金藻及其培养方法与流程

本申请涉及微藻工业应用领域，具体而言，涉及一株新分离的金藻，即poterioochromonasmalhamensiscmbb-01株，及其培养方法。
背景技术：
：金藻亦称金褐藻，多数分布在淡水，在海水中也有分布。金藻的细胞中含有丰富的营养，其中金藻昆布糖是其细胞的储能物质，它具有广泛的生物学活性，对痛风、高血脂、早中期肾衰竭有一定的防治作用。同时，金藻还是一种很好的鱼类饵料，在养殖业有广泛的用途。此外，有研究表明金藻能够有效地吞噬包括铜绿微囊藻在内的多种水华藻，因此在水体富营养化治理上也有潜在用途。传统的金藻自养培养方法主要依靠金藻的光合作用，金藻生长十分缓慢。此外，目前已知的金藻物种和藻株也不适合于大规模工业化培养。缺乏易于培养的金藻藻株和相应的培养方法是发展藻类工业所亟待解决的问题。鉴于金藻在医药、环保、养殖等领域的巨大经济价值，需要一种易于生长，适用于工业化培养的金藻，以及培养其的方法。技术实现要素：本发明涉及从自然环境中分离到的一种新的金藻藻株，经鉴定分类命名为p.malhamensiscmbb-01株。研究表明该金藻藻株能够快速生长，易于大规模培养。一方面，本发明涉及一种金藻p.malhamensiscmbb-01株，其以保藏号cgmccno.11620保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。另一方面，本发明涉及一种培养本发明的金藻的方法，包括将谷物的去麸谷粒作为金藻生长的营养源加入用于培养金藻的含水的体系中，其中所述谷物选自以下组中的一种或多种：水稻、小麦、小米、黑米、燕麦、荞麦、薏仁米和高粱，优选水稻和小麦。在一个实施方式中，所述方法进一步包括在金藻培养体系中加入以下营养盐及维生素：nano3、kh2po4、k2hpo4、维生素b6和维生素b12。在一个实施方式中，所述含水的体系中添加的谷粒的量为1-50g/l，更优选5-15g/l，以谷粒的干重计。在一个实施方式中，当谷物为水稻时，所添加的量为12.5-50g/l。在一个实施方式中，当谷物为小麦时，所添加的量为5-10g/l。在一个实施方式中，每1l含水的体系中营养盐及维生素的添加量为：nano3:140mg、kh2po4:10mg、k2hpo4:5mg、维生素b6:1μg和维生素b12:1μg。在一个实施方式中，所述培养在20-28℃、优选22-25℃的温度，50-100μmolphotons·m-2·s-1、优选50μmolphotons·m-2·s-1的光强度，和6.0-8.5的ph下进行。本发明分离的金藻藻株易于培养、生长迅速，且所含的金藻昆布糖含量很高。本发明所用的培养方法简单，培养所用原料价格便宜，培养成本大幅度降低。同时，培养体系是建立在无菌条件下的，非常适合在大规模体系中推广利用。附图说明图1a：本发明金藻在光学显微镜下照片。图1b：本发明金藻在电子扫描显微镜下的照片。图2：本发明金藻rbcl基因在ncbi数据库进行blast的结果。图3：本发明金藻18srdna基因在ncbi数据库进行blast的结果。图4：本发明金藻在使用去麸的水稻粒作为营养源的条件下的生长情况。图5：本发明金藻在使用去麸的小麦粒作为营养源的条件下的生长情况。图6：本发明金藻在使用去麸的小麦粒、营养盐和维生素作为营养源的条件下的生长情况。图7：本发明金藻在不同光照条件下的生长曲线。具体实施方式本发明人从自然环境中意外地分离到一株新的金藻，即cmbb-01株。形态学和分子生物学鉴定显示其属于金藻纲(chrysophyceae)中的物种。本发明人发现cmbb-01株具有优异的生长性能和很高的金藻昆布糖含量。因此，第一方面，本发明提供了一种金藻poterioochromonasmalhamensiscmbb-01株，其以保藏号cgmccno.11620于2015年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)。本发明人进一步发现，在含水的体系中，使用去麸的谷粒作为此金藻藻株的营养源，可选地辅以适当的营养盐及维生素，此金藻藻株可以在短时间内大量生长，生物量大幅度提高。因此，第二方面，本发明还提供了一种培养本发明所分离的金藻藻株的方法，包括将谷物的去麸谷粒作为金藻生长的营养源加入到用于培养金藻的含水的体系中。术语“谷物的谷粒”主要是指禾本科植物的种子，例如谷物可以是水稻、小麦、小米、黑米、荞麦、燕麦、薏仁米和高粱。在一个实施方式中，本发明所用的谷物选自以下组中的一种或多种：水稻、小麦、小米、黑米、燕麦、荞麦、薏仁米和高粱。图4和图5分别显示了金藻在使用去麸的水稻粒和小麦粒作为培养基的条件下的生长情况。结果显示，在使用去麸的水稻粒和小麦粒作为培养基的条件下，本发明的金藻均可以快速生长。因此，在一个实施方式中，本发明所用的谷物为水稻或小麦，优选小麦。术语“培养金藻的体系”是指培养金藻时金藻所处的体系。用于培养金藻的体系包含水，例如天然环境中的净水，蒸馏水或自来水(优选经过充分暴晒的自来水)作为培养介质。培养金藻的体系可以为具有一定体积的容器，例如培养罐、培养箱等。培养金藻的体系也可以为封闭式水域例如池塘或开放式水域，例如河流。培养金藻的体系的体积可以根据待培养的金藻的量确定。图4和图5还分别示出了金藻在使用不同添加量的去麸的水稻粒和小麦粒下的生长情况。结果提示，可以通过优化水稻粒和小麦粒添加量来进一步促进金藻的生长。在一个实施方式中，本发明所用的谷粒添加量为1-50g/l，优选12.5-50g/l，更优选25-50g/l，或优选1-10g/l，更优选5-10g/l，以谷粒的干重计。在一个实施方式中，将去麸的小麦粒以5-10g/l的添加量加入到用于培养金藻的含水的体系中。在一个实施方式中，将去麸的水稻粒以12.5-50g/l的添加量加入到用于培养金藻的含水的体系中。图6示出了金藻在小麦粒和小麦粒+营养盐+维生素培养下的生长情况。在一个实施方式中，本发明的培养方法进一步包括在培养金藻的体系中加入以下营养盐及维生素：nano3、kh2po4、k2hpo4、维生素b6和维生素b12。在一个实施方式中，每1l含水的体系中营养盐及维生素的添加量为：nano3:140mg、kh2po4:10mg、k2hpo4:5mg、维生素b6:1μg和维生素b12:1μg。本发明还研究了光照对金藻生长的影响。如图7所示，即使在没有光照的条件下，本发明的金藻藻株也可在小麦粒+营养盐+维生素的培养条件下快速生长。这表示本发明的金藻藻株的生长性能十分优异。在一个实施方式中，本发明的金藻在正常光照条件下培养。在一个实施方式中，光照的光强度为50-100μmolphotons·m-2·s-1，优选50μmolphotons·m-2·s-1。本发明的金藻培养方法可以在室外环境温度下进行。在一个实施方式中，本发明的金藻可以在20-28℃下培养，优选22-25℃，更优选22±2℃。在一个实施方式中，本发明的金藻在ph为6.0-8.5的培养基中培养，优选ph为6.0-7.5。实施例将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，提供以下实施例仅用于解释本发明，不应被理解为是对本发明的范围和精神的限制。实验材料：金藻p.malhamensiscmbb-01株，由中国科学院水生生物研究所分离获得，以保藏号cgmccno.11620保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。实施例1.金藻cmbb-01株的分离及鉴定1.cmbb-01株的分离与纯化包含本发明藻株藻液来自自然环境水体，采用逐级稀释法进一步分离，获得纯的藻株，对其编号命名为cmbb-01株。2.cmbb-01株的形态学鉴定分别采用光学显微镜(olypus，bx53，400倍)和电子扫描显微镜(sem)观察其形态结构特征。如图1a和1b所示，cmbb-01株的细胞直径大小在5-10μm，含两条大小不等的鞭毛，长鞭毛长10-15μm，短鞭毛长2-3μm，电子扫描显微镜可见长鞭毛有绒毛，绒毛长1-1.5μm，短鞭毛无绒毛；cmbb-01株的细胞包含周生色素体，呈黄色或金褐色。cmbb-01株属于混合营养型，可在无机盐培养基中通过光合作用自养生长，利用有机物进行化能异养，也可吞噬小球藻进行吞噬营养。根据《中国淡水藻类》和《原生动物》等资料初步鉴定cmbb-01株为金藻门(chrysophyta)色金藻目(chromulinales)锥囊藻科(dinobryonaceae)的物种。3.分子生物学鉴定提取cmbb-01株的基因组dna，采用两种不同引物分别扩增其18srdna和rbcl基因序列，所用引物序列为：18srdna基因：引物f5’-aacctggttgatcctgccagt-3’(seqidno:1)18srdna基因：引物r5’-tgatccttctgcaggttcacctac-3’(seqidno:2)rbcl基因：引物f5’-cagtagtatggacag-3’(seqidno:3)rbcl基因：引物r5’-ccaactacagttccagc-3’(seqidno:4)扩增产物用1％琼脂糖电泳，试剂盒(omega，usa)回收pcr产物，胶回收产物直接送至公司测序(上海生工生物工程有限公司)。cmbb-01株18srdna基因序列和rbcl基因序列分别如seqidno:5和seqidno:6所示。图2和图3分别显示上述rbcl基因序列和18srdna基因序列在genbank中比对的结果。如图2和图3所示，从rbcl基因和18srdna基因比对结果可知，cmbb-01株的进化距离与p.malhamensis最为接近。综合形态学和分子序列信息，确定cmbb-01株为金藻，命名为p.malhamensiscmbb-01株。实施例2.不同营养源条件下cmbb-01株生长性能的测定2.1.采用去麸的水稻粒作为营养源采用去麸的水稻粒作为本发明金藻藻株的营养源来培养金藻。同时，为了研究不同量的水稻粒对金藻生长的影响，在相同培养体系中分别添加不同量的水稻粒，设置具有五个不同添加量的水稻粒的组：0.25g/l、2.5g/l、12.5g/l、25g/l和50g/l。每个组设置4个重复。为保证金藻不完全沉底，每天摇瓶四次。每天定时采样，并利用血球计数板计数。每个样品统计2次，取四个重复样品的平均值作为最终值。金藻初始密度为1.78×104个/ml。培养温度为(22±2)℃，且光照强度为50μmolphotons·m-2·s-1。整个实验期间保持ph在6.0-7.5之间。从图4可知，本发明金藻藻株在仅使用去麸的水稻粒培养下即可快速生长。特别地，当水稻粒使用添加量为12.5g/l、25g/l和50g/l时，金藻密度在培养第2天时就可以达到106个/ml，在第3-4天时便可以继续增加至107个/ml，且随后还可缓慢增加。2.2.采用去麸的小麦粒作为营养源采用去麸的小麦粒作为本发明金藻藻株的营养源来培养金藻。同时，为了研究不同量的小麦粒对金藻生长的影响，在相同培养体系中分别添加不同量的小麦粒，设置具有六个不同添加量的小麦粒的组：1g/l、2.5g/l、5g/l、10g/l、20g/l和40g/l。其余实验条件和方法同前述2.1部分。从图5可知，本发明金藻藻株在仅使用去麸的小麦粒培养下同样能够快速生长。特别地，在2.5g/l、5g/l和10g/l组中，金藻密度在培养第2天时就可以达到106个/ml，在培养3天时10g/l组显示出最高的金藻密度，约107个/ml，且随后还可缓慢增加。令人意外地，与添加更多营养物可能会得到更高金藻密度的预期相反，实验证实在培养2天后，在初始高添加量的小麦粒的组中(如20g/l和40g/l组)的金藻密度令人惊奇地低于在初始较低添加量的小麦粒的组中(如1g/l、2.5g/l、5g/l和10g/l组)的金藻密度。2.3.采用去麸的小麦粒+营养盐+维生素作为营养源小麦粒+营养盐+维生素培养基通过在每升水中加入140mgnano3、10mgkh2po4、5mgk2hpo4、1μg维生素b6、1μg维生素b12，同时加入5g小麦制备。金藻初始密度为2.27×104个/ml。其余实验条件和方法同前述2.1部分。从图6可知，对比采用去麸的小麦粒作为营养源和采用去麸的小麦粒+营养盐+维生素作为营养源这两种培养条件，结果显示两种条件下本发明金藻株的生长情况类似，营养盐和维生素的添加对本发明金藻的生长仅具有一定的促进作用。2.4.采用现有技术的方法来培养cmbb-01株cn101353626b公开了一种金藻(即poterioochromonassp.zx1，保藏号为cgmccno.2262)，以及可以采用水柳、香蒲和芦苇三种植物的浸提液来培养金藻的方法。为了进一步测试本发明的金藻藻株的生长性能，采用上述文献中公开的方法对本发明的金藻进行培养，并随后对以下参数进行测试：金藻的最大生长速率、能达到的最大的金藻密度和达到最大金藻密度所需要的时间。实验组1采用上述实施例2.3部分的小麦粒、营养盐和维生素作为培养基成分来培养本发明的金藻。实验组2采用水柳、香蒲和芦苇三种植物的浸提液来培养本发明的金藻。培养开始时各个实验组的金藻的初始密度保持相同。其余实验条件和方法同前述2.1部分。测试结果如下：表1本发明与现有培养技术的比较项目实验组1实验组2最大生长速率(d-1)1.720.92最大生物量(个/ml)2×1072×106到达最大生物量所需要的时间3-4天4-5天从表1中实验组2的数据可知，即使采用不同培养方法，本发明所分离的金藻藻株仍旧能够在短时间内达到很高的生长密度(数量级达到106个/ml)，这提示本发明的金藻藻株具有优异的生长性能。而且，相比于上述文献的方法，采用水稻粒、小麦粒以及小麦粒+营养盐+维生素作为营养源来进行培养本发明的金藻藻株的方法更加简便，培养成本大幅度降低。上述结果均表明，本发明所分离的新的金藻藻株具有很好的生长性能，可实现短时间内大量的增殖。而且，培养此藻株的工艺十分简单，无需严格的培养条件，所需原料来源广泛且价格低廉。这些都使得本发明的金藻藻株能够适用于大规模培养应用。实施例3.光照对cmbb-01株生长的影响为研究光照对本发明金藻生长的影响，在培养本发明金藻时设置光照组1(50μmolphotons·m-2·s-1)、光照组2(100μmolphotons·m-2·s-1)和完全黑暗组(0μmolphotons·m-2·s-1)。每组均采用上述实施例2.3部分的小麦粒+营养盐+维生素作为营养源。其余实验条件和方法同前述2.1部分。如图7所示，即使在没有光照的条件下，本发明的金藻藻株通过采用小麦粒+营养盐+维生素作为营养源，其在培养3天时密度也可达到106个/ml。这提示本发明的金藻藻株的生长性能十分优异。从培养2天时起，在有光的条件下，金藻密度更是会不断增加。令人意外地，对于此金藻藻株，实验发现当光强从50μmolphotons·m-2·s-1增加至100μmolphotons·m-2·s-1时，其生长效率并未出现显著变化。实施例4.cmbb-01株中金藻昆布糖提取及含量测定将按照实施例2.3培养收获的藻液通过过滤除杂去除其中所含的杂质，获得纯净的cmbb-01株的收获液放置在冷冻干燥机中干燥4-5天，取干燥后的藻粉1g置于200ml烧杯中，加100ml蒸馏水溶解，90℃水浴1h，5000g离心20min，用多层纱布滤过上清液，并将上清液通过滤纸抽滤。在过滤得到的上清液中加入4倍体积95％乙醇，沉淀多糖，离心(5000g，20min)收集沉淀。将沉淀物在烘箱中干燥(75℃，24h)，获得的海腥味白色块状物即为粗金藻昆布糖干品，计算金藻昆布糖得率。昆布多糖得率(％)＝[粗多糖干品质量(g)/藻粉质量(g)]×100％通过计算可知，cmbb-01株中昆布多糖含量高达24.8％，明显高于其他金藻或海带中昆布多糖含量，与真眼点藻中昆布多糖含量相当。表2cmbb-01株与其他藻类中昆布多糖含量比较物种昆布多糖收率参见cmbb-01株24.8％球等鞭金藻7％-22.1％浦寅芳等，食品科技,2012(7):186-190.真眼点藻13.01％-24.88％韩娟，暨南大学,2013.海带1％-18.31％康琰琰等，食品研究与开发,2006,27(1):59-62.尽管已用于解释说明的目的公开了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员可理解，可做出各种改变、增添和替换，而不脱离如后附权利要求所公开的本发明的范围和精神。当前第1页12