本发明涉及生物技术领域，尤其是用转基因微生物特别是大肠杆菌(E.coli)，用蔗糖作为其专用碳源的重组寡糖、特别是人乳寡糖(HMO)的微生物制备。
背景技术：
近来，使用重组微生物的异种(foreign)或外源寡糖的发酵合成在商业和工业上已经变得备受关注。在这种合成中，目的寡糖将通过由微生物的一种或多种异源糖基转移酶介导的糖受体的酶促糖基化来合成，并且糖基化所需的一种或多种活化的糖核苷酸将由相同的微生物通过过表达一种或多种编码内源活化的糖核苷酸产生酶的基因来制备。这种合成的代谢路径需要碳源，其主要为简单的碳结构单元，通常为甘油或葡萄糖(参见，例如，WO01/04341，Priem等人的Glycobiology12,235(2002)，Fort等人的Chem.Comm.2558(2005)，Drouillard等人的Angew.Chem.Int.Ed.45,1778(2006)，WO2010/070104，WO2012/112777，WO2013/182206，WO2014/048439)。在一些合成中，如果乳糖也用作受体，则其可以是碳源(Lee等人的Microb.Cell Fact.11：48(2012))。由于微生物已经经过基因操作，抗生素抗性选择标记基因已经采用，以将转化的微生物与接种物和发酵液中未转化的微生物分开。然而，通过将编码参与供体糖的重新(de novo)生物合成的酶的基因整合进微生物的染色体中，已经避免了抗生素的使用(等人的Microb.Cell Fact.12：40(2013))。
大约50％的野生型大肠杆菌能够采用蔗糖作为碳源和能量来源，但是它们中的大多数是致病的。在工业中合成化学物质主要使用的大肠杆菌菌株无法在蔗糖上存活和生长(Bruschi等人，Biotechnol.Adv.30，1001(2012))。然而，在某些情况下，蔗糖可以是更廉价的碳源和能量来源。出于这个原因，已经在尝试开发能够在蔗糖上存活并生长的大肠杆菌的suc+菌株(例如，Sabri等人的Appl.Environ.Microbiol 79，478(2013))并且通过它们来制备工业上可获利的产品，比如氨基酸、生物燃料、类胡萝卜素等(例如，EP-A-1149911，EP-A-2239336，EP-A-2371952，EP-A-2405006，WO2010/051849，WO2012/078311，Kim等人的Biores.Technol.130，288(2013))进行了尝试。然而，这些suc+转化株通常没有suc—菌株多产(Khamduang等人的J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36，1267(2009))。
WO2012/007481描述了表达蔗糖磷酸化酶或蔗糖转化酶与果糖激酶联合的大肠杆菌转化株。从而，微生物能够采用蔗糖作为其主要碳源产生2’-岩藻糖基乳糖。而且，WO2014/067696描述了包含能够使其在蔗糖上生长并产生岩藻糖的csc基因簇的大肠杆菌转化株。
然而，一直需要使用能够采用更有效的蔗糖作为碳源和能量来源的转化微生物，用于制造重组寡糖、特别是HMO的替代方法。
技术实现要素：
本发明的第一方面涉及通过使碳水化合物受体糖基化来制备重组寡糖、优选3～8个单糖单元的重组寡糖、更优选3～5个单糖单元的重组寡糖、特别是HMO的方法，所述碳水化合物受体优选为乳糖，并且不是蔗糖，所述方法包括以下步骤：
a)提供一种细胞，优选为大肠杆菌细胞，其能够使所述受体内化至所述细胞，并且其包含
-编码糖基转移酶的重组基因，所述糖基转移酶能够使活化的糖核苷酸的糖残基转移至在所述细胞中内化的受体，和
-在所述细胞中制造所述活化的糖核苷酸的生物合成路径，
b)在所述受体和蔗糖的存在下培养所述细胞，以及
c)从所述细胞、培养基或二者中分离所述寡糖，
所述方法特征在于所述细胞还包含一种或多种编码蔗糖利用系统、优选编码异源蔗糖利用系统、更优选编码异源PTS-依赖性蔗糖利用转运系统的基因，更优选scr基因，由此所述细胞能够使用蔗糖作为碳源、优选作为主要碳源、更优选作为唯一的碳源，用于制造所述活化的糖核苷酸，以及作为能量来源、优选作为主要能量来源、更优选作为唯一能量来源，用于制造所述寡糖。
本发明的第二方面涉及优选为大肠杆菌细胞的细胞，其能够使碳水化合物受体内化至所述细胞，所述碳水化合物受体优选为乳糖，并且不是蔗糖，所述方法包括：
-编码糖基转移酶的重组基因，所述糖基转移酶能够使活化的糖核苷酸的糖残基转移至在所述细胞中内化的受体，
-在所述细胞中制造所述活化的糖核苷酸的生物合成途径，和
-一种或多种编码蔗糖利用系统、优选编码异源蔗糖利用系统的基因，更优选scr基因，由此所述细胞能够使用蔗糖作为碳源，优选作为主要碳源，更优选作为唯一碳源。
附图说明
附图意在对本发明进行进一步说明，而不意在限制本发明的主题。
改造的微生物是完全代谢活性的细胞，其中生长和寡糖的合成可以同时进行。该细胞包含异源PTS-依赖性蔗糖利用转运系统，该系统包括蔗糖特异性孔蛋白(促进蔗糖通过外膜的扩散)、蔗糖转运蛋白(由细胞外蔗糖提供细胞内蔗糖-6-磷酸)和蔗糖-6-磷酸水解酶(提供葡萄糖-6-磷酸和果糖)。通过有机体自身的代谢系统，葡萄糖-6-磷酸和果糖的氧化提供了生物能量来源。另外，葡萄糖-6-磷酸和果糖作为碳源，用于在细胞的天然生物合成路径中制备糖核苷酸。如此制备出的糖核苷酸是用于使由细胞通过特异性透性酶而内化的碳水化合物受体(例如乳糖)糖基化的供体，从而制备出目的寡糖。糖基化由一种或多种糖基转移酶介导，所述糖基转移酶通过表达异源基因而直接制备。有机体缺乏任何使细胞中的受体或者寡糖产物降解的酶。
具体实施方式
令人惊奇地发现，外源单糖或二糖受体，优选乳糖，能够通过涉及微生物透性酶的转运机制而在合适的转基因微生物中，特别是大肠杆菌中内化，在微生物中，使用蔗糖作为其碳源和能量来源，能够使碳水化合物受体糖基化，并且能够以良好的产率制备和分离外源寡糖。从而，可以得到一种有效、价廉且易于扩大的用于制备寡糖的方法。为了使该方法获得成功，需要特殊的制备寡糖的微生物，所述微生物能够在蔗糖上生存、利用蔗糖用于糖基化所必需的核苷酸糖供体的代谢合成、能够使简单的碳水化合物受体内化并且对它们进行糖基化反应以合成更复杂的寡糖。
因此，本发明第一方面涉及一种通过以下步骤制造寡糖的方法：
a)提供一种微生物细胞，优选大肠杆菌细胞，其能够使蔗糖和碳水化合物受体，优选乳糖，内化至所述细胞，并且其包含：
-编码糖基转移酶的重组基因，所述糖基转移酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至细胞中的受体，和
-用于从蔗糖制造活化的糖核苷酸的生物合成路径，
b)在受体和蔗糖的存在下，在含水培养基中培养细胞，以及
c)从细胞、从培养基或从二者中分离寡糖产物。
该方法特征在于细胞以一种或多种编码蔗糖利用系统的异种基因转化，所述蔗糖利用系统允许细胞使用蔗糖作为碳源、优选作为主要碳源、更优选作为唯一碳源，用于通过细胞进行活化的糖核苷酸的生物合成。细胞以之转化的蔗糖利用系统，还优选允许细胞使用蔗糖作为能量来源、优选作为主要能量来源、更优选作为唯一能量来源，用于寡糖的生物合成。
根据本发明，术语“碳水化合物受体”或“受体”优选表示除了蔗糖及其糖苷之外的单糖或二糖。单糖受体或者二糖受体的单糖部分包括任意5～6个碳原子的糖部分，其为醛糖(例如，D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖等)、酮糖(例如，D-果糖、D-山梨糖、D-塔格糖等)、脱氧糖(例如，L-鼠李糖、L-岩藻糖等)或者脱氧氨基糖(例如，N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺等)。在糖苷型碳水化合物受体中，糖部分通过共价键或者连接键(linker)连接至非糖残基(苷元)，所述共价键是糖残基的糖苷碳原子与非糖部分的任意原子之间的直接链接，所述连接键由一个、两个、三个或四个以下原子组成：如-O-、-C-、-NH-、-N(OH)-、-S-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝NH)-、-C(＝N-OH)-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝NH)-O-、-O-C(＝NH)-、-C(＝S)-NH-、-NH-C(＝S)-、-C(＝NH)-S-和-S-C(＝NH)-。因此，单糖或二糖残基还原端处的C-1(在醛糖的情况下)或C-2(在酮糖的情况下)异头碳原子与非糖部分通过共价键或者形成O-、N-、S-或C-糖苷的连接键相连。优选地，这些具有或不具有连接键的糖苷衍生物的苷元为下组的一种：
a)-ORA，其中RA为直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子(如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正己基等)，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子(如乙烯基、烯丙基、炔丙基等)，或者RA表示芳基部分(同芳香族基团如苯基或萘基)，或者RA表示可通过氢解作用除去的基团，即与氧键接的基团能够在催化量的钯、雷尼镍(Raney nickel)或其他已知适用于氢解的金属催化剂的存在下通过氢加成而切除，结果使OH基团再生；这样的保护基团是本领域技术人员已知的，并在Protective Groups in Organic Synthesis,PGM Wuts and TW Greene,John Wiley&Sons 2007中进行了讨论。合适的基团包括苯甲基、二苯基甲基(二苯甲基)、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基(三苯甲基)基团。上述任意RA基团可任选地被选自以下基团的一种或多种取代：烷基(仅用于芳基和可通过氢解除去的基团)、羟基、烷氧基、羧基、氧代、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酸基、芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基氨基、芳基羰基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基、氨基甲酰基、单烷基氨基羰基和二烷基氨基羰基、烷基羰基氨基、氰基、烷酰氧基、硝基、烷硫基和卤素；在可通过氢解除去的基团的情况下，如果存在这样的取代，优选在芳环上；
b)-X-RB，其中X为N或S，并且RB表示直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子(如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正己基等)，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子(如乙烯基、烯丙基、炔丙基等)。或者RB表示芳基部分(同芳香族基团如苯基或萘基)，或者RB表示苯甲基基团。上述任意RB基团可任选地被选自以下基团的一种或多种取代：烷基(仅用于芳基和苯甲基)、羟基、烷氧基、羧基、氧代、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酸基、芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基氨基、芳基羰基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基、氨基甲酰基、单烷基氨基羰基或二烷基氨基羰基、烷基羰基氨基、氰基、烷酰氧基、硝基、烷硫基和卤素；
c)将异头碳原子与相邻碳原子通过-NH-C(＝O)-O-桥彼此连接的基团，从而形成如下醛糖的情况所示的稠合五元环：
d)叠氮化物；
e)-NH-C(R”)＝C(R’)2，其中每个R’独立地表示吸电子基团，其选自-CN、-COOH、-COO-烷基、-CO-烷基、-CONH2、-CONH-烷基和-CON(烷基)2，或者其中两个R’基团连接在一起形成-CO-(CH2)2-4-CO-，并因此与其连接的碳原子形成5～7元的环烷基-1,3-二酮，所述二酮中任意的亚甲基基团任选地被1或2个烷基基团取代，并且其中R”为H或烷基；
f)氨基酸残基，其为任何天然或非天然的氨基酸，即具有至少一个氨基基团作为取代基的链烷酸衍生物。优选地，氨基酸选自：如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、羟基脯氨酸、α-甲基丝氨酸、β-丙氨酸等的α-氨基酸和β-氨基酸。这些氨基酸可以直接或者通过如上所述的连接键(例如，用于脲连接的糖肽，参见WO 2009/040363)连接到碳水化合物的C-1(在醛糖的情况下)或C-2(在酮糖的情况下)异头碳原子上，从而形成O-、N-、S-或C-糖苷。O-糖苷(O-多糖)能通过涉及含有OH-的氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、羟基脯氨酸等形成，N-糖苷(N-多糖)能用任意氨基酸的α-、β-等氨基基团或者例如赖氨酸、天门冬酰胺或谷氨酰胺的侧链的额外的氨基制得，S-糖苷能用半胱氨酸制得，而C-糖苷(C-多糖)包含将氨基酸的C原子与寡糖部分非还原端的异头碳原子耦联的C-C键；
g)聚乙二醇残基。聚乙二醇(PEG)是分子式为C2nH4n+2On+1的水溶性聚醚，其具有氧乙烯(-CH2-O-CH2-或CH2-CH2-O-)重复单元，且其中n为2～100、优选2～50、特别是2～25、更特别是2～10。较低分子量的PEG可以以纯化形式使用，指作为“单分散性PEG”，也可以作为PEG的混合物使用，指作为“多分散性PEG”。就其几何形状而言，PEG可以是直链、支链、星型或梳型构造的。直链PEG优选为较低分子量PEG(即，n为2～10、优选3～6)。支链PEG优选具有3～10个直链的、优选低分子量的、从中心核基团发出的PEG链。星型PEG优选具有10～100个直链或支链的、优选低分子量的、从中心核基团发出的PEG链。梳型PEG具有多个直链、支链和/或星型的、优选低分子量的、与聚合物骨架相连的PEG链。PEG的末端伯羟基可以通过醚键与烷基基团、优选甲基相连。此外，它们的末端羟基基团可以被氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、巯基或烷硫基所代替，或者它们的末端羟基基团可以被氧化成羧基，其可以被酯化或以氨或伯胺或仲胺的酰胺形式存在。该连接为类似于糖苷的键；
h)聚乙烯醇残基。聚乙烯醇(PVA)是分子式为(C2H4O)x的水溶性聚合物，具有-CH2-CH(OH)-的单体单元。当连接至碳水化合物时，任意OH-基团可以被糖基化；
i)式A的α,β-不饱和酰胺基团
其中Q1、Q2、Q3和Q4独立地为H和C1-C6烷基，其中烷基可任选地被卤素、OH、硝基或苯基基团取代。式A的残基通过其N原子以共价键连接至糖，优选连接至N-糖苷形式的碳水化合物的异头碳原子；或者
j)式B的α,β-不饱和羰基基团
其中Q1、Q2和Q3如式A的残基所定义。
优选地，碳水化合物受体为半乳糖基二糖、特别是乳糖。
此外，根据本发明，术语“寡糖产物”或“寡糖”优选表示如上所述的碳水化合物受体的糖基化衍生物，其中糖残基通过内糖苷键合连接至碳水化合物受体的碳水化合物部分。优选地，寡糖产物为3～8个单糖单元的寡糖、特别是3～5个单糖单元的寡糖。本发明的寡糖产物为重组产物，即，其通过转基因微生物制得，并且对该微生物来说是异体或异源的。
进一步根据本发明，术语“微生物”或“细胞”优选表示一种微生物细胞，特别是大肠杆菌细胞，其中在其DNA序列中存在至少一种替换(alternation)。该替换可以导致野生型细胞的原始特性的改变，例如，由于引入的新遗传物质，其编码不在野生型细胞中的酶的表达，改造的细胞能够进行额外的化学转化，或者由于基因的移除(敲除)无法进行像降解这样的转化。转基因细胞可以以常规方式通过本领域技术人员熟知的基因工程技术制备。
用于本发明方法中的转基因微生物或细胞选自细菌或酵母，优选细菌。细菌优选为选自以下者：大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜热链球菌(Thermophilus aquaticus)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitis)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳酸菌属(Lactococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus spp.)、Micromomospora spp.、微球菌属(Micrococcus spp.)、红球菌属(Rhodococcus spp.)、假单胞菌(Peudomonas)，其中优选大肠杆菌。
本发明的方法还涉及将外源碳水化合物受体、优选乳酸转运至用于糖基化的转基因微生物中，以制备异体目的寡糖，优选不会不利地影响细胞的基本功能或者破坏其完整性的寡糖。在一个实施方式中，转运通过被动机制发生，在这期间外源受体被动地扩散穿过细胞的质膜。受体进入微生物的扩散是发酵液与细胞的胞外和胞内空间之间相对于受体浓度差异的作用，借此受体从高浓度区转移至低浓度区。在另一个实施方式中，受体在主动转运的帮助下被内化。在此情况下，转基因微生物包含转运子蛋白、所谓的透性酶，其起到酶的作用，借此，微生物能够允许外源物质进入并在使其集中在细胞质中。特别地，乳糖透性酶(LacY)特异性作用于半乳糖、简单的半乳糖基二糖比如乳糖及其糖苷。对要被内化的外源碳水化合物受体的糖部分的特异性，可以通过常规重组DNA操作技术手段对微生物进行突变而改变。在优选的实施方式中，外源乳糖或其衍生物的内化经由乳糖透性酶介导的主动转运机制发生。转基因微生物优选缺乏任何可能使受体降解的酶活性(如LacZ)。同样，微生物无法使寡糖产物水解或降解。
而且，在发明的方法中使用的转基因细胞包含一种或多种外源或重组的基因，所述基因编码一种或多种能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至内化的受体的糖基转移酶。如果该基因或者其等同的DNA序列是重组的，则能够通过常规技术例如使用表达载体或者通过染色体整合被引入细胞中。异源核酸序列的来源可以是任何动物(包括人类)或植物、真核细胞比如那些来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candida albican)或者来自藻类的那些、原核细胞比如源自大肠杆菌、脆弱拟杆菌(Bacterioides fragilis)、发光杆菌属(Photobacterium sp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜热链球菌(Thermophilus aquaticus)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的那些、或者病毒。糖基转移酶或者通过基因或等同的DNA序列编码的蛋白质表达的酶优选为葡萄糖基转移酶、半乳糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、N-乙酰半乳糖胺基转移酶、葡糖醛酸基转移酶、木糖基转移酶、甘露糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸基转移酶等。在优选的实施方式中，糖基转移酶选自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基-转移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基-转移酶、β-1,3-半乳糖基-转移酶、β-1,4-半乳糖基-转移酶、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基-转移酶、β-1,3-葡糖醛酸基-转移酶、α-2,3-唾液酸基-转移酶、α-2,6-唾液酸基-转移酶、α-2,8-唾液酸基-转移酶、α-1,2-岩藻糖基-转移酶、α-1,3-岩藻糖基-转移酶和α-1,4-岩藻糖基-转移酶。更优选地，糖基转移酶选自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、α-2,3-唾液酸基转移酶、α-2,6-唾液酸基转移酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶和α-1,4-岩藻糖基转移酶，其为来自参与构建HMO核结构以及岩藻糖基化的和/或唾液酸基化的HMO及其糖基衍生物的那些酶，其中苷元为在以上碳水化合物受体的基团处所定义的部分。编码上述转移酶的基因已在文献中有述。
在本发明的糖基转移酶介导的糖基化方法中，活化的糖核苷酸作为供体使用。每个活化的糖核苷酸通常包括连接至核苷酸的磷酸化糖残基，并且特异性糖基转移酶仅接受特异性糖核苷酸。因此，优选以下的活化的糖核苷酸参与到糖基转移中：UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-Xyl、GDP-Man、GDP-Fuc和CMP-唾液酸，特别优选选自UDP-Gal、UDP-GlcNAc、GDP-Fuc和CMP-唾液酸的那些。
在本发明方法中使用的转基因微生物具有通向上述活化的糖核苷酸的生物合成路径，即，其具有一组或多组基因，所述基因编码一种或多种负责合成一种或多种活化的糖核苷酸的酶，在培养细胞时，为细胞中糖基转移酶介导的反应中的糖基化做好准备。该组基因或者天然存在于细胞中，或者通过重组DNA操作技术的手段引入细胞中。通过细胞制备活化的糖核苷酸在参与各个糖核苷酸逐步反应序列的生物合成途径的酶的作用下产生，所述糖核苷酸逐步反应序列始自碳源(对于单糖代谢的综述参见例如，H.H.Freeze和A.D.Elbein的Essentials of Glycobiology第二版(A.Varki等人编著)，Cold Spring Harbour Laboratory Press(2009)，第四章中的Glycosylation precursors)。
应当强调的是，与转移糖基化的体外形式相比，通过转基因微生物经由其自身生物合成路径而制备活化的糖核苷酸是有优势的，由于其避免了使用非常昂贵的外源加入的糖核苷酸型供体，因此供体由细胞原位形成，并且磷脂酰核苷离去基团在细胞内再循环。
此外，用在发明方法中的微生物包含编码蔗糖利用系统的基因，即，细胞具有利用蔗糖分解代谢作为碳源和能量来源的能力。能够使细胞利用蔗糖的系统可以为细胞的基因池中通常发现的一种，但优选为异源系统(即，衍生自不同有机体，并通过常规重组DNA操作技术、优选经由表达载体转移至宿主细胞转移至宿主细胞)。通常可使用两种蔗糖分解代谢系统。根据磷酸烯醇丙酮酸(PEP)-依赖性的磷酸转移酶系统(“PTS”)，蔗糖被转运至微生物中并伴随着磷酸化，以产生细胞内蔗糖-6-磷酸，其被水解为葡萄糖-6-磷酸和果糖，接着它们参与到细胞中心碳代谢中。PTS可以由scr或sac基因编码。根据非-磷酸转移酶-依赖性的系统(“非-PTS”)，细胞外蔗糖在质子同向转运系统(蔗糖透性酶)的帮助下进入细胞，并且在转运之后，通过转化酶水解为葡萄糖和果糖，接着它们被磷酸化。就此而言，csc调节子由编码负责非-PTS蔗糖利用的酶的基因组成。
在本发明方法的发酵期间，向制备寡糖的微生物喂养通过糖酵解提供能量的蔗糖用于生长、繁殖和保持其结构。此外，细胞摄取的蔗糖通过蔗糖分解代谢提供用于合成在细胞中发生的糖基化过程所必需的活化的糖核苷酸的前体。内化的碳水化合物受体参与到糖基转移酶诱导的糖基化反应中，其中由细胞产生的活化的核苷酸供体的糖残基被转移，使得受体被糖基化。任选地，当细胞表达多于一种糖基转移酶时，可以发生额外的糖基化反应，导致目标寡糖的形成。当然，细胞优选缺乏任何可能降解细胞中产生的寡糖衍生物的酶活性。
在用于制备寡糖产物的方法的优选实现方式中，蔗糖利用系统是异源的。这是对工业上可获利的类似于寡糖制备的转化而言，当微生物、优选细菌、更优选大肠杆菌为最佳的菌株时的情况，因为这样的菌株通常没有利用蔗糖的能力。因此，应当用合适的表达质粒或者经由染色体整合，在不能利用蔗糖的细胞中引入蔗糖摄取盒，以使其成为可以利用蔗糖的。更优选地，蔗糖路径基因包括PTS-依赖性蔗糖利用系统，并且特别地，蔗糖调节子为scr。具有scr基因的微生物为例如，沙门氏菌属(Salmonella ssp.)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。
scr基因包括以下者：scrY、scrA、scrB和scrR。基因scrA编码蔗糖转运蛋白酶IIScr，其从经由主动转运通过细胞膜的细胞外蔗糖和伴随的磷酸化提供了细胞内蔗糖-6-磷酸。蔗糖特异性ScrY膜孔蛋白(由scrY编码)促进蔗糖通过外膜的扩散。ScrB转化酶(由scrB编码)通过水解将累积的蔗糖-6-磷酸分解为葡萄糖-6-磷酸和果糖。任选地，果糖激酶ScrK(由scrK编码)将果糖磷酸化为果糖-6-磷酸，然而这种酶的存在不是关键性的，因为果糖可以通过细胞拥有的其他机制被磷酸化。阻遏蛋白ScrR(由scrR编码)负向控制scrYAB基因的表达，并ScrR由蔗糖或果糖诱导。在葡萄糖的存在下，蔗糖基因的表达被抑制。
在优选的实施方式中，用质粒、更优选通过双质粒体系将异源scr基因引入微生物中，所述双质粒体系中的一个包含scrA基因且另一个包含scrB基因。scrY、scrR和任选的scrK基因可以由任一质粒携带。
此外优选地，在本发明的方法中，发酵液中不加入抗生素。
在本发明的方法中，要由微生物糖基化的碳水化合物受体为单糖或二糖，其选自半乳糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖基化的单糖、N-乙酰基-葡糖胺基化的单糖以及如上定义的其糖苷衍生物。所有这些碳水化合物衍生物可以容易地被具有LacY通透酶的细胞通过主动转运吸收(take up)并在糖基化之前积累在细胞中(WO01/04341、Fort等人Chem.Soc.,Chem.Comm.2558(2005)、EP-A-1911850、WO2013/182206、WO2014/048439)。这是因为细胞能够用其LacY透性酶将这些碳水化合物受体转运进入细胞，并且细胞缺乏任何能够降解这些受体的酶、特别是LacZ。优选地，细胞在lac操纵子上具有缺失的或者不足的lacA基因。
根据另一个优选的实施方式，在微生物中，lac阻遏子的lacl基因也是缺失的。在没有功能性抑制子的情况下，不需要诱导剂来表达LacY。。
根据另一个优选的实施方式，在以下阶段，在含水培养基中培养转基因细胞、特别是LacZ-Y+大肠杆菌细胞：
(a)由蔗糖确保的指数级细胞生长阶段；然后
(b)以连续加入、确保有限的细胞生长的蔗糖喂养阶段。
在进食阶段，可以向培养基一次性、按顺序地或者连续地加入要在细胞中内化并糖基化的外源碳水化合物受体、优选乳糖。在该第二阶段，受体可以以纯的固体/液体或者以浓缩的水溶液或悬浮液的形式加入。寡糖的制备发生在该第二阶段，并且可以持续6～7天。优选地，该喂养阶段在允许制备高细胞密度培养物的条件下进行。
本发明方法的特征在于，在微生物的生长阶段和制备阶段之间，没有必要改变碳源和/或能量来源。
任选地，该方法还包括向培养基中加入诱导剂，以诱导细胞表达参与受体转运的、和/或参与内化的受体糖基化的、和/或参与活化的糖核苷酸供体的生物合成的酶和/或蛋白质。诱导剂优选为异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并且在喂养阶段的开始加入到培养基中。然而，如果细胞为Lacl-表型的话，没有必要使用诱导剂。
我们相信，上述微生物在本发明的处理条件下是高度稳定的。因此，相信这些微生物可以使用蔗糖作为其碳源和能量的来源，至少与使用甘油和/或葡萄糖作为其碳源和/或能量来源的微生物以相同的制备率、并且以更可靠和可重现的方式，制备寡糖。就此而言，包含scr基因(用于利用蔗糖的微生物所需要的)加上一个或多个糖基转移酶基因(用于制备外源寡糖的微生物所需要的)的一个或多个质粒、优选一个或两个质粒，在上述微生物超过4天、优选5～7天的发酵期间是特别稳定的。
在第二阶段的末尾，寡糖产物已经累积在微生物的细胞内和细胞外基质中。然后优选地该产物以被动的方式转运至细胞的外部上清液中，即，其可以穿过细胞膜扩散到外部。细胞中的一种或多种糖流出转运子，即促进糖衍生物由细胞向上清液流出的蛋白质，能够促进该转运。该糖流出转运子可以是外源或内源存在的，并且在发酵的条件下可以被过表达以增强产生的寡糖衍生物的输出。对于将分泌的产物的糖部分的特异性能够通过细胞突变以常规重组DNA操作技术手段来改变。优选地，寡糖在细胞外基质中累积。或者，寡糖可以通过以常规方式破坏细胞壁而转运至细胞外部上清液中。
然后可以以常规方式将寡糖产物从含水培养基中分离，其中所述产物由细胞制得。
从培养基中分离寡糖的第一个步骤优选包括将寡糖从生产它的微生物中分离。这优选包括澄清培养基以除去由培养转基因微生物产生的悬浮的颗粒和污染物，特别是细胞、细胞组分、不溶性代谢产物和由培养转基因微生物产生的碎片。在这一步骤中，可以以常规的方式澄清包含寡糖产物的含水培养基。优选地，通过离心和/或过滤澄清培养基。
从培养基中分离寡糖的第二个步骤优选包括从含水培养基中除去可能干涉后续分离步骤的所有蛋白质、和肽、氨基酸、RNA和DNA以及任何内毒素和糖脂，优选在其已经被澄清之后进行。在这一步骤中，可以以常规的方式从培养基中除去蛋白质和相关的杂质。优选地，通过超滤、切向流高效过滤、切向流超滤、亲和层析、离子交换色谱、疏水相互作用色谱和/或凝胶过滤(即尺寸排阻层析)，特别是通过色谱、更特别是通过离子交换色谱或疏水相互作用色谱从培养基中除去蛋白质和相关的杂质。除了尺寸排阻层析之外，蛋白质和相关杂质通过色谱介质或者选择的膜而保留，而寡糖产物保留在含水培养基中。
如果需要，在已经将蛋白质和相关杂质从培养基中除去之后，随后可以将含水培养基中的寡糖产物从类糖副产物和从培养基中分离。这可以适当地通过对培养基进行色谱分离而完成。在中性寡糖产物的情况下这样的分离可以在色谱分离柱中进行，所述色谱分离柱填充有常规酸性阳离子交换树脂。酸性阳离子交换树脂可以为单价或二价阳离子形式，且优选为H+、K+、Na+、Mg2+或Ca2+的形式，特别是Ca2+。色谱分离可以以常规方式在溶液的pH为2～9的条件下进行。用在色谱分离中的洗脱液优选为水，特别是去离子水，但是也可以使用含水盐溶液。还可以使用醇，如乙醇，以及含水醇混合物。
根据优选的实施方式，用于制备寡糖、优选在还原端具有乳糖单元的寡糖、或其糖苷的本发明的方法包括以下步骤：
(i)提供转基因细胞，所述细胞包括：
-编码糖基转移酶的重组基因，所述酶能够使活化的糖核苷酸的糖残基转移至内化的乳糖或其糖苷，和
-通向活化的糖核苷酸的生物合成路径，
(ⅱ)在外源乳糖或其糖苷以及蔗糖的存在下，对转基因细胞进行培养，其诱导
-由转基因细胞经由主动转运机制使外源乳糖或其糖苷内化，以及
-通过由细胞表达的糖基转移酶介导的糖基转移，从内化的乳糖或其糖苷形成在还原末端具有乳糖单元的寡糖或其糖苷，
(ⅲ)从细胞、从培养基或者从两者中分离寡糖产物，
其特征在于，细胞还包含异源蔗糖利用系统、优选PTS-依赖性蔗糖利用系统、特别是其中蔗糖调节子为scr的PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为碳源，用于通过所述细胞进行所述活化的糖核苷酸的生物合成。
用在该优选方法中的转基因细胞，可以具有多于一个重组基因，其编码多于一种的糖基转移酶，所述糖基转移酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至内化的受体分子或者之前由相同的细胞制得的糖基化受体，由此，内化的受体通过由细胞表达的多种糖基转移酶介导的多重糖基转移来形成寡糖产物。因此，得到的寡糖产物可以为糖基化乳糖或其糖苷。糖基化乳糖优选为N-乙酰基-葡糖胺基化的、半乳糖基化的、岩藻糖基化的和/或唾液酸基化的乳糖。为了制备这些衍生物，细胞包含一种或多种编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶、半乳糖基转移酶、唾液酸基转移酶和/或岩藻糖基转移酶的重组基因，并且还包含通向相应的活化的糖型核苷酸，即UDP-GlcNAc、UDP-Gal、GDP-Fuc和/或CMP-唾液酸的生物合成路径。
更优选地，通过本方法制得的寡糖产物的特征在于式1：
其中Y为OH或以上限定的非糖苷元，优选为OH，
R1为岩藻糖基或者H，
R2为岩藻糖基或者H，
R3选自H、唾液酸基、N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团，其中N-乙酰基-乳糖胺基基团可以携带有包含一个或多个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个乳-N-二糖基基团的糖残基；每个N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，
R4选自H、唾液酸基和N-乙酰基-乳糖胺基基团，所述N-乙酰基-乳糖胺基基团任选被包含一个或多个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个乳-N-二糖基基团的糖残基取代；每个N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团能够被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，
条件是R1、R2、R3和R4基团中的至少一个与H不同。
甚至更优选的是，由本方法制得的式1的化合物的特征在于式1a、1b或1c
其中Y、R1和R2如上所定义，优选为OH，
R3a为N-乙酰基-乳糖胺基，所述N-乙酰基-乳糖胺基任选被包含一个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个乳-N-二糖基基团的糖残基取代；每个N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基所取代，
R4a为H或N-乙酰基-乳糖胺基，所述N-乙酰基-乳糖胺基任选被乳-N-二糖基基团取代；每个N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，
R3b为乳-N-二糖基基团，所述乳-N-二糖基基团任选被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，
R4b为H或N-乙酰基-乳糖胺基，所述N-乙酰基-乳糖胺基任选被一个或两个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个乳-N-二糖及基团取代；每个N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，
R5独立地为H或唾液酸基，
并且其中R1、R2或R5的至少一个不为H。
仍然更优选地，根据通过本方法制得的式1a或1b的化合物的特征在于：
-R3a的糖残基中的N-乙酰基-乳糖胺基基团连接至另一个具有1～3个内糖苷键的N-乙酰基-乳糖胺基基团，
-R3a的糖残基中的乳-N-二糖基基团连接至具有1～3个内糖苷键的N-乙酰基-乳糖胺基基团，
-R4a的糖残基中的乳-N-二糖基基团连接至具有1～3个内糖苷键的N-乙酰基-乳糖胺基基团基团，
-R4b的糖残基中的N-乙酰基-乳糖胺基连接至具有1～3个或1～6个内糖苷键的N-乙酰基-乳糖胺基，
-R4b的糖残基中的乳-N-二糖基基团连接至具有1～3个内糖苷键的N-乙酰基-乳糖胺基基团。
更优选地，根据通过本方法制得的式1a、1b和1c的化合物为人乳寡糖(当Y为OH时)或其糖苷(当Y为非糖苷元时)。
通过本方法制得的式1a的优选化合物选自乳-N-新四糖、对-乳-N-六糖、对-乳-N-新六糖、乳-N-新六糖、对-乳-N-八糖、乳-N-新八糖及其糖苷，所有这些可以任选地被一个或多个唾液酸和/或岩藻糖残基所取代。通过本方法制得的式1b的优选化合物选自乳糖-N-四糖、乳糖-N-六糖、乳糖-N-八糖、异-乳糖-N-八糖、乳糖-N-十糖、乳糖-N-十一糖及其糖苷，所有这些可以任选地被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代。
式1a或1b特别优选的化合物的特征在于：
-连接至N-乙酰基-乳糖胺基和/或乳-N-二糖基基团的岩藻糖残基连接至
·具有1～2个内糖苷键的乳-N-二糖基基团的半乳糖，和/或
·具有1～4个内糖苷键的乳-N-二糖基基团的N-乙酰基-葡糖胺，和/或
·具有1～3个内糖苷键的N-乙酰基-乳糖胺基基团的N-乙酰基-葡糖胺，
-连接至N-乙酰基-乳糖胺基和/或乳-N-二糖基基团的唾液酸残基连接至
·具有2～3个内糖苷键的乳-N-二糖基基团的半乳糖，和/或
·具有2～6个内糖苷键的乳-N-二糖基基团的N-乙酰基-葡糖胺，和/或
·具有2～6个内糖苷键的N-乙酰基-乳糖胺基基团的半乳糖。
根据最优选的方面，子式1a、1b或1c的化合物选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸基乳糖、6’-唾液酸基乳糖、3’-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LST-a、LST-b、LST-c、FLST-a、FLST-b、FLST-c、LNDFH-I、LNDFH-II、LNDFH-III、DS-LNT、FDS-LNT I、FDS-LNT II及其糖苷，或其盐。糖苷可以是α-或者β-异头物，但优选为β-异头物。
优选的加入培养基中的外源碳水化合物受体为乳酸，且优选的寡糖产物为人乳寡糖(HMO)。HMO由在还原端处的乳糖单元和一种或多种单糖单元组成，所述单糖单元为来自以下者：N-乙酰基-葡糖胺、半乳糖、岩藻糖和唾液酸(参见：Urashima等人的Milk Oligosaccharides,Nova Biomedical Books,New York,2011,ISBN:978-1-61122-831-1)。然后，为了制备HMO，细胞包含一种或多种编码β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶、β-1,6-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶，β-1,4-半乳糖基转移酶、α-2,3-唾液酸基转移酶、α-2,6-唾液酸基转移酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶和/或α-1,4-岩藻糖基转移酶的重组基因，并且还包含通向相应的活化糖型核苷酸，即UDP-GlcNAc、UDP-Gal、GDP-Fuc和/或CMP-唾液酸的生物合成路径。
根据另一个优选的实施方式，本发明用于制备N-乙酰化HMO、优选3～5个单糖单元的N-乙酰化HMO的方法包括以下步骤：
(i)提供LacZ-、LacY+基因型或者LacZ-、LacY+、Lacl-基因型的转基因大肠杆菌细胞，其包含：
-编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶的重组基因，所述酶能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖，
-任选的编码半乳糖基转移酶的重组基因，所述酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至N-乙酰基-葡糖胺基化的乳糖，和
-一种或多种编码通向UDP-GlcNAc及任选的UDP-Gal的生物合成路径的基因，
(ⅱ)在外源乳糖和蔗糖的存在下，对LacZ-、LacY+基因型或者LacZ-、LacY+、Lacl-基因型的转基因大肠杆菌细胞进行培养，从而诱导：
-由细胞经由主动转运机制使外源乳糖内化，和
-在细胞内形成任选被半乳糖基化的N-乙酰基-葡糖胺基化的乳糖，然后
(ⅲ)从细胞、从培养基或从两者中分离任选被半乳糖基化的N-乙酰基-葡糖胺基化的乳糖，
其特征在于，细胞还包含异源PTS-依赖性的蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为碳源以及能量来源，用于通过细胞的UDP-GlcNAc和任选的UDP-Gal的生物合成。
异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因、更优选包括scrY、scrA、scrB和scrR，并且特别是不包括scrK。
如果N-乙酰基-葡糖胺基转移酶为β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶，并且细胞中不存在编码半乳糖基转移酶的重组基因，产物优选为乳-N-三糖，如果细胞中还存在β-1,3-半乳糖基转移酶或者β-1,4-半乳糖基转移酶，产物优选分别为LNT或LNnT。
根据另一个优选的实施方式，本发明用于制备岩藻糖基化的HMO、优选3～5个单糖单元的岩藻糖基化的HMO的方法包括以下步骤：
(i)提供LacZ-、LacY+基因型或者LacZ-、LacY+、Lacl-基因型的转基因大肠杆菌细胞，其包含：
-编码岩藻糖基转移酶的重组基因，所述酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖，和
-一种或多种编码通向GDP-Fuc的生物合成路径的基因，
(ⅱ)在外源乳糖和蔗糖的存在下，对细胞进行培养，从而诱导：
-由转基因细胞经由主动转运机制使外源乳糖内化，和
-形成岩藻糖基化的乳糖，然后
(ⅲ)从细胞、从培养基或从两者中分离岩藻糖基化的乳糖，
其特征在于，细胞还包含异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为碳源以及能量来源，用于通过细胞的GDP-Fuc的生物合成。优选地，在该方法中，培养步骤包括两步喂养，第二喂养阶段通过向培养中连续加入少于第一喂养阶段中连续加入量的蔗糖，以便减慢细胞生长并增加在高细胞浓度培养中制备的产物的含量。在第二喂养阶段期间，向细胞培养中连续加入蔗糖的投料率比在第一喂养阶段期间连续加入的蔗糖少大约30～40％。在两个喂养阶段期间，乳糖可以被连续地加入，优选与蔗糖在相同的喂养溶液中，或者乳糖与蔗糖依次地加入。任选地，当在第二阶段之后有相当大量的未使用受体留在细胞外部分时，培养还包括第三喂养阶段。然后，优选以与第二喂养阶段设定的大概相同的投料率，继续加入蔗糖而不加入受体，直到受体消耗。
异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因、更优选包括scrY、scrA、scrB和scrR，特别地不包括scrK。
如果岩藻糖基转移酶为α-1,2-岩藻糖基转移酶，产物优选为2’-岩藻糖基乳糖，如果岩藻糖基转移酶为α-1,3-岩藻糖基转移酶，产物优选为3-岩藻糖基乳糖，如果α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶二者都在细胞中表达，产物优选为二岩藻糖基乳糖。
仍根据另一个优选的实施方式，本发明用于制备唾液酸基化的HMO、优选3～5个单糖单元的唾液酸基化的HMO的方法包括以下步骤：
(ⅰ)提供LacZ-、LacY+基因型或者LacZ-、LacY+、Lacl-基因型的转基因大肠杆菌细胞，其包含：
-编码唾液酸基转移酶的重组基因，所述酶能够将CMP-唾液酸的唾液酸残基转移至内化的乳糖，和
-一种或多种编码通向CMP-唾液酸的生物合成路径的基因，
(ⅱ)在外源乳糖和蔗糖的存在下，对LacZ-、LacY+基因型或者LacZ-、LacY+、Lacl-基因型的转基因大肠杆菌细胞进行培养，从而诱导：
-由转基因细胞经由主动转运机制的外源乳糖内化，和
-唾液酸基化的乳糖的形成，然后
(ⅲ)从细胞、从培养基或从两者中分离唾液酸基化的乳糖，
其特征在于，细胞还包含异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为碳源以及能量来源，用于通过细胞的CMP-唾液酸的生物合成。
异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因、更优选包括scrY、scrA、scrB和scrR，并且特别是不包括scrK。
如果唾液酸基转移酶为α-2,3-唾液酸基转移酶，产物优选为3’-唾液酸基乳糖，如果唾液酸基转移酶为α-2,6-唾液酸基转移酶，产物优选为6’-唾液酸基乳糖。
根据另一个优选的实施方式，本发明用于制备岩藻糖基化的和唾液酸基化的HMO、优选3～5个单糖单元的岩藻糖基化的和唾液酸基化的HMO的方法包括以下步骤：
(ⅰ)提供LacZ-、LacY+基因型或者LacZ-、LacY+、Lacl-基因型的转基因大肠杆菌细胞，其包含：
-编码唾液酸基转移酶的重组基因，所述酶能够将CMP-唾液酸的唾液酸残基转移至内化的乳糖或者在先的岩藻糖基化的乳糖，
-编码岩藻糖基转移酶的重组基因，所述酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖或者在先的唾液酸基化的乳糖，和
-一种或多种编码通向CMP-唾液酸和GDP-Fuc的生物合成路径的基因，
(ⅱ)在外源乳糖和蔗糖的存在下，对LacZ-、LacY+基因型或者LacZ-、LacY+、Lacl-基因型的转基因大肠杆菌细胞进行培养，从而诱导：
-由转基因细胞经由主动转运机制的外源乳糖内化，和
-唾液酸基-岩藻糖基-乳糖的形成，然后
(ⅲ)从细胞、从培养基或从两者中分离唾液酸基-岩藻糖基-乳糖，
其特征在于，细胞还包含异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为碳源以及能量来源，用于通过细胞的CMP-唾液酸和GDP-Fuc的生物合成。
异源PTS-依赖性蔗糖利用系统优选包括scr基因、更优选包括scrY、scrA、scrB和scrR，并且特别是不包括scrK。
如果唾液酸基转移酶为α-2,3-唾液酸基转移酶且岩藻糖基转移酶为α-1,3-岩藻糖基转移酶，产物优选为3’-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖。
本发明的第二方面涉及提供一种转基因微生物，其能够使蔗糖和并非蔗糖、优选乳糖的碳水化合物受体内化至所述微生物中，并且其包含：
-编码糖基转移酶的重组基因，所述酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至微生物中的受体，
-用于由蔗糖制备活化的糖核苷酸的生物合成路径，和
-一种或多种编码异源PTS-依赖性蔗糖利用系统的基因，优选scr基因，由此所述细胞能够使用蔗糖作为碳源、优选作为主要碳源、更优选作为唯一碳源，用于制备所述活化的糖核苷酸，并且作为能量来源、优选作为主要能量来源、更优选作为唯一能量来源，用于制备所述寡糖。
第二方面的转基因微生物选自细菌和酵母，优选细菌。细菌优选为选自以下者：大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜热链球菌(Thermophilus aquaticus)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitis)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳酸菌属(Lactococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus spp.)、Micromomospora spp.、微球菌属(Micrococcus spp.)、红球菌属(Rhodococcus spp.)、假单胞菌(Peudomonas)，其中优选大肠杆菌。
而且，第二方面的转基因细胞包含一种或多种内源或重组基因，其编码一种或多种糖基转移酶，所述酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基转移至内化的受体。异源核酸序列的来源可以是任何动物(包括人)或者植物、真核细胞比如那些来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candida albican)或者来自藻类的那些、原核细胞比如源自大肠杆菌、脆弱拟杆菌(Bacterioides fragilis)、发光杆菌属(Photobacterium sp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜热链球菌(Thermophilus aquaticus)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的那些、或者病毒。糖基转移酶或者通过基因或等同的DNA序列编码的蛋白质表达的酶优选为葡萄糖基转移酶、半乳糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、N-乙酰半乳糖胺基转移酶、葡糖醛酸基转移酶、木糖基转移酶、甘露糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸基转移酶等。在优选的实施方式中，糖基转移酶选自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基-转移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基-转移酶、β-1,3-半乳糖基-转移酶、β-1,4-半乳糖基-转移酶、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基-转移酶、β-1,3-葡糖醛酸基-转移酶、α-2,3-唾液酸基-转移酶、α-2,6-唾液酸基-转移酶、α-2,8-唾液酸基-转移酶、α-1,2-岩藻糖基-转移酶、α-1,3-岩藻糖基-转移酶和α-1,4-岩藻糖基-转移酶。更优选地，糖基转移酶选自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、α-2,3-唾液酸基转移酶、α-2,6-唾液酸基转移酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶和α-1,4-岩藻糖基转移酶，其为来自参与构建HMO核结构以及岩藻糖基化的和/或唾液酸基化的HMO及其糖基衍生物的那些酶，其中苷元为在以上碳水化合物受体的基团处所定义的部分。
进而，本发明第二方面的转基因微生物包括使外源碳水化合物受体、优选乳酸、内化至用于糖基化的微生物中的转运系统，以制备异体目的寡糖，优选不会不利地影响细胞的基本功能或者破坏其完整性的寡糖。优选地，碳水化合物在由转运子蛋白、所谓的透性酶介导的主动转运的帮助下被内化，所述转运蛋白起到酶的作用，并且借此，微生物可以允许外源物质进入并在使其集中在细胞质中。特别地，乳糖透性酶(LacY)特异性地作用于半乳糖、简单的半乳糖基二糖比如乳糖及其糖苷。转基因微生物优选缺乏任何可能使受体降解的酶活性(比如LacZ)。同样，微生物不能使寡糖产物水解或降解。
此外，第二方面的转基因微生物包含编码磷酸烯醇丙酮酸(PEP)-依赖性的磷酸转移酶(PTS)蔗糖利用系统的基因，即，细胞具有利用蔗糖分解代谢作为碳源和能量来源的能力。PTS系统是异源的(即，衍生自不同有机体，并通过常规重组DNA操作技术、优选经由表达载体转移至宿主细胞)，并由scr或sac基因、优选scr基因编码。
优选由转基因微生物、优选大肠杆菌、包含的scr基因为以下者：scrY、scrA、scrB和scrR。scrA基因编码蔗糖转运蛋白酶IIScr，其从经由主动转运通过细胞膜的细胞外蔗糖和伴随的磷酸化提供了细胞内蔗糖-6-磷酸。蔗糖特异性ScrY膜孔蛋白(由scrY编码)促进蔗糖通过外膜的扩散。ScrB转化酶(由scrB编码)通过水解将累积的蔗糖-6-磷酸分解为葡萄糖-6-磷酸和果糖。果糖激酶ScrK(由scrK编码)的存在不是关键性的，因为果糖可以通过细胞拥有的其他机制被磷酸化。阻遏蛋白ScrR(由scrR编码)负向控制scrYAB基因的表达，并ScrR由蔗糖或果糖诱导。
在优选的实施方式中，用质粒、更优选通过双质粒体系将异源scr基因引入微生物中，所述双质粒体系中的一个包含scrA基因且另一个包含scrB基因。scrY、scrR基因可以由任一质粒携带
优选地，第二方面的转基因微生物在lac操纵子上具有缺失的或者不足的lacA基因。
还优选的是，在转基因微生物中还缺失lac阻遏子的lacl基因。
以上公开的转基因微生物适用于从具有上述苷元的乳糖或乳糖苷来制备式1的寡糖
其中Y为OH或以上限定的非糖苷元，优选为OH，
R1为岩藻糖基或者H，
R2为岩藻糖基或者H，
R3选自H、唾液酸基、N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团，其中N-乙酰基-乳糖胺基基团可以携带有包含一个或多个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个乳-N-二糖基基团的糖残基；每个N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，
R4选自H、唾液酸基和N-乙酰基-乳糖胺基基团，所述N-乙酰基-乳糖胺基基团任选被包含一个或多个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个乳-N-二糖基基团的糖残基取代；每个N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基团能够被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，
条件是R1、R2、R3和R4基团中的至少一个与H不同。
优选地，式1的寡糖为人乳寡糖(当Y为OH时)或其糖苷(当Y为非糖苷元时)，更优选为人乳寡糖。
根据优选的实施方式，转基因微生物为LacZ-、LacY+基因型或者LacZ-、LacY+、Lacl-基因型的大肠杆菌细胞，其包含：
-编码N-乙酰基-葡糖胺基转移酶的重组基因，所述酶能够将UDP-GlcNAc的GlcNAc转移至内化的乳糖，
-任选的编码半乳糖基转移酶的重组基因，所述酶能够将UDP-Gal的半乳糖残基转移至N-乙酰基-葡糖胺基化的乳糖，
-一种或多种编码通向UDP-GlcNAc及任选的UDP-Gal的生物合成路径的基因，和
-包括scrY、scrA、scrB和scrR基因的异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供碳源以及能量来源，用于由细胞制备的UDP-GlcNAc和任选的UDP-Gal的生物合成。
特别地，异源scr簇不包括scrK。
更优选地，N-乙酰基-葡糖胺基转移酶为β-1,3-N-乙酰基葡糖胺基转移酶，并且细胞中不存在编码半乳糖基转移酶的基因。在此情况下，转基因大肠杆菌主要制备出乳-N-三糖。
此外更加优选的是，N-乙酰基-葡糖胺基转移酶为β-1,3-N-乙酰基葡糖胺基转移酶，并且半乳糖基转移酶为β-1,3-半乳糖基转移酶。在此情况下，转基因大肠杆菌主要制备出LNT。
仍更加优选的是，N-乙酰基-葡糖胺基转移酶为β-1,3-N-乙酰基葡糖胺基转移酶，并且半乳糖基转移酶为β-1,4-半乳糖基转移酶。在此情况下，转基因大肠杆菌主要制备出LNnT。
根据另一个优选的实施方式，转基因微生物为LacZ-、LacY+基因型或者LacZ-、LacY+、Lacl-基因型的大肠杆菌细胞，其包含：
-编码唾液酸基转移酶的重组基因，所述酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至内化的乳糖，和
-一种或多种编码通向GDP-Fuc的生物合成路径的基因，
-包括scrY、scrA、scrB和scrR的异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为碳源以及能量来源，用于通过细胞的GDP-Fuc的生物合成。
特别地，异源scr簇不包括scrK。
更优选地，岩藻糖基转移酶为α-1,2-岩藻糖基转移酶。在此情况下转基因大肠杆菌主要制备出2’-FL。
另外更加优选的是，岩藻糖基转移酶为α-1,3-岩藻糖基转移酶。在此情况下转基因大肠杆菌主要制备出3’-FL。
仍更加优选的是，细胞中存在有两种岩藻糖基转移酶：α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶。在此情况下转基因大肠杆菌主要制备出DFL。
根据另一优选的实施方式，转基因微生物为LacZ-、LacY+基因型或者LacZ-、LacY+、Lacl-基因型的大肠杆菌细胞，其包含：
-编码唾液酸基转移酶的重组基因，所述酶能够将CMP-唾液酸的唾液酸残基转移至内化的乳糖，
-一种或多种编码通向CMP-唾液酸的生物合成路径的基因，和
-包括scrY、scrA、scrB和scrR的异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为碳源以及能量来源，用于由细胞制备的CMP-唾液酸的生物合成。
特别地，异源scr簇不包括scrK。
更优选地，唾液酸基转移酶为α-2,3-唾液酸基转移酶。在此情况下转基因大肠杆菌主要制备出3’-SL。
另外更加优选的是，唾液酸基转移酶为α-2,6-唾液酸基转移酶。在此情况下转基因大肠杆菌主要制备出6’-SL。
根据另一个优选的实施方式，转基因微生物为LacZ-、LacY+基因型或者LacZ-、LacY+、Lacl-基因型的大肠杆菌细胞，其包含：
-编码唾液酸基转移酶的重组基因，所述酶能够将CMP-唾液酸的唾液酸残基转移至任选被岩藻糖基化的内化的乳糖，
-编码岩藻糖基转移酶的重组基因，所述酶能够将GDP-Fuc的岩藻糖残基转移至任选被唾液酸基化的内化的乳糖，
-一种或多种编码通向CMP-唾液酸的生物合成路径的基因，
-一种或多种编码通向GDP-Fuc的生物合成路径的基因，和
-包括scrY、scrA、scrB和scrR的异源PTS-依赖性蔗糖利用系统，以提供蔗糖作为碳源以及能量来源，用于由细胞制备的CMP-唾液酸和GDP-Fuc的生物合成。
特别地，异源scr簇不包括scrK。
更优选地，唾液酸基转移酶为α-2,3-唾液酸基转移酶且岩藻糖基转移酶为α-1,3-岩藻糖基转移酶。在此情况下，转基因大肠杆菌主要制备出3’-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖。
实施例
实施例1：利用大肠杆菌由甘油或蔗糖制备LNnT的比较试验
细菌菌株：
两种菌株均由大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株DH1通过以下方法构建：使lacZ nanKETA lacA melA wcaJ mdoH基因缺失，并且插入Plac启动子，保留参与UDP-GlcNAc和UDP-Gal生物合成的基因，所述菌株从德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganism)获得(参照DSM 5346)。甘油利用菌株(菌株I)包含pBBR3-lgtA-tet质粒以及pBS-galT-amp质粒，所述pBBR3-lgtA-tet质粒携带有β-1,3-N-乙酰基葡糖胺基转移酶的脑膜炎奈瑟菌(N.Meningitidis)的lgtA基因和四环素抗性基因，所述pBS-galT-amp质粒携带有β-1,4-半乳糖基转移酶的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的galT基因和氨苄青霉素抗性基因。蔗糖利用菌株(菌株II)包含以下两种质粒：
-pBS-scrBR-galT-amp，其是携带有编码β-1,4-半乳糖基转移酶的galT基因、编码蔗糖阻遏子的scrR基因、编码蔗糖-6-磷酸水解酶的scrB基因以及氨苄青霉素抗性基因的pUC衍生物；
-pBBR3-scrYA-lgtA-tet，其是携带有编码β-1,3-N-乙酰基葡糖胺基转移酶的lgtA基因、编码PTS系统蔗糖特异性EIIBC组分的scrA基因、编码蔗糖膜孔蛋白的scrY基因和四环素抗性基因的pBBR1-MCS3衍生物。
发酵步骤：
将葡萄糖、甘油、蔗糖和乳糖各自在120℃下进行灭菌。将异丙基巯基β-D-半乳糖苷(IPTG)过滤灭菌。
在包含大约0.9升的矿物培养基的3升发酵罐中进行培养(Samain等人的J.Biotechnol.72,33(1999)；对于蔗糖系统而言不包含抗生素)。温度保持在33℃，用28％的NH4OH将pH调节至6.8。将包括在LB培养基(20ml)或者M9培养基(20ml)中的生产菌株的接种物加入到发酵罐中，所述LB培养基用于菌株I并补充有氨苄青霉素和四环素，所述M9培养基用于菌株II并补充有蔗糖。指数级生长阶段以接种开始，直到初始加入到培养基中的碳源(用于菌株I的葡萄糖或用于菌株II的蔗糖，≈17.5g/l)耗尽而结束。然后在开始用碳源(500g/l溶液，对菌株I而言4.5g/h甘油，对菌株II而言3g/l的蔗糖)喂养之前加入乳糖溶液(70g乳糖/500ml水)。还加入诱导剂(异丙基巯基-β-D-半乳糖苷，IPTG，1～2ml 50mg/ml的溶液)。在细胞死亡之后(LNnT滴度：45g/l)甘油喂养的发酵(菌株I)持续90小时。在116小时之后蔗糖喂养的发酵(菌株II)产生了56g/l的LNnT浓度。
实施例2：利用大肠杆菌由蔗糖制备2’-FL
细菌菌株：
两种菌株均由大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株DH1通过以下方法构建：使lacZ nanKETA lacA melA wcaJ mdoH基因缺失，并且在gmd基因上游插入Plac启动子，所述菌株从德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganism)获得(参照DSM 5346)。此外，菌株包含以下两种质粒：
-pBS-futC-scrBR-amp，其是携带有编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的futC基因、编码蔗糖阻遏子的scrR基因、编码蔗糖-6-磷酸水解酶的scrB基因以及氨苄青霉素抗性基因的pUC衍生物；
-pBBR3-GMAB-scrYA-tet，其是携带有参与GDP-Fuc生物合成的manB、manC、gmd和wcaG基因，编码PTS系统蔗糖特异性EIIBC组分的scrA基因、编码蔗糖膜孔蛋白的scrY基因和四环素抗性基因的pBBR1-MCS3衍生物。
发酵步骤：
将蔗糖和乳糖各自在120℃下进行灭菌。将异丙基巯基β-D-半乳糖苷(IPTG)过滤灭菌。
在包含大约0.9升的矿物培养基的2升发酵罐中进行培养(Samain等人的J.Biotechnol.72,33(1999)；不包含抗生素)。温度保持在33℃，用28％的NH4OH将pH调节至6.8。将包括在M9培养基(20ml)中的生产菌株的接种物加入到发酵罐中，所述M9培养基补充有蔗糖。指数级生长阶段以接种开始，直到初始加入到培养基中的蔗糖(≈22g/l)耗尽而结束。然后加入诱导剂(异丙基巯基-β-D-半乳糖苷，IPTG，1～2ml50mg/ml的溶液)。用乳糖+蔗糖(每升水中160g乳糖+500g蔗糖)的喂养以9ml/h的速率开始进行6小时，然后以6ml/h的速率继续进行115小时。在发酵结束时上清液中的2’-FL的浓度大约为100g/l。