），确定各目的基因的表达水平。所扩增基因的引物序列如下：定量RT-PCR检测的引物序列GeneForwardReverserGAPDHCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGGGCCATCCACAGTCTTCTGrCYP1A2CGGTGATTGGCAGAGATCGGGTCCCTCGTTGTGCTGTGGrCYP2B1CTCCAAAAACCTCCAGGAAATCCTCGTGGATAACTGCATCAGTGTATGGCrCYP3A1GAGGAGTAATTTGCTGACAGAACCTGCCCAGGAATCCCCTGTTTCTTGAAr:Rat-specificprimer肝细胞代谢酶活性测定：于培养第6天，更换无血清培养基，并加入50μM睾酮，37℃孵育4h后收集培养基，4℃离心（12000rpm，10min）后收集上清液保存至-80℃冰箱。带样品收集结束后，采用HPLC方法进行检测CYP3A代谢产物6β羟基睾丸酮的水平（检测条件：A(methanol):B(water)=52:48,0-15min,B48-30,15-20min30-20,UV254nm）。结果：1.肝细胞生长形态及活性：如图2所示，在多孔蚕丝蛋白支架上原代肝细胞生长状态良好，细胞活性染色显示大部分细胞均为绿色荧光，说明其活性理想。仅有少量细胞死亡，显示红色荧光。细胞标记图片提示，肝细胞在三维共培养体系呈现聚团生长模式，且易于与星形间质细胞彼此聚合成团；而对照组细胞较为分散，未见细胞彼此聚合成团现象。分析肝细胞聚合成团有理由肝细胞在体外培养过程更好的维持其表型及功能。2.H&E染色（图3）结果进一步证明肝细胞团的形成及形态特征。可见：大部分肝细胞与星形间质细胞在多孔蚕丝蛋白支架上聚团生长。其中，肝细胞呈现多角形，可见单核或双核，而星形间质细胞分布于肝细胞团内，二者紧密聚合在一起，支持两种细胞间可能存在细胞-细胞间相互作用。3.如图4所示，扫描电镜结果显示肝细胞紧密生长于多孔蚕丝蛋白支架表面及三维孔隙，细胞形态规则，且分泌大量的细胞外基质。彼此间相互连接，形成类组织化的表观形貌特征。透色电镜分析进一步显示肝细胞与肝细胞之间能够建立细胞紧密连接,彼此间存在交流，呈现“类组织化”特征。这些都支持肝细胞在体外培养过程中的良好活性、组织化特征以及理想表型。如图5所示，肝细胞白蛋白分泌及尿素合成检测结果表明：与对照组比较，基于丝蛋白支架的三维共培养组内肝细胞能够分泌较高水平的白蛋白；此外其尿素合成水平也比对照组有显著提高（P<0.05）。该结果说明，原代肝细胞在该培养体系下能够维持理想的合成功能活性。肝细胞代谢酶表达水平的评价及酶活性测定：肝细胞代谢酶的改变是对肝细胞代谢功能进行评价的重要指标。如图6、7、8、9所示，经三维共培养后大鼠原代肝细胞的多种细胞色素代谢酶基因表水平显著高于对照组，且通过特异性底物代谢分析发现：与对照培养组比较，三维培养体系内肝细胞对睾酮的代谢提高，证明其CYP3A的代谢活性在该培养体系内也能够理想维持，从而为肝细胞的理想功能提供了有一实验论据。当前第1页1 2 3