能够增强植物细胞中水杨酸诱导的细胞死亡并有助于抵抗真菌毒力因子脱氧雪腐镰刀菌烯醇、抵抗镰刀菌属真菌和镰刀菌赤霉病的基因及包含该基因的重组构建体的制作方法

本发明涉及能够增强植物细胞中水杨酸诱导的细胞死亡，并且有助于对真菌毒力因子脱氧雪腐镰刀菌烯醇的抗性、对镰刀菌属真菌和镰刀菌赤霉病的抗性的基因，以及包含该基因的重组构建体。本发明还涉及用该基因转化的植物细胞，以及植物材料，该植物材料包括含有所述转化的植物细胞的植物细胞培养物、种子和植物。

酚类化合物水杨酸是植物抗病性的关键信号分子。水杨酸积累是由病原体攻击和其它应激条件诱导的(Delaney等人，1994)。水杨酸或其类似物例如苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代羧酸的外源施用在植物中诱导抗病性(White，1979；等人，1996；Lawton等人，1996)。水杨酸正调节细胞死亡(Vlot等人，2009)，并且在这样做时其抑制活体营养型(biotrophic)病原体的扩散。它是对活体营养和半活体营养型病原体如禾谷镰刀菌(F.graminearum)的防御反应的重要组成部分(Makandar等人，2012)。禾谷镰刀菌是造成经济破坏性的谷物的镰刀菌赤霉病(FHB)的致病剂；这种病原体是半活体营养型的，在死体营养阶段(其中它们以死亡的植物组织饲喂)之前有一短的活体营养阶段。这种疾病是重要的，因为它导致小粒谷物如小麦和大麦的产量损失和毒素污染。已知增强对毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的抗性可以提高对疾病的抗性。鉴于FHB的经济重要性，已经制定了几种控制策略来预防FHB流行病。然而，宿主抗性的使用被认为是控制小麦中FHB和单端孢霉烯累积的最有效的手段。DON是植物毒性的，并且对DON的抗性增强对镰刀菌和FHB疾病的抗性。US2007/0044171公开了数千种被描述为可用于改善植物的重组多核苷酸。

本发明的目的是发现增强水杨酸诱导的免疫并且有助于对DON和FHB的抗性的新基因。

技术实现要素：

申请人已经鉴定了新的DON应答性孤儿基因(ENST1-SEQ ID NO：1)及其启动子，其特征在于DON应答元件，其可以用于驱动FHB抗性基因的表达。该基因的同义词是FROG(镰刀菌抗性孤儿基因)。申请人已经从小麦中分离了与ENST1具有约94％同源性的基因的两个变体(图1-SEQ ID NO：26和27)。申请人已经表明该基因具有大于62％核苷酸序列同一性的同源物，该基因存在于山羊草(Aegilops tauschii)、二穗短柄草、草甸羊茅(Festuca pratensis)、大麦(Hordeum vulgare)和小麦(Triticum aestivum)中(图2)。申请人已经表明在三种转基因小麦品系中ENST1的过表达(a)增强了小麦对禾谷镰刀菌定殖的抗性(图8)以及(b)延缓了FHB疾病症状的扩散(图9)。申请人已经表明在拟南芥植物中ENST1的过表达增强了水杨酸诱导的细胞死亡(图4)(对活体营养型病原体的抗性的重要组成部分)，因此可用于抗病育种。此外，该基因对DON和产生DON的镰刀菌有应答性，并且与二穗短柄草ENST1同源物的启动子具有42％的同一性的启动子已经被克隆和测序，可用于控制DON应答基因(图5和6)。申请人已经表明，与非沉默的对照植物相比，在栽培品种CM82036的小麦头部中病毒诱导的ENST1基因沉默显著增加了DON漂白(bleached)的小穗的数量(图7)。

本发明提供分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包括SEQ ID NO：1，或与SEQ ID NO：1具有至少60％序列同一性的其功能变体(下文称为“本发明的多核苷酸”)。

本发明还提供由本发明的分离的多核苷酸编码的分离的蛋白质(下文称为“本发明的蛋白质”)。

本发明还提供包括在植物细胞中发挥作用的可操作连接到转基因的启动子区的重组构建体，其中该转基因包括本发明的多核苷酸。优选地，该启动子区包括DON应答启动子，优选SEQ ID NO：2的序列，或其与SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的功能变体。

本发明还提供包括本发明的重组构建体的转化平台。优选地，启动子区包括DON应答启动子。优选地，所述启动子区包括SEQ ID NO：2的序列。优选地，所述转基因包括SEQ ID NO：1的重组多核苷酸。最优选地，所述启动子区包括SEQ ID NO：2的序列，并且所述转基因包括SEQ ID NO：1的重组多核苷酸。

典型地，所述转化平台包括能够介导细胞转化或基因枪转化的细菌。

本发明还提供用本发明的多核苷酸、重组构建体或转化平台遗传转化的植物材料。典型地，所述植物材料选自于植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物或植物种子。典型地，所述转化的植物材料包括能够过表达本发明的多核苷酸的转化细胞。

本发明还提供包括携带转基因的植物细胞的植物材料，其中所述转基因包括本发明的多核苷酸。

本发明还提供遗传转化植物材料的方法，该方法包括用本发明的多核苷酸、重组构建体或转化平台转化植物材料的细胞或多个细胞的步骤，其中转化的细胞或多个细胞通常能够过表达本发明的多核苷酸。典型地，所述植物材料选自于植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物或植物种子。

本发明还提供产生转基因细胞的方法，该方法包括以下步骤：用包括本发明的重组构建体的转化平台接种细胞，在使得转化平台能够转化细胞的条件下培养该细胞，选择性地筛选接种细胞用于转化的细胞，并且通常分离该转化的细胞或每个转化的细胞。优选地，所述重组构建体包括DON应答启动子。最优选地，所述重组构建体包括启动子区和转基因，该启动子区包括SEQ ID NO：2的序列，转基因包括SEQ ID NO：1的重组多核苷酸。

本发明还提供产生转基因植物的方法，该方法包括根据本发明的方法产生转基因细胞，并从转化的细胞产生转化植物的步骤。

本发明还提供产生具有改善性质的植物的方法，该方法包括以下步骤：用根据本发明的转化平台或包括本发明的重组构建体的转化平台转化植物，并种植所述植物。优选地，所述重组构建体包括DON应答启动子。最优选地，所述重组构建体包括启动子区和转基因，该启动子区包括SEQ ID NO：2的序列，转基因包括SEQ ID NO：1的重组多核苷酸。典型地，所述改善性质选自于：对FHB疾病的抗性、对DON的抗性、提高产量、提高种子数量、提高种子重量、改善的抗病性。

优选地，所述植物是谷物植物，优选小粒谷物植物。理想地，所述植物选自于小麦、大麦、燕麦、玉米或拟南芥植物。

本发明还提供根据本发明的方法遗传转化的植物材料，其中该植物材料的至少一个细胞过表达本发明的重组多核苷酸。典型地，所述植物材料选自于植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物或植物种子。

本发明还涉及能够介导细胞转化并含有根据本发明的转化平台的细菌。

本发明还涉及根据本发明的方法产生的种子、转基因细胞、植物细胞培养物或植物细胞、转基因植物组织、转基因植物材料或稳定的转基因植物。

本发明还涉及含有本发明的转化平台或重组构建体或重组多核苷酸的种子、转基因细胞、植物细胞培养物或植物细胞、转基因植物组织、转基因植物材料或稳定的转基因植物。

本发明还涉及能够遗传转化细胞(理想地，植物细胞)的试剂盒，其包括(a)能够介导细胞转化的细菌，(b)重组构建体，和(c)转基因。所述转基因可以位于单一转化载体上或可以位于不同的载体上。

本发明还提供分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包括SEQ ID NO：2的序列或其与SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的功能变体。

附图说明

图1.ENST1小麦变体的多重比对。从cDNA库中分离来自小麦变体TaENST1cm-4A和TaENST1cm-4B(栽培品种CM82036)的编码序列，并用于从参考小麦基因组(栽培品种中国春(Chinese spring))的分析中检索不同的变体。使用MULTALIN将得到的序列TaENST1cs-4A、TaENST1cs-4B和TaENST1cs-4D与来自CM82036栽培品种的序列进行比对和比较。

图2.不同ENST1同源物的多重比对。ENST1同源物的编码序列(A)或相应的蛋白质序列(B)的比对。通过针对NCBI核苷酸集合、大麦(栽培品种Morex)和二穗短柄草基因组的BLASTn分析鉴定序列。缩写词：山羊草(At)、二穗短柄草(Bd)、草甸羊茅(Fp)、大麦(Hv)和小麦(Ta)

图3.在拟南芥中过表达ENST1的转基因系的分子表征。将ENST1的编码序列引入在组成型双35S启动子控制下的二元gateway载体pAM-PAT-GWY中，之后使用该构建体通过浸渍花转化拟南芥。(A)通过PCR验证携带ENST1的T-DNA构建体在具有与35S启动子和T-DNA构建体的终止子匹配的引物的不同拟南芥转基因系(OE-1、OE-2、OE-20)中的插入。将野生型植物(Col-0)和用于转化的载体分别用作PCR阳性或阴性对照。(B)通过RT-PCR分析确定ENST1在正常植物生长条件下与野生型植物(Col-0)相比在不同转基因系中的基因表达。

图4.在拟南芥中ENST1过表达对水杨酸诱导的程序性细胞死亡的影响。测试了野生型植物Col-0(WT)和过表达TaENST1-4A(OE-1，OE-2和OE-20)的三个独立系对水杨酸(SA)的应答。幼苗用65μM SA处理或在49℃(10分钟)处理。处理后24小时，进行根毛测定，评估显示细胞质的回缩和浓缩的根毛的百分比，并且没有FDA染色被认为其已经经历了凋亡型程序性细胞死亡(AL-PCD)。呈现的值是平均值(n＝3)±SEM。实验重复三次。

图5.(A)脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和(B)禾谷镰刀菌对ENST1的转录的影响。(A)用DON或吐温-20(模拟处理)处理栽培品种CM82036小麦的幼苗根、叶和开花的头部。在处理后24小时收取组织并用于分析。(B)用野生型禾谷镰刀菌GZ3639、其DON-负突变衍生物GZT40或吐温-20处理小麦头部。如所指示，在接种后不同时间点收取组织。数据表示相对于参考基因α-微管蛋白的TaENST1-4A表达，在实时PCR分析后使用2^-ΔCt方法。结果是三个(A)或两个(B)生物学重复的平均值，误差线表示SEM。

图6.ENST1的启动子区驱动β-D-葡糖醛酸糖苷酶活性，如在拟南芥中所证明的。通过卡那霉素选择和基于PCR的启动子区扩增，确认T2幼苗是纯合转化体。将幼苗在DON或模拟处理中孵育并染色用于GUS活性，如图所示，该启动子驱动DON和组织特异性GUS活性。

图7.在小麦小穗中ENST1的病毒诱导的基因沉默(VIGS)。使用大麦条纹花叶病毒(BSMV)构建体BSMV：00(空载体)或BSMV：ENST1(靶向TaENST1-4A的构建体)对小麦栽培品种CM82036的植物进行病毒诱导的基因沉默。在第一个头部出现之前用三重(tripartite)BSMV质粒处理旗叶，随后在开花中期用DON或吐温-20(模拟处理)接种。所呈现的数据是接种后14天(dpi)获得的结果。(A)通过实时PCR分析对小麦小穗中的基因沉默进行定量，使用2^-ΔCt方法相对于参照基因α-微管蛋白计算TaENST1-4A表达。(B)图像显示典型的疾病症状。(C)每个头部的病害小穗数目的量化。结果(A)和(C)是每次处理每个构建体具有约16个头部的两个生物学重复的平均值。误差线表示SEM。使用Kruskal-Wallis检验确定统计学显著性差异。具有不同字母的列显著不同(P＜0.05)。

图8.TaENST过表达对小麦叶片抗禾谷镰刀菌A、B和C的影响，TaENST过表达系(OE-1、OE-2和OE-3)和对照植物(WT)被用于表型分析。用禾谷镰刀菌加DON(75μM)处理分离的小麦叶片后4天测定：A：代表性叶片症状、B：病叶面积和C：分生孢子的产生。误差线表示±SEM。星号表示与WT相比的显著差异((B)Tukey′s HSD测试；(C)Mann-Whitney U测试；*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001)。

图9.TaENST过表达对小麦FHB疾病易感性的影响。A和B，在开花中期，来自过表达系(OE-1、OE-2和OE-3)或对照植物(WT)的中心开花小穗用禾谷镰刀菌点接种。在接种后7、14和21天评估疾病，并且所呈现的数据对应于在(A)21天或(B)对AUDPC的得分。误差线表示±SEM。星号表示与WT相比的显著差异(Mann-Whitney U检验；*，P＜0.05；**，P＜0.01)。

发明详述

本发明涉及限于草的早熟禾亚科的DON应答孤儿基因ENST1，其能够增强水杨酸诱导的程序性细胞死亡，抵抗镰刀菌赤霉病(FHB)毒力因子DON，抵抗镰刀菌属真菌和镰刀菌赤霉病。该基因称为ENST1(该基因的同义词是FROG-镰刀菌抗性孤儿基因)，并且该基因序列提供如下。

ATGGTGTGGTCTACCAGCAAGCAACAAGGAGGAGAGCGAGAAGAATCGAAGCAGCACAAAATGGTAAAAGAGGTGAAGACACCTATCTTCACGCATCAGCTCTCCTTCCATTCTCTTCCCCTTAACAAAGTCAAGAACATCGAGGTCGACCGCTTGAGGCTGTCTTTCACGACGCCGAAAAATTCTACGCTGGTCCCCGTTGATTCCGGTTCTGATGAAGAGAGTGACGAAGATCGAGGCTGTTCGGACATCGATTCTAACAAGCCTATGGACGAAGGGTTAGATCACATCTGTAGTGGTCTGCATGCTATTCCCCGGAAAAACAAAGCAAGATCGGCCAAGAAAAGATCCCATAAGATCAGCTCTAGGAAATTCTACAAAATATTCAGTTGA[SEQ ID NO：1].

该基因编码核蛋白ENST1，并且已被表征为与应激调节物SNRK1a和新型NAC转录因子相互作用的核蛋白，如通过酵母双杂交分析所确定的。所述ENST1的序列提供如下。

MVWSTSKQQGGEREESKQHKMVKEVKTPIFTHQLSFHSLPLNKVKNIEVDRLRLSFTTPKNSTLVPVDSGSDEESDEDRGCSDIDSNKPMDEGLDHICSGLHAIPRKNKARSAKKRSHKISSRKFYKIFS[SEQ ID NO：3]

申请人还发现了应答于DON处理而活化的DON应答启动子，如通过基因表达研究(见图5)和在携带启动子-GUS融合体的拟南芥转化体中的GUS活性的分析(见图7)所证明的。所述启动子的序列提供如下：

CTGCCTCTTGCGAGCGGGAAGCCAGTGCCACCGCTCGGCATTTCCCGTACATCCGGATCTAAGCTCACCCGTAGCGCGACAATTAGTGGATAGGAGTTGGGGCCTCACCGAGAAGCACTGCCCTTCCTGGTCCTCCTACCTGCAAAGAGGTGAAGATGCGGTCGGCCGCACCGCGGTAGCTCGACGGCTCCGTGAATGGTGGGGCAGATGCCACGTTGCTGCATGGCTCCGCGCGACTGSCMACATGAATGGTGGCGACGGGTACGAAAGTGGCGGCAGCTACAACTTCGCGCCGACATGAGTATCCCGAGCCTCCTTCGCCGTCTCGTGCACCTTTTTTTAACAAATTAAGAAGCTTTTTGCCCTTCTGGGATACTGCTGGGCCCGAGGCGGAGTGAATCTGGGCGGGTTGGGTACAACCATACAAGGAGGAAGAATGTGGGAGTAGTGGGGTGGTTGACCTGCTTTTCTTCGGTTCAGTTCGCTCCTGTTCAAAAGAATGACCAACTAGGAGAAAAAACCAAAAGCAAAAATAAACTGTCAACGTGGCAAGCGCTAAAATTGAGAGAAGAAAAACCAAGTTAAAATGTAAACACGAGGGTAAAATGTGGCACAAAGTGCAAAAGTGAAGGTACTCACCTGCCAAAATGAAAGTGAAGGTGCTCCCTCCTTCCCAAAATATAAGGCGCGGATTGACTTTTCTGGTCTTTATTGTGCAACTTTGACTATAATTTTCATGTATTCGTTACAAGACAAATACGATGATGCCATTTATACATATTCAATCAATATACTTTGATATATATTAATGGTCAAAGTCGTGCATAAAAAACCGCCTTATATTTTAGGAAAGAGGAAGTATAAATTAAGGATTTTCTCCGGGTTAAATGAAATTAACTCTTATTTTATTAATGTCCACACCGGAGGCCTCCCCCTTGTTAGAATCCTGACTCCATCCCTGATCACGGCTGTCCGGTTGGATGCCCACCAAGGCATTTTTCCTCTCCCCGTACATGTGCAAATGGATAGCGACCTTGGCAACCAAGAAAATGGATATCGACAAGATTCGTCAGACGAGTCAGCGACGAAGAACCTTGGCAACCAAGGCGCGCGGCAGCCACCGTGACGATCAAGTCAAATAATCATCTGACCTCGTGCTTCCGCTCACATCCGTCGTTTTCGTCCTGGACGAACCTTCACGCAGCTTTCTCCCCTCAGCTTCTCTCTCTTCGCCCCTCACAACTTATATATAAGTGTCGCACTACTAGATCCTCAAC

[SEQ ID NO：2]

如本文中所用，术语“分离的”应该理解为从其天然环境中分离或通过技术方法(例如重组DNA技术)产生。

如本文中所用，应用于SEQ ID NO：1(enst1基因)的术语“其功能变体”应该理解为与SEQ ID NO：1具有至少60％、62％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的多核苷酸，并且当使用下述方法在拟南芥植物中过表达时，其通常能够增强水杨酸诱导的细胞死亡。因此，所述功能变体是指当与第一多核苷酸的功能相比时，以不显著影响功能的方式从第一多核苷酸序列变化的任何第二多核苷酸，并且这样的功能变体可以是天然存在的，或者可以是非天然功能变体。图1中提供了与ENST1具有约94％的序列同源性的SEQ ID NO：1的功能性小麦变体-TaENST 1cs-4A(SEQ ID 26)、TaENST 1cs-4B(SEQ ID 27)和TaENST 1cs-4D(SEQ ID 28)。

如本文中所用，应用于SEQ ID NO：2(DON应答启动子)的术语“其功能变体”应该理解为与SEQ ID NO：2具有至少40％、42％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的多核苷酸，该多核苷酸是DON应答性的，并且能够使用下述方法促进拟南芥植物中ENST1基因的过表达。因此，所述功能变体是指当与第一多核苷酸的功能相比时，以不显著影响功能的方式从第一多核苷酸序列变化到的任何第二多核苷酸，并且这样的功能变体可以是天然存在的，或者可以是非天然功能变体。

在本说明书中，术语“序列同一性”应该认为是包含序列同一性和相似性，即与参考序列具有至少98％序列同一性的基因序列是其中任何98％的比对核苷酸至少是与参考序列中的相应残基相同或保守取代的基因序列。

在本说明书中，术语“植物材料”应该理解为包括植物细胞的植物的任何组成，包括植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物或来自植物的种子。“转基因种子”是指含有引入(理想地，稳定引入)其基因组中的转基因的种子。

在本说明书中，术语“细胞”应该理解为来自植物或真菌的细胞。典型地，所述细胞获自于单子叶植物或双子叶植物。在特别优选的实施例中，所述细胞是植物细胞，该植物细胞选自于由以下组成的组：拟南芥；马铃薯(即Solanum tuberosum)；烟草(Nicotiana tabaccum)；小麦；大麦；玉米和稻米；大豆；甘蓝型油菜。术语“转基因细胞”应该理解为包括引入(理想地稳定引入)转基因到其基因组中的细胞。通常，所述转基因是相对于细胞的外源性材料，或者其相对于细胞是内源性的，但是该细胞被改造以引入该转基因额外的拷贝。

在本说明书中，术语“植物”应该理解为单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是单子叶植物。在一个实施例中，所述植物来自禾本科或拟南芥属。在一个实施例中，所述植物是来自草的早熟禾亚科。在特别优选的实施例中，所述植物是谷类植物，通常是小粒谷物植物，优选地选自于由小麦；大麦；玉米；稻；马铃薯(即Solanum tuberosum)；烟草(Nicotiana tabaccum)；大豆；甘蓝型油菜(Brassica napus)组成的组。

在本说明书中，术语“重组构建体”应该理解为旨在用于将外源遗传物质转移到靶细胞中的多核苷酸构建体。它们有时被称为载体。所述构建体包括在植物细胞中作用的启动子区，其可操作地连接到本发明分离的多核苷酸。优选地，所述启动子是DON应答启动子。DON应答启动子的实例是SEQ ID NO：2的多核苷酸及其功能变体。所述构建体可以包括多个序列元件，包含多于一个的编码序列、启动子和选择性标记。通常，所述构建体或载体包括Ti质粒(或其片段)，其适当地含有T-DNA区，理想地含有至少一个或多个毒力基因。优选地，所述Ti质粒或其片段获得于农杆菌。合适地，将所述转基因引入Ti质粒的T-DNA区。更优选地，将所述转基因引入T-DNA区的左边界和右边界之间。所述Ti质粒可以包括选择性标记基因，尽管这不是必需的，因为例如可以通过高通量PCR快速检测转基因的成功转化。当使用时，所述选择性标记基因适当地包含在T-DNA区内部，并理想地可操作地连接到该转基因。

术语“在植物细胞中作用的启动子区”是指能够在用包括可操作连接到转基因的启动子的重组构建体转化的植物中驱动可操作连接的转基因表达的多核苷酸序列。通常，所述启动子能够驱动该转基因的过表达。启动子的实例包含玉米泛素启动子和35S花椰菜花叶病毒启动子。优选地，所述启动子是DON应答启动子。理想地，所述DON应答启动子包括SEQ ID NO：2的多核苷酸。

术语“DON应答启动子”是指在植物细胞中有功能并且应答霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇或DON类似物/衍生物而被活化的启动子区。DON应答启动子的实例是包括所述SEQ ID NO：2的多核苷酸的启动子区。由DON应答启动子驱动的基因的其它实例包括葡糖基转移酶和多重耐药性蛋白(Poppenberger等人，2003；Walter等人，2015)。

在本说明书中，术语“转化平台”应该理解为将转基因转移到细胞中所需的遗传机构，并且通常包括能够介导细胞转化并含有本发明重组构建体的生物体，例如细菌。转化平台的实例包括大肠杆菌、根癌土壤杆菌、粘着剑菌(E.adhaerens)和某些细菌“转座子(transbacter)”菌株。其它实例包括：基因枪转化和花浸渍。

在本说明书中，术语“转基因”应该理解为本发明的分离的多核苷酸及其功能变体。

在本发明的另一个实施例中，所述转基因可以促进非农艺性状的转移。

术语“可操作地连接”应该理解为在转化细胞中所述启动子将与转基因一起转移，并且该转基因将在启动子的控制下。

在本说明书中，术语“选择性标记”被认为是指当引入宿主DNA中时将给予有效转化的可检测信号的外源遗传物质片段。在优选的实施例中，所述选择性标记基因选自于包括：hph、新霉素磷酸转移酶II[NPT II/Neo])、aadA和tetR的组。适当的报告转基因可以包括GUS或GFP。

在另一个实施例中，所述转基因基因还用作选择性标记基因，其中由转化细胞展示的性状用作成功引入转基因的选择性标记。例如，所述转基因可给予对特定疾病或抗生素的抗性，其中所述转化的细胞可通过其能够在先前不可存活的条件下生长而被鉴定。典型地，抗生素抗性选自于对抗生素如潮霉素、卡那霉素、壮观霉素、四环素和氨苄青霉素的抗性。合适地，所述转基因给予对包含马铃薯枯萎病在内的疾病的抗性。

在优选的实施例中，所述转基因不与选择性标记基因连接，并且通过PCR/高通量基因测序检测所述转基因在转化植物中的成功引入。

优选地，所述Ti质粒含有一个或多个毒力基因，其中至少一个毒力基因通常选自于由virA、virB、virC、virD、virE、virG、virK和virJ或其功能变体组成的组。理想地，至少6、7或8种上述毒力基因包含在所述转化载体上。优选地，至少6、7或8种上述毒力基因形成所述Ti质粒的一部分。毒力基因的功能性变体是已经通过例如一个或多个核苷酸的修饰而被遗传修饰的毒力基因，例如在本领域中称为“定向进化”的过程中。

材料和方法

DNA、RNA提取和cDNA合成

按照厂商的说明书用试剂盒HP plant DNA迷你试剂盒(OMEGA)提取DNA。对小麦头部如先前所述(Ansari等人，2007)或对其它植物组织根据厂商的说明书使用RNeasy植物试剂盒(Qiagen)提取RNA。根据厂商的说明书使用TURBO DNA-free^TM试剂盒(Ambion Inc.，USA)对提取的总RNA进行DNA酶处理。通过用Nanodrop测量UV吸光度并在琼脂糖凝胶上电泳后分析RNA的质量、产量和完整性。通过PCR证实不存在DNA污染。如前所述(Walter等人，2008)进行总RNA的逆转录。

ENST1 mRNA的扩增和测序

ENST1的mRNA序列是使用从DON处理的小麦栽培品种CM82036的头部提取的RNA和GeneRacer TM试剂盒(Invitrogen)通过三次连续的RACE(cDNA末端的快速扩增)获得的。根据厂商的说明书，使用SuperScript^TM III RT(Invitrogen)将RNA去磷酸化、脱帽和逆转录。基因特异性引物详见补充表1。初始降落PCR反应(50μl终体积)含有200nM正向或反向基因特异性引物(GSP1引物)、600nM 5'或3'GeneRacer引物、1×高保真缓冲液、2.5U高保真度铂taq聚合酶(Invitrogen)、2mM MgSO₄、200μM的每种dNTP、1μl cDNA。PCR反应条件包括在94℃2分钟的初始变性步骤，然后是94℃30秒、72℃1分钟的5个循环；94℃30秒、70℃1分钟的5个循环；在94℃30秒的25个循环，最后在68℃30秒退火，72℃1分钟一个循环。随后两轮嵌套PCR(50μl体积)含有1μl的1:300稀释的嵌套PCR(50μl体积)，其含有1μl的1:300稀释的预扩增的PCR产物、2.5U LA Taq和1×TaKaRa LA Taq^TM Mg²⁺加缓冲液(Takara，Japan)、200μM dNTP(Gibco，UK)、200nM的5'或3'嵌套的GeneRacer引物和200nM的正向或反向嵌套基因特异性引物(GSP2)。PCR反应条件包括在94℃初始变性1分钟，然后是94℃30秒、65℃30秒和68℃2分钟的25个循环。最终延伸设定为68℃10分钟。将扩增的片段克隆到TOPO TA试剂盒(Invitrogen，UK)中并测序。

生物信息学分析

基于从RACE-PCR获得的序列，使用NCBI的ORF查找器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)推导开放阅读框(ORF)和编码序列(CDS)。结果通过BLASTn查询来自NCBI的GenBank中可用的cDNA序列、数据库KOMUGi(http://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/)、来自国际小麦基因组测序联盟的基因组序列(http://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository)和草图基因组集合(http://www.cerealsdb.uk.net/cerealgenomics/CerealsDB)获得的结果分析确认。所有的序列比对和序列分析用Multalin软件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)和Bioedit(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)进行。从该分析中，在本研究中克隆的ORF位于小麦染色体4A上，并且该变体命名为TaENST1-4A。同源基因和两个其它小麦变体(TaENST1-4B和TaENST1-4D)是从上述相同数据库加上国际大麦测序联盟(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/viroblast.php)和MIPS短柄草位点(http://mips.helmholtz-muenchen.de/proj/plant/jsf/brachypodium/index.jsp)的分析推导的。

克隆ENST1启动子区和产生启动子：GUS融合。

使用Universal Genome Walker试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA，USA)获得ENST1基因的启动子区(小麦栽培品种CM82036)的片段。使用Genome walker文库，我们用ENST1基因特异性引物和Advantage基因组聚合酶混合物(Clontech，Palo Alto，CA，USA)来准备初级和嵌套式PCR。基于TaENST1 cDNA序列设计所述基因特异性引物。嵌套的PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶纯化，并亚克隆到pCRR2.1-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，USA)中。然后将所述克隆的载体在Macrogen中测序。为了构建所述ENST1启动子::GUS质粒，我们使用正向引物5'GCTCTAGACTGCCTCTTGCGAGCGGGAAG-3'(SEQ ID 4)和反向引物：5'CAGGATCCCACTTCAGGCACTCTCTCTTTCTGTG-3'(SEQ ID 5)扩增启动子区。将所有扩增的DNA测序并确认其是正确的，然后使用Xba I-BamHI消化，并克隆到pBI101.1载体(Jefferson R A，1987)。

植物材料和生长条件

拟南芥登录Columbia Col-0用于本研究。使用gateway克隆策略(在补充表1中列出的引物组)，使用pDONR207(Invitrogen)以及随后pAM-PATgateway载体作为最终载体，产生在CaMV 35S启动子控制下表达ENST1(TaENST1-4A变体)编码序列的转基因植物(Col-0)(Bernoux等人，2008)。通过花浸渍方法(Logemann等人，2006)，进行在所述ENST1启动子控制下的ENST1表达或GUS表达的拟南芥的转化，并且在研究对BASTA的抗性(基因表达研究)或卡那霉素抗性(启动子研究)之后获得纯合系的选择。三个独立的纯合转基因系用于所述启动子融合和基因表达的研究。植物在土壤混合物2：2：1(多用途三叶草、John Innes Compost No 2和蛭石)上生长用于种子生产。在黑暗处4℃下分层三天后，将该植物在16h光照/8h黑暗的光周期、70％相对湿度、20-22℃的生长室中生长。

小麦栽培品种CM82036对FHB疾病和DON处理都是抗性的，由Hermann Buerstmayr博士(IFA Tulln，奥地利)友好地提供。如前所述(Ansari等人，2007)，成株在封闭环境条件下生长。在开花中期(生长期Zadoks 65)，用15μl的5mg/ml(即16.9mM)DON(Santa Cruz)0.02％吐温-20、20μl 10⁶分生孢子/ml的禾谷镰刀菌GZ3639(WT)或GTZ40(非DON生产者)0.02％吐温-20或对照处理(0.02％吐温-20)将所述头部接种到两个中央小花中。接种后，头部用塑料袋覆盖2天。在附图图例中所示的处理后不同时间收取处理的小穗。对于该时间过程实验，每个时间点对应于来自各个植物的4个头部的库。对于叶子处理，收集第二叶(生长期Zadoks 10)，放置在正方形培养皿中用10ml 0.67mM苯并咪唑浸湿的潮湿Whatman No.1滤纸(Whatman,UK)上，并用两片含0.67mM苯并咪唑的1％琼脂保持在它们的末端。用10μl 100μg/ml DON 0.02％吐温-20处理轻伤叶，并在生长室中在70％相对湿度、20-22℃下用16h光照/8h黑暗的光周期孵育。对于根处理，将幼苗植物在潮湿的Whatman滤纸上在20℃下发芽3天，然后放置在有Whatman滤纸的新培养皿中，该滤纸用6ml的20μg/ml DON 0.02％吐温-20(即67.5μM)或0.02％吐温-20(对照)浸湿。发芽幼苗在黑暗中20℃下孵育。对于收取，将所有不同的样品在液氮中快速冷冻，并在RNA提取之前在-70℃储存。

所述小麦栽培品种Fielder及其转基因衍生物用于疾病评估研究。过表达ENST的转基因小麦栽培品种Fielder如下产生。使用所述gateway克隆策略和pDONR207载体(Invitrogen)克隆ENST CDS；随后将该基因克隆入二元载体pSc4ActR1R2(在水稻肌动蛋白启动子的控制下)(McElroy等人，1990)。然后将重组质粒转化到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL-1中，并与未成熟小麦胚在23℃在黑暗中共培养2天(Ishida等人，2015)。除去胚轴后，基本上如前所述进行该植物材料的后续组织培养(Risacher等人，2009)。通过qPCR分析从再生的植株(plantlet)中分离的DNA，以确定相对于内部对照(Craze等人，在制备中)的nptII选择性标记基因的拷贝数。携带T-DNA(在OE-1和OE-2系中有1个拷贝；在OE-3系中有1-2个拷贝)和过表达ENST的T0转基因植物繁殖到T3代：植物生长在用16小时光照/8小时黑暗的光周期在20-22℃、300μmol m^-2s^-1、70％相对湿度的封闭环境条件下，如前所述(Ansari等人，2007)。通过测试所述构建体的存在-不存在并计算每代中的分离比来分析纯合性。选择转基因系OE-1、OE-2和OE-3用于禾谷镰刀菌研究，基于与野生型植物相比，它们分别表现出ENST基因表达的218、445和80倍增加。

真菌培养接种物

在绿豆肉汤中(Bai和Shaner，1996)产生禾谷镰刀菌野生型GZ3639和单端孢霉烯-负性突变体衍生物GZT40的无性分生孢子接种物(大分生孢子)(Proctor等人，1995)，并收取、洗涤并调节至10⁶分生孢子/ml，全部如前所述(Brennan等人，2005)。

实时和半定量RT-PCR分析

使用Stratagene Mx3000TM实时PCR进行实时RT-PCR(qRT-PCR)分析。每个反应用1.25μl的1：5(v/v)稀释的第一cDNA链0.2μM每种引物1XPremix Ex Taq^TM(Tli RNase H plus，RR420A，Takara)进行，其总反应体积为12.5μl，具有以下条件：在95℃1分钟的1个循环；在95℃5秒和在60℃20秒的40个循环；以及在95℃1分钟、55℃30秒和95℃30秒的最终循环，用于解离曲线。通过解离曲线的分析和通过扩增产物大小的可视化来验证扩增特异性。小麦α-微管蛋白(gb：U76558.1)(Xiang等人，2011)用作管家基因并且经验证不受用于我们的分析和可用的微阵列表达数据(PLEXdb)的处理的影响。所有实时RT-PCR分析进行两次重复(从独立逆转录产生的两个cDNA)。如先前所述(Livak和Schmittgen，2001)，使用通过实时RT-PCR获得的阈值循环(C_T)值来使用公式2^{-(CT靶基因-CT管家基因)}计算相对基因表达。

对于半定量RT-PCR(sqRT-PCR)，通过用拟南芥属肌动蛋白8基因的PCR扩增来校准模板，然后用与TaENST1-4A的CDS匹配的引物组测定转基因的表达。热循环参数为5分钟95℃；在45秒95℃、45秒60℃、45秒72℃的30或35个循环；以及5分钟72℃的最终延伸。用safeView核酸染色(NBS-SV)染色后，在UV光下在1.5％琼脂糖凝胶上电泳迁移后显现PCR产物。使用的引物组列于补充表1中。用于TaENST1-4A的引物组被设计为对染色体4A ENST1变体是特异性的，并且不与用于所述VIGS的基因片段重叠。通过对相应产物测序来验证特异性。

病毒诱导基因沉默(VIGS)

本研究中使用的大麦条纹花叶病毒(BSMV)衍生的VIGS载体由野生型BSMV ND18α、β、γ三联基因组(Scofield等人，2005；Holzberg等人，2002)组成。VIGS分析用于沉默ENST1，其与TaENST1-4A具有100％同源性，但是我们不能排除潜在地影响两个其它变体TaENST1-4B和TaENST1-4D(每个91％的同源性)。使用引物组VIGS Pac1用于/VIGS Not1rev(表1)从TaENST1-4A的保守结构域扩增用于VIGS的片段，并克隆到pGEM-T载体(pGEM-T Easy克隆试剂盒；Promega)中。通过用NotI和PacI消化来释放片段，通过凝胶提取纯化并以反义方向连接到NotI/Pac1-消化的BSMVγ载体pSL038-1中(Scofield等人，2005)。通过测序验证带有沉默片段(BSMV：TaENST1)的pSL038-1质粒。含有大麦八氢番茄红素去饱和酶基因(BSMV：PDS)的185bp片段的BSMVγ载体构建体用作VIGS的阳性对照，并且之前已经描述过(Scofield等人，2005)，沉默导致植物过早漂白(结果未显示)。含有不具有植物片段(BSMV：00)或具有BSMV：ENST1和BSMV：PDS的BSMVα、γ基因组的载体用MluI线性化。具有BSMVβ基因组的载体用SpeI线性化。使用mMessage mMachine T7体外转录试剂盒(AM1344，Ambion)根据厂商的方案从线性化质粒制备加帽的体外转录物。在第一个小麦头部出现之前，将小麦栽培品种CM82036的植物旗叶按照描述的方案(Scofield等人，2005)用BSMV构建体摩擦接种。用BSMVα、β和γRNA(BSMV：00)的体外转录物或含有植物片段(BSMV：PDS或BSMV：TaENST1)的衍生物γRNA的1:1:1混合物进行摩擦接种。在开花中期，如上所述用DON或对照(模拟处理)处理BSMV感染植物的头部的两个中央小穗。在处理的小穗上方的第三小穗在DON处理后24小时取样，在液氮中快速冷冻，并在通过实时RT-PCR分析进行沉默确认之前储存在-70℃。在DON接种后14天评估受损(褪色和坏死)小穗(包含处理的小穗)的数量。在两次重复实验的每一次中对16个小穗(8株植物)进行每种处理组合。

分离叶病评估研究

如前所述(Browne和Cooke，2004)，使用小麦栽培品种Fielder和过表达TaENST的转基因系进行分离叶病试验。从3叶期植物的第二叶(生长期13；(Zadoks等人，1974))切下8cm切片。将叶切片放置在培养皿(90mm直径)的表面上且其近轴侧面向上。将切割的末端放置在含有0.5mM苯并咪唑的1％植物琼脂pH5.7(Duchefa)的夹层之间(从该板的中心移除琼脂，以防止在叶接种点过量的真菌生长)。将每个叶切片的中心穿孔，并用4μl的0.02％吐温-20(模拟)小滴处理或用增加10⁶分生孢子/ml的禾谷镰刀菌菌株GZ3639或10⁶分生孢子/ml菌株GZ3639加75μM DON的这种溶液处理。将板在20℃下在16小时光照/8小时黑暗的循环下孵育。接种后4天分析叶切片。使用FIJI软件拍照叶切片并估算病害叶面积(Schindelin等人，2012)。将叶切片浸入水中并剧烈涡旋，并使用血细胞计数器(Hycor Biomedical)对产生的大分生孢子进行计数。有三个生物学重复，每个包含6个板每种处理，每个板包含两个叶片段每种小麦基因型。

对t的FHB评估和DON研究

培养小麦栽培品种Fielder和过表达TaENST的转基因系，并用20μl的10⁶分生孢子/ml禾谷镰刀菌菌株GZ3639或吐温-20(模拟)(FHB实验)如上所述处理头部(VIGS)。通过在接种后7、14和21天对受感染的小穗的数目进行视觉评分来计算感染水平，并且将数据用于计算疾病进展曲线下的面积(AUDPC)(Shaner，1977)。有三个生物学重复，每个包含至少20个头部(10株植物)每种处理。

根毛测定

根毛测定如前所述进行(Kacprzyk等人，2014)。简言之，将5天龄的幼苗用65μM SA溶液处理，并在22℃下在恒定光照下孵育直到得分。通过用荧光素二乙酸酯(FDA)染色和在波长485nm激发荧光素发射的显微镜下检查根毛活力来评估凋亡型程序细胞死亡(AL-PCD)。当具有浓缩的细胞内容物并且原生质体从细胞壁缩回时，进一步检查FDA染色阴性的根毛并记分为程序性细胞死亡(PCD)(与没有缩回的细胞质的坏死细胞相反，因此在光学显微镜下与活细胞相比没有可区分的形态)。每个类别的百分比计算为对至少三次重复平均的得分的根毛总数(约100)的百分比。

GUS分析

将幼苗如上所述(Poppenberger等人，2003)在DON或模拟处理中孵育，并且在模拟或DON处理中孵育后的各个时间点进行GUS染色。根据公开的方法(Jefferson R A，1987)进行组织化学染色。

统计分析

所有的统计分析使用SPSS统计版本20软件(SPSS)进行。用Shapiro-Wilk检验评价数据分布的正态性。在基因表达、分生孢子产生、DON和镰刀菌赤霉病数据集的情况下，使用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis检验比较各个处理。来自分离叶实验的正态分布的感染叶面积数据通过结合Tukey's HSD检验的ANOVA以0.05的显著性水平进行评估。

结果

ENST1分析

使用RACE-PCR方法，我们克隆了来自于小麦栽培品种CM82036的ENST1 ORF。生物信息学分析显示推导的CDS与所述中国春染色体4A中的序列具有100％的核苷酸同源性。于是，我们将该基因命名为TaENST1-4A。位于中国春染色体4B(TaENST1cs-4B)和4D(TaENST1cs-4D)上的存在于小麦基因组中的两个其它变体被鉴定为与TaENST1-4A具有高同源性(图1)。进一步的分析显示TaENST1-4A序列与任何特征基因或蛋白质没有显著的同源性。TaENST1-4A的同源物仅在禾本科(小麦、大麦、羊茅属植物(Festuca)、山羊草(Aegilops)和短柄草)中发现(图2A)。在蛋白质水平上，TaENST1-4A与两种其它小麦变体和节节麦具有≥90％、与大麦具有87％、与羊茅属植物具有67％以及与短柄草具有45％的同一性(图2B)。

ENST1对程序性细胞死亡的影响

为了理解ENST1如何参与DON抗性，使用所述pAM-PAT载体(注意在拟南芥中没有内源ENST1同源物)产生在所述CaMV 35S启动子控制下表达ENST1保守结构域的拟南芥转基因系。在本研究中使用三个独立的纯合系OE-1、OE-2和OE-20。首先通过PCR对所述T-DNA的存在进行特征验证(图3A)，然后通过RT-PCR确认转基因系的正确ENST1过表达(图3B)。这些ENST1表达系在正常植物生长条件下没有表现出形态或发育改变(数据未显示)。

SA的外源性应用诱导不同植物和组织中的程序性细胞死亡(PCD)，如拟南芥中的根毛。使用根毛测定法测试SA诱导的PCD是否在ENST1表达者中改变。在条件对照(水处理)中，在处理一天后测量根毛中的细胞死亡，并显示在不同植物之间没有差异的PCD的基础水平(图4)。在SA处理后，在WT植物中观察到PCD的显著诱导。但SA在表达ENST1的植物中诱导显著更高的PCD(图4)。ENST1表达不增强由热诱导的细胞死亡(图4)，表明其不是对细胞死亡的一般效应，而是对包含至少水杨酸的特定处理是特异性的。

ENST1启动子和基因表达的表征

为了证实ENST1对毒素DON有应答，使用实时RT-PCR测定(对TaENST1-4A特异性)测量用所述毒素处理的不同小麦组织中的基因表达水平。在模拟处理的样品中ENST1的基础表达非常低或者几乎不可检测，相反在用所述毒素处理的所有组织中观察到高表达(图5A)。为了确定ENST1基因表达是否由脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生者禾谷镰刀菌(菌株GZ3639)诱导，在真菌接种后的最初几天内测量用真菌感染的小穗中的表达水平。结果表明ENST1在接种后1天(接种后天数(dpi))被早期诱导；在2dpi具有诱导峰值，随后返回到基本水平(图5B)。在相同的实验中，我们分析了GZ3639的DON非产生突变体衍生物(即GZT40)对ENST1表达的影响。在接种后的所有天，GZT40对ENST1表达的诱导非常低(图3B)。因此，我们推断ENST1是早期宿主对镰刀菌属真菌产生毒素的应答的一个组成部分。在DON或模拟处理中孵育后，在所述ENST1启动子(上游序列)的控制下表达GUS基因的转基因植物对GUS活性染色。如图6所示，活性是DON和组织依赖性。

TaENST增强小麦叶对禾谷镰刀菌的抗性

使用分离叶测定，相对于野生型植物，评价禾谷镰刀菌(菌株GZ3639)在过表达TaENST的转基因系OE-1、OE-2和OE-3上的传播和孢子形成。与野生型植物相比，过表达者中的疾病和孢子形成减少。因此，TaENST的过表达增强了小麦对禾谷镰刀菌定殖的抗性(图8)。TaENST的过表达延缓了FHB疾病症状的传播

评价了TaENST过表达对来自接种的小麦头部的中央小穗的FHB症状的传播的影响。结果表明，野生型栽培品种Fielder在处理后21天有平均5.1个病斑的小穗。所有三个转基因系显示较少的疾病传播；相对于野生型植物，OE-1和OE-2分别观察到显著减少23％和17％。在处理后21天观察到的OE-3的减少不显著，但是，如OE1，OE3系的疾病进展(用7、14和21dpi的疾病评分计算AUDPC评估)显著低于野生型植物(WT)。总体上，结果表明TaENST的过表达提供了对FHB的定量抗性。(图9)

ENST1在DON抗性中的作用

我们使用病毒诱导基因沉默(VIGS)来测试ENST1在小麦抗DON中起作用的假说。我们用靶向ENST1或PDS(阳性对照)或无基因(阴性对照)的VIGS构建体处理植物用于沉默。在主要头部出现之前，将构建体施用于抗毒性小麦栽培品种CM82036的旗叶。大约两个星期后，在中间开花期用DON(16.9mM)或模拟0.2％吐温20处理两个中央小穗。在1dpi，除去已经处理的一个小穗上面的一个，并用于使用实时RT-PCR测量ENST1(TaENST1-4A变体)的表达水平。如前所示，在非毒素处理的植物(模拟)中观察到非常低的ENST表达，无论是在对照(BSMV：00)还是沉默植物(BSMV：ENST1)(图7A)中。在所述模拟BSMV：00-处理的植物中，通过DON将ENST1诱导43倍。但是，由于BSMV：TaENST1植物处理导致的ENST1沉默将DON诱导降低了77％(与Don处理的、BSMV：00处理的植物相比)(图7A)。这些表明ENST1的基因沉默在DON处理的小麦头部中是有效的。我们测量了毒素处理后14天DON对植物的表型效应。用BSMV：TaENST1处理的植物对于DON诱导的小穗损伤比非沉默植物BSMV：00更敏感(图7B和7C)。ENST1沉默小穗的数目显示DON诱导的损伤显著大于BSMV：00处理的(2.5倍增加)。因此表明ENST1在DON抗性中的直接作用。

表1.本研究中使用的引物。

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