生物技术制备甲基化的肉桂酸和肉桂酸酯、甲基化的苯乙胺和其偶联产物的方法与流程

本发明涉及用于利用4′-o-甲基转移酶、必要时与s-腺苷甲硫氨酸合成酶或3′-o-甲基转移酶和其他酶组合来制备3,4-甲基化的肉桂酸、3,4-甲基化的肉桂酸酯、3,4-二甲氧基苯乙胺和4-甲基肉桂酸酰胺的发酵方法和生物技术方法。此外，本发明涉及载体体系和重组的微生物或真菌，所述重组的微生物或真菌能够编码/表达用来执行本发明的酶以及涉及为此适合的核酸片段和多肽。此外，本发明涉及组合物，所述组合物通过根据本发明的方法获得。
背景技术：
：在调味剂的工业生产领域中，对于合成所述调味剂的高效的和成本低的途径存在持续的需求。甲基化的肉桂酸和肉桂酸酯、甲基化的苯乙胺和其偶联产物、尤其是肉桂酸酰胺的偶联产物是这类调味剂的实例。示例性的肉桂酸酰胺是罗宾红素(rubemamin)。罗宾红素作为天然材料在植物花椒草中被鉴定出。然而，现在仍没有描述过用于制备所述专门的物质以及其直接的前体的生物技术方法。从现有技术已知：咖啡酸通过不同的咖啡酰-辅酶a-o-甲基转移酶(ccaomt)或邻苯二酚-o-甲基转移酶(comt)和形成ccaomt或comt的转基因微生物来转化(fellenberg,c.等tapetum-specificlocationofacation-dependento-methyltransferaseinarabidopsisthaliana.plantj.56,132–45(2008)；ibdah,m.,zhang,x.-h.,schmidt,j.&vogt,t.anovelmg(2+)-dependento-methyltransferaseinthe phenylpropanoidmetabolismofmesembryanthemumcrystallinum.j.biol.chem.278,43961–72(2003))。在此，3′位总是被修饰并且仅形成阿魏酸。迄今已经证实：4′位的甲基化能够仅对于木质醇单体和类苯基丙烷借助源于仙女扇(clarkiabreweri)的(异)丁香酚甲基转移酶的变体(us8,889,392b2,zhang,k.等anengineeredmonolignol4-o-methyltransferasedepressesligninbiosynthesisandconfersnovelmetaboliccapabilityinarabidopsis.plantcell24,3135–52(2012))以及借助苯基丙烯上的其他的o-甲基转移酶、如胡椒酚或紫丁香酚展示出(gang,d.r.等characterizationofphenylpropeneo-methyltransferasesfromsweetbasil:facilechangeofsubstratespecificityandconvergentevolutionwithinaplanto-methyltransferasefamily.plantcell14,505–519(2002))。用于苯乙胺、例如多巴胺、3-甲氧酪胺3-羟基-4-甲氧基-苯乙胺的酶促的全甲基化的方法是未知的。已经描述了：通过多巴脱羧酶以及通过产生所述酶的转基因微生物将左旋多巴转化成多巴胺(facchini等plantaromaticl-aminoaciddecarboxylases:evolution,biochemistry,regulation,andmetabolicengineeringapplications.phytochemistry54,121–38(2000))。通过3′-o-甲基转移酶(3-omts)将获得的多巴胺进行修饰同样是已知的，其中3-甲氧酪胺形成为产物(lotta,t.等kineticsofhumansolubleandmembrane-boundcatecholo-methyltransferase:arevisedmechanismanddescriptionofthethermolabilevariantoftheenzyme.biochemistry34,4202–4210(1995))。此外，能够显示出：4-甲氧基酪胺也通过源于德尔塔(delta)变形菌粘细菌的酶safc的活化从多巴胺产生(nelson,j.t.,lee,j.,sims,j.w.&schmidt,e.w.characterizationofsafc,acatechol4-o-methyltransferaseinvolvedinsaframycinbiosynthesis.appl.environ.microbiol.73,3575–80(2007))。然而，还未证明通过借助转基因微生物或真菌的生物转化或通过酶促转换在形成3,4-二甲氧基苯乙胺的情况下始于多巴胺、3-甲氧酪胺和/或3-羟基-4-甲氧基酪胺来全甲基化形成。此外，已知的是：s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)能够用于产生 s-腺苷甲硫氨酸(sam)。迄今仅为了形成类黄酮而不为了形成甲基化的肉桂酸以及苯乙胺而显示出：用s-腺苷甲硫氨酸合成酶与o-甲基转移酶的组合的表达以改进地提供辅助因子s-腺苷甲硫氨酸(sung,s.h.optimizationofrhamnetinproductioninescherichiacoli.j.microbiol.biotechnol.21,854–857(2011))。通过4-香豆酸:辅酶a连接酶的活化形成肉桂酸的辅酶a酯同样是已知的(lindermayr,c.等divergentmembersofasoybean(glycinemaxl.)4-coumarate:coenzymealigasegenefamily.eur.j.biochem.1315,1304–1315(2002))。然而，迄今已经仅针对未全甲基化的底物、如阿魏酸和多巴胺显示出：通过酪胺-n-羟基肉桂酰转移酶将胺与形成的辅酶a酯进行连接反应(yu,m.&facchini,p.j.purification,characterization,andimmunolocalizationofhydroxycinnamoyl-coa:tyraminen-(hydroxycinnamoyl)transferasefromopiumpoppy.planta209,33–44(1999))。基于肉桂酸和左旋多巴起始的合成方法不是已知的。此外，在由现有技术中已知的方法中就本发明而言无法理解为用于制备肉桂酸酰胺的生物技术方法、尤其适合用于工业制备肉桂酸酰胺的方法，因为估计产量非常低(例如215mg/lkang,k.&back,k.productionofphenylpropanoidamidesinrecombinantescherichiacoli.metab.eng.11,64–68(2009))。因此，存在建立如下生物技术方法的需求、即发酵方法和酶促方法，所述发酵方法和酶促方法至少在一个步骤中设有重组的生物的使用，所述重组的生物适合用于工业使用，以便由此以充足的规模可复现地提供甲基化的肉桂酸和苯乙胺及其衍生物和其偶联产物。技术实现要素：因此，本发明的目的在于：提供发酵方法和酶促的生物技术方法以及为此所需的重组的生物、核酸片段、多肽和载体体系，通过其在酰胺偶联条件下、即在所述合成途径的不同层面上由(i)和(ii)构成组合生物合成途径的条件下能够大规模生产(i)甲基化的肉桂酸和肉桂酸酯，(ii)甲基化的苯乙胺和(iii)肉桂酸酰胺、例如罗宾红素。该目的通过提供用于利用至少一种4′-o-甲基转移酶在重组的微生物或真菌中制备天然的3,4-甲基化的肉桂酸、3,4-甲基化的肉桂酸酯、3,4-二甲氧基苯乙胺和肉桂酸酰胺的生物技术方法和为此所需的工具来实现。通过代谢工程建立且能够用于所述生物技术方法的其他的酶包括s-腺苷甲硫氨酸合成酶或3′-o-甲基转移酶以及必要时脱羧酶、4-香豆酸：辅酶a连接酶(cl)和酪胺-n-羟基肉桂酰转移酶(tht)。反应能够在如下条件下完全发酵地或发酵地以及酶促地或完全酶促地进行，所述条件为总是使用通过根据本发明的方法制备的酶。此外，公开了适合的重组的微生物和真菌和载体体系、核酸片段和多肽，它们适合用于执行根据本发明的方法。在本发明的第一方面中，基于羟基肉桂酸或在半纤维素上酯化的羟基肉桂酸利用4′-o-甲基转移酶(4-omt)以及必要时附加地3′-o-甲基转移酶(3-omt)和s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)获得3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯。在所述方面的一个实施方式中，反应能够纯发酵地进行。在另一实施方式中，反应物的最终的反应酶促地进行。在本发明的第二方面中，基于多巴胺和/或l-二羟基苯丙氨酸或其前体或其衍生物利用4-omt和3-omt获得3,4-二甲氧基苯乙胺。在所述方面的一个实施方式中，反应能够纯发酵地进行。在另一实施方式中，反应物的最终的反应酶促地进行。在本发明的第三方面中，基于羟基肉桂酸或在半纤维素上酯化的羟基肉桂酸以及由多巴胺和/或l-二羟基苯丙氨酸或其前体或其衍生物利用4-omt、4-香豆酸:辅酶a连接酶(cl)和酪胺-n-羟基肉桂酰转移酶(tht)以及必要时其他的多肽或编码所述多肽的核酸获得4-甲基肉桂酸酰胺。在所述方面的一个实施方式中，反应能够纯发酵地进行。在另一实施方式中，反应物的最终的反应酶促地进行。在所述方面的一个实施方式中，发酵反应中的酰胺偶联利用cl和tht进行。在另一实施方式中，酶促反应中的酰胺偶联通过连接酶进行。在此，酰胺偶联的酶促步骤能够通过连接酶来催化。在所述方面的另一实施方式中，酰胺偶联以关于4′-o-甲基化和可选的3′-甲基化的反应步骤的任意顺序进行。此外，公开了重组的微生物和真菌，所述重组的微生物和真菌具有对于执行根据本发明的方法所必需的载体或载体体系进而编码核酸以执行根据本发明的方法。此外公开核酸片段和多肽，所述核酸片段和多肽专门适合用于在此公开的方法。此外，提供组合物，所述组合物包括方面三的根据本发明的方法的产物。本发明的方面和实施方式从下列详细的描述和实例、附图、序列记录和所附的权利要求中得出。附图说明图1示出具有基因的质粒sym_omt_sams，所述基因编码4′-o-甲基转移酶和s-腺苷甲硫氨酸合成酶编码。图2示出具有基因的质粒psym_omt1_omt2，所述基因编码3′-o-甲基转移酶和4′-o-甲基转移酶编码。图3示出具有基因的质粒psym_ddc_omt1_omt2，所述基因编码脱羧酶、3′-o-甲基转移酶和4′-o-甲基转移酶。图4示出具有基因的质粒psym_ddc，所述基因编码脱羧酶。图5示出具有基因的质粒psym_4cl2_tht，所述基因编码4-香豆酸:辅酶a连接酶和酪胺-n-羟基肉桂酰转移酶。图6示出阿魏酸生物催化转换成3,4-二甲氧基肉桂酸。图7示出通过o-甲基转移酶与s-腺苷甲硫氨酸合成酶的联合表达来增加地形成3,4-二甲氧基肉桂酸。图8示出左旋多巴到3,4-二甲氧基苯乙胺的酶促转化的液相色谱-质谱联用色谱(lc-ms色谱)。图9示出多巴胺到3,4-二甲氧基苯乙胺的酶促转化的液相色谱-质谱联用色谱(lc-ms色谱)。图10示出左旋多巴到3,4-二甲氧基苯乙胺的发酵转化的高效液相色谱。图11示出由巴胺到3,4-二甲氧基苯乙胺的发酵转化的高效液相色谱。图12示出(e)-3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-n-[2-(4-羟苯基)乙基]2-丙烯酰胺到(e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羟苯基)乙基]2-丙烯酰胺的酶促转化的液相色谱-质谱联用色谱(lc-ms色谱)。图13示出(e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羟苯基)乙基]2-丙烯酰胺到二甲氧基肉桂酰甲氧酪胺的酶促转化的液相色谱-质谱联用色谱(lc-ms色谱)。图14示意性示出用于基于肉桂酸以及从左旋多巴制备罗宾红素的生物合成途径。在此，首先在通过连接酶或辅酶连接酶(cl)和tht的酰胺偶联之前的最后步骤中聚合肉桂酸途径和左旋多巴途径。图15示意性示出从肉桂酸以及从左旋多巴开始用于制备罗宾红素的其他合成途径。在此，酰胺偶联和进而在肉桂酸途径中两种起始途径的结合已经在omt活化之前发生。在此预先完成连接酶或辅酶连接酶(cl)和tht的添加。图16示意示出用于基于肉桂酸以及从左旋多巴制备罗宾红素的其 他合成途径。在此，酰胺偶联进而这两个起始途径的结合在肉桂酸成分甲基化之前已经通过添加连接酶或辅酶连接酶(cl)和tht进行。图17示意性示出用于基于肉桂酸以及左旋多巴制备罗宾红素的其他合成途径。在此，酰胺偶联和进而这两个起始途径的结合在肉桂酸甲基化之后，但在多巴胺甲基化之前通过添加连接酶或辅酶连接酶(cl)和tht进行。图18以比较的方式示出借助cbmomt和借助由其制造的突变将阿魏酸反应成3,4-二甲氧基肉桂酸。具体实施方式公开的肉桂酸能够要么以其游离形式，要么在半纤维素上酯化的形式存在，所述半纤维素例如作为植物细胞壁的组成部分存在。核酸必要时能够密码子优化，即基因的密码子使用匹配于选择作为表达株的重组的微生物或真菌，所述核酸根据本发明用来表达期望的靶蛋白。对于本领域的技术人员已知的是：期望的靶基因，能够不改变翻译的蛋白质序列而被修饰，以便考虑特定的物种相关的密码子使用，所述靶基因关注于编码蛋白。因此，本发明的要转化的核酸能够专门匹配大肠杆菌或其他细菌的密码子使用、酵母菌属或其他酵母的密码子使用、木霉属或其他真菌的密码子使用。如在此使用的术语后代根据本公开，在重组的微生物或真菌的上下文中称作这种生物的后代，所述生物通过包括有性繁殖法和无性繁殖法的自然的再生的生殖过程从初始源生物中产生。本领域的技术人员已知的是：在繁殖过程中突变能够以天然的方式引入生物的基因组中，由此后代与亲本生物在基因组方面不同，然而仍能够例如归于相同的(亚)种。因此，根据本公开的术语后代也包括这类通过自然过程被改变的后代。如在此使用的术语载体体系称作体系，所述体系由至少一个或多个 载体或质粒载体构成或包含所述载体或质粒载体。因此，载体体系能够包含(质粒)载体，所述(质粒)载体编码两种不同的靶基因。此外，载体体系也能够包含多个(质粒)载体，所述多个(质粒)载体就其而言包含根据本公开的至少一个靶基因。因此，载体体系能够仅包含一个(质粒)载体构建体或多个(质粒)载体构建体，其中后者能够同时或依次地稳定地或暂时地转化成相应的重组的宿主，使得由各个构建体编码的靶基因能够由宿主转录和翻译。本领域的技术人员已知的是：重组的微生物或真菌或蛋白质或酶的培育和培养、分离和纯化，所述蛋白质或所述酶由根据本发明公开的核酸编码。由于在此公开的基因产物的持续的酶促功能，术语蛋白质、多肽和酶可交换地使用。用于本公开的目的的术语基因和核酸(片段)同样可交换地使用。每当本公开涉及以百分比表示形式表示的核酸序列或蛋白质序列的序列同源性或序列同一性，所述表示形式就涉及数值，如其所述值能够对于核酸序列计算使用embosswater成对序列比对(核苷酸)(http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_water/nucleotide.html)或对于氨基酸序列计算使用embosswater成对序列比对(蛋白质)(http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_water/)。在由欧洲分子生物学实验所(embl)欧洲生物信息学研究所(ebi)提供的局部成对序列比对工具中，使用修改的smith-waterman算法(见http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/和smith,t.f.&waterman,m.s.“identificationofcommonmolecularsubsequences”journalofmolecularbiology,1981147(1):195-197)。此外，在此，在利用修改的smith-waterman算法执行两个序列的相应成对的比对的情况下，参考由embl-ebi当前给出的默认参数。这是(i)用于氨基酸序列：基体＝blosum62，空位出现罚分(gapopenpenalty)＝10和空位延长罚分(gapextendpenalty)＝0.5以及(ii)用于核酸序列：基体＝完整dna，空位出现罚分＝10和空位延长罚分＝0.5。根据本发明的第一方面，基于羟基肉桂酸或半纤维素上酯化的羟基肉桂酸利用4′-o-甲基转移酶(4-omt)和s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)获得3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯。所述反应通过提供重组的微生物或真菌进行，所述重组的微生物或真菌包含(a1)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码4′-o-甲基转移酶(4-omt)的基因或由其构成，和(a2)可选的核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码3′-o-甲基转移酶(3-omt)的基因或由其构成，和(b)可选地用于发酵生产的核酸片段，所述核酸片段包括编码s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)的基因或由其构成构成，以及在允许核酸片段表达的条件下培养重组的微生物或真菌以获得相应的表达产物；可选地分离以及必要时纯化获得的表达产物，并且将一种或多种羟基肉桂酸、优选添加咖啡酸或阿魏酸，和/或一种或多种其前体或一种或多种其衍生物、尤其在半纤维素上酯化的咖啡酸或阿魏酸的前体或衍生物添加至根据步骤(ii)的培养的重组的微生物或真菌以用于发酵反应或添加至根据步骤(iii)的表达产物以用于酶促反应；并且在实现将羟基肉桂酸或前体或其衍生物反应成3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯的条件下培养或孵育重组的微生物或真菌或表达产物，以获得相应的3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯；以及可选地分离和必要时纯化获得的3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯以及可选地必要时分离和纯化上述其他副产物。羟基肉桂酸能够以其游离的形式或酯化的形式存在。羟基肉桂酸的酯存在于例如植物细胞壁中。在工业规模中作为重组的生物适合用于生产根据本发明的所有方面的靶蛋白的微生物以及真菌，对于本领域的技术人员是已知的并且优选包括、但不限于：大肠杆菌属、例如大肠杆菌bl21、大肠杆菌mg1655、大肠杆菌w3110和其后代，芽孢杆菌属、例如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌和其后代，酵母菌属、例如酿酒酵母和其后代，汉逊酵母属或毕赤酵母属、例如毕赤酵母和多形汉逊酵母和其后代，克鲁维酵母菌属、例如乳酸克鲁维酵母和其后代，米曲霉菌属、例如米曲 霉菌、构巢曲霉或黑曲霉和其后代，或木霉属、例如里氏木霉或哈茨木霉和其后代。用来培育和培养根据本公开的重组的微生物和真菌的方法是本领域的技术人员已知的，所述方法允许根据所述公开的核酸片段的表达以及根据本发明的反应物与公开的酶的反应。用于根据本发明的所有方面的使用的4′-o-甲基转移酶(4-omts)由于其底物特异性和区域选择性而能够：催化游离的或酯化的羟基肉桂酸的、或l-二羟基苯丙氨酸的或其前体或其衍生物的、或游离的或酯化的羟基肉桂酸或l-二羟基苯丙氨酸或其前体或其衍生物的偶联产物的4′-o-基团的甲基化。优选编码本发明的4-omt的核酸包括选自下述的核酸：seqidno.：5、6、7、8、9、15、17、18和85，以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。优选4-omt多肽包括如下4-omt多肽，所述4-omt多肽由根据本发明的核酸编码，优选的4-omt多肽选自：seqidno.：25、26、27、28、29、35、37、38和86以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述4-omt多肽尽管被修饰，但仍满足相同的酶促功能、如具有相应的seqidno.的未被修饰的多肽。所列出的核酸序列能够例如是密码子优化的或密码子截短的，或所述核酸序列能够包含有定向点突变。关于seqidno.35，优选的点突变位于133位置或322位。优选的点突变是l322n(见seqidno.:8和28)或t133s(见seqidno.:9和29)或这两种突变的结合(s根据相应的核酸或多肽序列为eqidno.:85和86)。用于根据本发明的所有方面的使用的3′-o-甲基转移酶(3-omts)由于其底物特异性和区域选择性而能够：催化游离的或酯化的羟基肉桂酸的、或l-二羟基苯丙氨酸的或其前体或其衍生物的、或游离的或酯化的羟基肉桂酸或l-二羟基苯丙氨酸或其前体或其衍生物的偶联产物的 3′-o-基团的甲基化。优选3-omt多肽包括如下3-omt多肽，所述3-omt多肽由根据本发明的核酸编码，优选的3-omt多肽选自：seqidno.：3、4、16、19和20以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。由根据本发明的核酸编码的优选的3-omt多肽在如下条件下选自：seqidno.：23、24、36、39和40以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述条件为关于分别列出的seqidno.具有相应的同源性程度的序列仍满足与具有相应的seqidno.的相应未被修饰的多肽相同的酶促功能。所提出的核酸序列能够例如是密码子优化的或密码子截短的，或所述核酸序列能够包含定向点突变。根据本发明的方法的3-omt的使用对于其中3′-甲基化已经存在于反应物中的方法是可选的。用于根据本发明的所有方面的使用的s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)由于其物质特异性和区域选择性而能够：催化atp和甲硫氨酸反应成s-腺苷甲硫氨酸。优选核酸包括这样的核酸，编码本发明的sams的核酸包括选自下述的核酸：seqidno.：10、65、67、69和71以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。由根据本发明的核酸编码的优选的sams多肽在如下条件下选自：seqidno.：30、66、68、70和72以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述条件为关于分别列出的seqidno.具有相应的同源性程度的序列仍满足与具有相应的seqidno.的相应未被修饰的多肽相同的酶促功能。所提出的核酸序列能够例如是密码子优化的或密码子截短的，或所述核酸序列能够包含定向点突变。如也本发明的所有其他方面中那样，添加编码s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)的基因在所述基因中引起改进地提供s-腺苷甲硫氨酸，这能够提高相应工艺的产量。在本发明的所述方面和所有其他方面的一个实施方式中，反应能够纯发酵地进行。根据所述实施方式，目的核酸在重组的微生物或真菌中表达并且产物的反应在活体内在重组的微生物或真菌体中进行。在本发明的所述方面和所有其他方面的另一实施方式中，反应物的最终反应酶促地进行。在此，目的核酸首先在重组的微生物或真菌中表达。然后，如此获得的蛋白质可选地被纯化并且在活体外在确保蛋白质活性的反应条件下，在足以获得最大反应的持续时间中，必要时在实现产物的反应的合适的缓冲液中添加其他物质或酶的条件下以及必要时利用其他对于反应必需的添加剂的情况下，将所获得的纯化的蛋白质结合以进行根据本发明的任意方面的所选择的反应物的反应。合适的反应条件，如缓冲液、添加剂、温度和ph值条件以及必要时其他的蛋白质能够由本领域的技术人员在获悉在此公开的生物合成途径和为此所必需的酶的情况下根据本公开的任意方面简单地确定，其中所述酶共同决定反应条件的选择。在本发明的第二方面中，基于多巴胺和/或l-二羟基苯丙氨酸(左旋多巴)或其前体或其衍生物利用4-omt和3′-o-甲基转移酶(3-omt)获得3,4-二甲氧基苯乙胺。这通过提供重组的微生物或真菌进行，所述重组的微生物或真菌包含(a1)核酸片段，所述(a1)核酸片段包括至少一种编码4′-o-甲基转移酶的基因或由其构成，和(a2)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码3′-o-甲基转移酶的基因或由其构成，和(b)可选地核酸片段，所述核酸片段包括编码s-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因或由其构成构成，和(c)可选地核酸片段，所述核酸片段包括编码多巴脱羧酶(ddc)的基因或由其构成，以及在允许核酸片段表达的条件下培养重组的微生物或真菌以获得相应的表达产物；并且可选地分离以及必要时纯化获得的表达产物；将多巴胺和/或l-二羟基苯丙 氨酸和/或一种或多种其前体或一种或多种其衍生物、尤其一种其前体或一种其衍生物添加至添加至根据步骤(ii)的培养的重组的微生物或真菌以用于发酵反应或添加至根据步骤(iii)的表达产物以用于酶促反应，其中在酶促反应的情况下还优选添加s-腺苷甲硫氨酸；在实现将多巴胺或l-二羟基苯丙氨酸和/或其一种或多种前体或其一种或衍生物反应成3,4-二甲氧基苯乙胺的条件下，培养或孵育重组的微生物或真菌或表达产物以获得3,4-二甲氧基苯乙胺；可选地分离以及必要时纯化获得的3,4-二甲氧基苯乙胺以及可选地分离以及必要时纯化可能存在的其他副产物。多巴胺的优选的前体或衍生物选自：l-二羟基苯丙氨酸(左旋多巴)、酪氨酸或苯丙氨酸。在所述方面的一个实施方式中，反应能够纯发酵地进行。在另一实施方式中，反应物的最终反应酶促地进行。通过4-omt和3-omt的甲基化步骤能够同时地或以任意顺序依次地进行。在一个实施方式中，除4-omt和3-omt之外，编码sams的核酸片段也由重组的微生物或真菌转录和翻译。此外，在另一实施方式中，基于左旋多巴或其前体或其衍生物，编码ddc的核酸片段也由重组的微生物或真菌转录和翻译。此外在根据本发明的方面二的酶促反应的情况下，优选向制备物添加s-腺苷甲硫氨酸。优选编码本发明的多巴脱羧酶(ddc)的核酸包括选自下述的核酸：seqidno.:1(dmddc，密码子优化的)、2(amddc，密码子优化的)、59、61和63以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。编码根据本发明的核酸的 优选的ddc多肽包括选自下述的这种多肽：seqidno.：21、22、60、62和64以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述条件为关于分别列出的seqidno.具有相应的同源性程度的序列仍满足与具有相应的seqidno.的相应未被修饰的多肽相同的酶促功能。所提出的核酸序列能够例如是密码子优化的或密码子截短的，或所述核酸序列能够包含定向点突变。正如对于本发明的第一方面，在此也重要的是：4-omt的特定功能有针对性地与其他酶、在此为3-omt以及可选地sams和/或dcc联合，由此，能够执行由本发明提供的生物合成途径以获得目标产物。在本发明的第三方面中，基于羟基肉桂酸或在半纤维素上酯化的羟基肉桂酸以及多巴胺和/或l-二羟基苯丙氨酸或其前体或其衍生物，利用4-omt、sams、和3-omt获得4-甲基肉桂酸酰胺。这通过提供如针对本发明的第一方面限定的重组的微生物或真菌进行，所述重组的微生物或真菌附加地包括：(d)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码4-香豆酸：辅酶a连接酶的基因或由其构成，和(e)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码酪胺-n-羟基肉桂酰转移酶(tht)的基因或由其构成，和(f)可选地核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码多巴脱羧酶(ddc)的基因或由其构成，以及在允许核酸片段表达的条件下培养重组的微生物或真菌以获得相应的表达产物；可选地：分离和必要时纯化获得的表达产物；将多巴胺和/或l-二羟基苯丙氨酸和羟基肉桂酸、优选咖啡酸或阿魏酸添加至根据步骤(ii)的培养的重组的微生物或真菌以用于发酵反应，或将苯乙胺、尤其多巴胺、3-甲氧酪胺、3-羟基-4-甲基苯乙胺、3,4-二甲氧基苯乙胺和肉桂酸酯、尤其咖啡酸的、阿魏酸的、异阿魏酸的或3,4-二甲氧基肉桂酸的酯添加至根据步骤(iii)的表达产物以用于酶促反应，其中在酶促反应的情况下此外优选添加s-腺苷甲硫氨酸；并且在实现多巴胺和/或l-二羟基苯丙氨酸和羟基肉桂酸反正成4-甲基肉桂酸酰胺的条件下培养或孵育重组的微生物或真菌或表达产物，可选地添加连接酶；以及可选地分离以及必要时 纯化获得的4-甲基肉桂酸酰胺以及必要时纯化可能存在的其他副产物。在所述方面的一个实施方式中，反应能够完全发酵地进行。在另一实施方式中，反应物的最终反应酶促地进行。此外，在根据本发明的方面三的酶促反应的情况下，优选向制备物添加辅酶a和三磷酸腺苷(atp)。编码本发明的香豆酸:辅酶a连接酶(cl)的优选的核酸选自：seqidno.:11、12、73、75和77以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。由优选根据本发明的核酸编码的cl多肽在如下条件下包括选自下述的多肽：seqidno.:31、32、74、76和78以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述条件为关于分别列出的seqidno.具有相应的同源性程度的序列仍满足与具有相应的seqidno.的相应未被修饰的多肽相同的酶促功能。所提出的核酸序列能够例如是密码子优化的或密码子截短的，或所述核酸序列能够包含定向点突变。优选编码本发明的酪胺-n-羟基肉桂酰转移酶(tht)的核酸选自：seqidno.：13、14、79和81以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。由优选根据本发明的核酸编码的tht多肽在如下条件下包括选自下述的多肽：seqidno.:33、34、80和82以及具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述条件为关于分别列出的seqidno.具有相应的同源性程度的序列仍满足与具有相应的seqidno.的相应未被修饰的多肽相同的酶促功能。所提出的核酸序列能够例如是密码子优化的或密码子截短的，或所述核酸 序列能够包含定向点突变。根据本发明的任意方面的另一优选的实施方式，也包含编码多肽的核酸序列的使用，所述核酸序列的使用用于脱羧酶和/或3′-o-甲基转移酶和/或4′-o-甲基转移酶和/或s-腺苷甲硫氨酸合成酶和/或4-香豆酸:辅酶a连接酶和/或酪胺-n-羟基肉桂酰转移酶的纯化、分泌、检测或定位的目的。所述核酸片段也称作标签序列并且能够是将核酸片段前置(n端)和/或后置(c端)，所述核酸片段针对脱羧酶和/或3′-o-甲基转移酶和/或4′-o-甲基转移酶和/或s-腺苷甲硫氨酸合成酶和/或4-香豆酸:辅酶a连接酶和/或酪胺-n-羟基肉桂酰转移酶。尤其优选地，标签序列选自下列列表：多组氨酸(his)标签、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)标签、硫氧还蛋白标签、flag标签、绿色荧光蛋白(gfp)标签、抗生蛋白链菌素标签、麦芽糖结合蛋白(mbp)标签、叶绿体转运肽、线粒体转运肽和/或分泌物标签。在本发明的一个优选的实施方式中，使用的连接酶是连接酶b。连接酶能够被固定地存在。在更优选的实施方式中，连接酶是源于南极假丝酵母的连接酶b。源于南极假丝酵母的连接酶b的核酸序列或多肽序列在seqidno.：83和84中示出。另一实施方式中在如下条件下也包括具有与所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述条件为具有与相应列出的seqidno.相应的同源性程度的序列仍满足与具有seqidno.84的相应未被修饰的多肽相同的酶促功能。在一个实施方式中，源于南极假丝酵母的连接酶b能够以固定的形式存在。适合用于根据本发明的使用的连接酶是市售(例如从罗氏制药，曼海姆(roche,mannheim))。在所述方面的一个实施方式中，酰胺偶联在发酵反应的情况下能够利用4-香豆酸：辅酶a连接酶(cl)和酪胺-n-羟基肉桂酰转移酶(tht)进行。在另一实施方式中，在酶促反应的情况下，酰胺偶联通过连接酶进行。在此，酰胺偶联的酶促步骤能够通过连接酶催化。在所述方面的另一实施方式中，酰胺偶联相对于4′-o-甲基化和可选的3′-甲基化的反应步骤以任意顺序进行。在一个实施方式中，根据方面三的4-甲基肉桂酸酰胺选自：罗宾红素[(2e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(3,4-二甲氧基)乙基]2-丙烯酰胺]、阿魏酰-3-甲氧基酪胺[(2e)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基丙酮)-n-[2-(4-羟基-3-甲氧基苯基丙酮)乙基]2-丙烯酰胺]、(2e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羟基-3-甲基-苯基)乙基]2-丙烯酰胺]和3,4-二甲氧基肉桂酰甲氧酪胺[(2e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-甲氧基苯基丙酮)乙基]2-丙烯酰胺]。本发明的该第三方面在延续第一方面和第二方面的条件下结合两种代谢途径。当第一方面和第二方面中通过新型的生物技术方法提供中间产物时，根据方面三的方法的两种途径的结合和延续产生其他更复杂的合成产物。对于本发明的所有三个方面，这以生物技术途径利用有针对性结合代谢途径并且利用重组的微生物或真菌和4-omt来实现。此外，当前公开了载体体系，所述载体体系根据本发明的一个方面包括核酸片段或载体或由核酸片段或载体构成。在一个实施方式中，公开了载体体系、尤其质粒载体体系，所述载体体系由一种或多种载体或质粒载体构成或包含一种或多种载体或质粒载体，所述载体或质粒载体包含(a1)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码4′-o-甲基转移酶的基因或由其构成，和(a2)可选地核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码3′-o-甲基转移酶的基因或由其构成，和(b)可选地核酸片段，所述核酸片段包括编码s-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因或由其构成，其中在存在核酸片段(a2)和/或核酸片段(b)的情况下，在相同的载体或两个或多个单独的载体上提供所述核酸片段。在另一实施方式中，公开了载体体系、尤其质粒载体体系，所述载体体系包含一种或多种载体或质粒载体，所述载体体系包含：(a1)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码4′-o-甲基转移酶的基因或由 其构成，和(a2)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码3′-o-甲基转移酶的基因或由其构成，和(b)可选地核酸片段，所述核酸片段包括编码s-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因或由其构成，和(c)可选地核酸片段，所述核酸片段包括编码多巴脱羧酶的基因或由其构成，其中在相同的载体或两个或更多个单独的载体上提供核酸片段。在又一实施方式中，公开了载体体系、尤其质粒载体体系，所述载体体系包括(a1)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码4′-o-甲基转移酶的基因或由其构成，和(a2)可选地核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码3′-o-甲基转移酶的基因或由其构成，和(b)可选地核酸片段，所述(b)可选地核酸片段，所述核酸片段包括编码s-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因或由其构成，并且附加地包含一种或多种载体或质粒载体，所述载体或质粒载体包含(d)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码4-香豆酸:辅酶a连接酶的基因或由其构成，和(e)核酸片段，所述核酸片段包括编码酪胺-n-羟基肉桂酰转移酶的基因或由其构成，和(f)可选地核酸片段，所述核酸片段包括编码多巴脱羧酶的基因或由其成，其中在相同的载体或两个或更多个单独的载体上提供核酸片段。此外，公开了重组的微生物和真菌，所述重组的微生物和真菌具有用于执行根据本发明的方法所必需的载体或载体体系进而根据所描述方面之一编码核酸以执行根据本发明的方法。在一个实施方式中，如在此描述的那样，重组的微生物或真菌包括载体体系、尤其质粒载体体系。优选重组的微生物或真菌选自：大肠杆菌属、优选大肠杆菌bl21、大肠杆菌mg1655或大肠杆菌w3110和其后代，芽孢杆菌属、优选地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌和其后代，酵母菌属、优选酿酒酵母和其后代，汉逊酵母属或毕赤酵母属、优选毕赤酵母和多形汉逊酵母和其后代，克鲁维酵母菌属、优选乳酸克鲁维酵母和其后代，米曲霉菌属、优选米曲霉菌、构巢曲霉、或黑曲霉和其后代，或木霉属、 优选里氏木霉或哈茨木霉和其后代。此外，本发明涉及核酸片段以及多肽，所述核酸片段以及多肽专门突变和必要时密码子优化以应用于执行根据本发明的方法。所述核酸片段选自，但不限于由seqidno.：8、16、17、20和85。具有突变的多肽选自，但不限于seqidno.：28、36、37、40和86。此外，提供一种组合物，所述组合物包括依据方面三的根据本发明的方法的产物。在一个实施方式中，组合物包括罗宾红素和至少一种选自下述的其他物质：3,4-二甲氧基肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、3-甲氧酪胺、3-羟基-4-甲基苯乙胺、左旋多巴、3,4-二甲氧基苯乙胺。在另一实施方式中，组合物包括50重量％-99重量％的罗宾红素、0.1重量％–49.9重量％的3,4-二甲氧基肉桂酸和0.1重量％–49.9重量％的3,4-二甲氧基苯乙胺。此外，本发明通过下列、但不可视为限制的实例阐述。实例1:产生不同的单独构建体为了产生所使用的单独构建体、即具有编码序列的适合于蛋白质表达的载体，合成不同的靶基因的相应的编码序列并且分别在两个限制位点(restriktionsschnittstelle)之间克隆到载体pet28a(merckchemicals有限责任公司，schwalbach)或pqe30(qiagen，hilden)或pcdfduet-1(merckchemicals有限责任公司，schwalbach)中。表1中总结了克隆基因与分别用于克隆的限制位点的概览。对于对应于cbmomt和其变体l322n和t133s、cbiemt1、rcomt、gmsomt和psomt的seqidno.：7-9、15、17、5和18，大肠杆菌上基因的密码子使用适合作为计划的表达宿主。此外，在seqidno.8、9、16和17中具有一种或多种相对于从相应的生物中获得的原始序列的点突变。表1：克隆基因与应用的载体和限制位点的概览为了产生构建体pgj3610_dmddc，合成靶基因的编码序列(seqidno.：1，seqidno.：2)作为受lifetechnologies有限责任公司(达 姆施塔特(darmstadt))委托的基因合成以用于稍后在大肠杆菌中在密码优化的变体中使用。紧接着，基因的编码序列根据普遍的、本领域技术人员已知的实践借助于限制性酶切消化用限制性核酸内切酶bamhi和ncoi(newenglandbiolabs有限责任公司，法兰克福(frankfurt))从基因合成质粒中剪切。紧接着，限制性制备物在琼脂糖凝胶上分离并且具有1430碱基对长度的目的片段借助凝胶和聚合酶链式反应回收试剂盒(pcrclean-up-kit)(macherey-nagel有限责任公司&co.kg,düren)从凝胶洗脱出来。为了建立目的表达质粒，用限制性核酸内切酶bamhi和ncoi(newenglandbiolabs有限责任公司，法兰克福(frankfurt))消化基础表达质粒并且所获得的具有2981碱基对长度的dna片段借助凝胶和聚合酶链式反应回收试剂盒(pcrclean-up-kit)(macherey-nagel有限责任公司&co.kg,düren)在电泳分离之后从琼脂糖凝胶洗脱出来。根据普遍的、本领域技术人员已知的实践，表达质粒的建立经由用各50ng纯化的dna片段(目的片段和表达质粒片段)和t4dna连接酶(newenglandbiolabs有限责任公司，法兰克福(frankfurt))的连接反应进行。借助于标准转化方法(maniatis等，1983年)，反应产物引入大肠杆菌xl1-blue感受态细胞中并且细胞经过18小时在37℃下在选择性的固体培养基上吸住(lb+氨苄西林(100mg/l)+6g/l琼脂)。为了鉴别阳性克隆，接种具有耐受性单菌落的液体培养基(3ml；lb+氨苄西林(100mg/l))并且如之前那样吸住。紧接着，借助于genejet质粒小提试剂盒(genejetplasmidminiprepkit)(赛默飞世尔科技(thermoscientific))并且根据普遍的本领域技术人员已知的实践经由限制性表型(restrictionskatierung)来分析细胞的质粒dns。经由gatcbiotech公司(康斯坦茨，德国(konstanz,germany))进行阳性克隆的克隆的dna序列的检验。实例2:借助诱变产生不同的cbmomt变体基于质粒pet28a_cbmomt，借助quikchangeii定点突变试剂盒(quikchangeiisite-directedmutagenesekit)(agilent,waldbronn) 产生不同的酶变异。在此，依照制造商说明书，利用特定的引物将有针对性的突变引入cbmomt的编码的序列中。对于cbmomt的变体1使用引物momt-l322n_for(seqidno.:41)和momt-l322n_rev(seqidno.:42)，对于变体2使用引物momt-t133s_for(seqidno.:43)和momt-t133s_rev(seqidno.:44)。由此产生根据seqidno.:8和9的序列。相应的翻译的蛋白质的序列在seqidno.:28和29中描述。实例3:产生使用的双重构建体3.1制备质粒pet28a_cbmomt_scsams(a)产生pet28a_gg构建体质粒pet28a_cbmomt_scsams的制备借助goldengatetechnologie(wo2011/154147a1)进行。为了对此进行准备，首先合成专门的核酸序列(seqidno.:53)并且紧接着用限制性内切酶bamhi和hindiii剪切并且引入本领域技术人员已知的连接制备物中的载体pet28a(merckchemicals有限责任公司，schwalbach)中，由此获得质粒pet28a_gg。(b)扩增cbmomt基因基因cbmomt从pet28a_cbmomt构建体的质粒dns(见实例1)借助聚合酶链式反应(pcr)利用dreamtaq-dna-聚合酶(赛默飞世尔科技(thermoscientific)，波恩(bonn))根据普遍的、本领域技术人员已知的实践扩增。在此，使用引物m_term-f(seqidno.:49)和m_term-r(seqidno.:50)。紧接着，pcr制备物在1％的琼脂糖凝胶上分离并且具有1280碱基对长度的目的片段借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)从凝胶洗脱出来。(c)扩增scsams基因基因scsams从pcdfduet-1_scsams构建体的质粒dns(见 实例1)借助聚合酶链式反应(pcr)利用dreamtaq-dna-聚合酶(赛默飞世尔科技(thermoscientific)，波恩(bonn))根据普遍的、本领域技术人员已知的实践扩增。在此，使用引物s_prom-f(seqidno.:51)和s_prom-r(seqidno.:52)。紧接着，pcr制备物在1％的琼脂糖凝胶上分离并且具有1425碱基对长度的目的片段借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)从凝胶洗脱出来。(d)基因cbmomt和scsams克隆到pet28a_gg中100ng质粒pet28a_gg(见步骤3.1a)与24ng的纯化的cbmomt片段和25ng纯化的scsams片段在15μl反应制备物中在37℃下孵育1h，所述反应制备物具有1xnebt4连接酶缓冲液(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))、0.1mg/mlbsa(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))、20ubsai(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))和100unebt4dna连接酶(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))，紧接着在50℃下孵育5min并且在80℃下孵育5min以终止反应，孵育。3.2制备质粒pet28a_mcpfomt_cbmomt-t133sa)t7-启动子_mcpfomt_t7-终止子片段的扩增包括t7启动子、mcpfomt的编码序列和t7终止子的核酸序列连同限制性内切酶sphi或bglii的识别序列，根据普遍的、本领域技术人员已知的实践利用onetaq-聚合酶(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))在聚合酶链式反应(pcr)中从pet28a_mcpfomt(见实例1)构建体的质粒dns扩增(引物：seqidno.:54，seqidno.：55)。紧接着，pcr制备物在1％的琼脂糖凝胶上分离并且具有1079碱基对的目的片段借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)从凝胶洗脱出来。b)t7-启动子_mcpfomt_t7-终止子片段克隆到载体 pet28a_cbmomt中a)中的1μg的dna片段以及3μg载体pet28a_cbmomt4(见实例1)利用限制性内切酶sphi和bglii(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))根据普遍的、本领域技术人员已知的实践剪切并且紧接着在1％的琼脂糖凝胶上分离。相应的片段从糖凝胶洗脱出来并且借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)纯化。紧接着，51.5ng纯化的t7-启动子_mcpfomt_t7-终止子片段与100ng纯化的pet28a_cbmomt4载体连同5uexpresslinkt4dna连接酶(lifetechnologies有限责任公司,darmstadt)在具有1xexpresslink连接酶缓冲液(lifetechnologies有限责任公司,darmstadt)的20μl反应制备物中混合并且在室温下孵育5min。3.3制备pcdfduet_at4cl2_catht构建体为了产生所述构建体，合成靶基因的相应的编码序列(at4cl2:seqidno.:11，在里氏木霉上密码子优化；catht：seqidno.：14)并且紧接着在限制位点psti和noti(at4cl2)或kpni和xhoi(catht)之间克隆到载体pcdfduet(merckchemicals有限责任公司,schwalbach)中。在此，对于这两种基因，调整密码子使用在大肠杆菌上作为可行的表达宿主。相应的翻译序列描述为seqidno.:31或34。3.4制备pcdfduet_ntcl1_nttht构建体为了产生所述构建体，合成靶基因的相应的编码序列(nt4cl1:seqidno.:12，在黑曲霉上密码子优化；nttht:seqidno.:13)并且紧接着在限制位点psti和noti(ntcl1)或paci和avrii(nttht)之间克隆到载体pcdfduet(merckchemicals有限责任公司,schwalbach)中。在此，对于这两种基因，在大肠杆菌上密码子使用适合作为可行的表达宿主。相应的翻译序列描述为seqidno.:32或33。实例4:产生使用的三重构建体为了产生使用中的三重构建体，分别合成操纵子，所述操纵子由一个t7-启动子、3个可变的核糖体结合位点(rbs1-3)、3个编码的核苷酸序列(orf1-3)和一个t7终止子构成并且紧接着克隆到载体pma7中(见表2)。表2：具有用于orf1-3的rbs的pma7-1构建体和pma7-2构建体的概览(分别说明相应的seqidno.56、57或58)实例5:在大肠杆菌细胞中质粒dns的转化为了增殖在实例1-4中产生的质粒，质粒dns在化学感受态的大肠杆菌neb5α细胞中(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))进行。等分成50μl的细胞在冰上孵育5分钟。在添加1μl质粒dns之后，混合悬浮液并且在冰上继续孵育30分钟。转化通过将悬浮液转移到加热模块中(thermoblock)在42℃下培养30s并且接着在湿冰上培养2min进行。然后添加600μl溶菌液体培养基培养基(lb)培养基(carlroth有限责任公司，卡尔斯鲁厄(karlsruhe))并且将细胞在37℃和180rpm下培养1h。最后将200μl培养液涂布在具有相应的抗生素的lb琼脂上(carlroth有限责任公司，卡尔斯鲁厄(karlsruhe))。皮氏培养皿在37℃下孵育16h。为了准备蛋白质表达，相应的质粒dns的转化在大肠杆菌bl21(de)细胞上进行。将等分成50μl的化学感受态细胞在冰上孵育 5分钟。在添加1μl质粒dns之后，混合悬浮液并且在冰上继续孵育5分钟。转化通过将悬浮液转移到加热模块中(thermoblock)在42℃下培养30s并且接着在湿冰上培养2min。然后添加250μllb培养基(carlroth有限责任公司，卡尔斯鲁厄(karlsruhe))并且细胞在37℃和180rpm下培养1h。最后将200μl培养液涂布在具有相应的抗生素的lb琼脂上(carlroth有限责任公司，卡尔斯鲁厄(karlsruhe))。皮氏培养皿在37℃孵育16h。实例6:蛋白质表达和纯化为在50ml体积中准备蛋白质表达，首先5mllb培养基的预培养液(carlroth有限责任公司，卡尔斯鲁厄(karlsruhe))用相应的抗生素处理并且借助接种环将相应的菌株的细胞从琼脂板中取出并且转移至预培养液中。然后，所述预培养液在37℃和150rpm下孵育16h。从预培养液中借助50mllb培养基(carlroth有限责任公司，卡尔斯鲁厄(karlsruhe))和相应的抗生素接种主培养夜，使得在600nm中光密度为0.1。紧接着，主培养液在37℃和150rpm下孵育直至在600nm中光密度达到0.4-0.8。为了诱导蛋白质表达，在所述时间点添加1mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷并且培养液在22℃继续孵育16h。紧接着，在10000rpm下离心分离主培养液达10min，以便获得细胞沉淀并且紧接着能够执行蛋白质提取和纯化。为此，首先借助b-per蛋白质提取试剂(b-perproteinextractionreagent)(赛默飞世尔科技(thermoscientific)，波恩(bonn))依照制造商说明书执行细胞破碎。接着，所以获得的细胞裂解液要么直接使用，要么依照制造商说明书借助1mlhispurni-nta层析柱(赛默飞世尔科技(thermoscientific)，波恩(bonn))处理。实例7:生物技术制备3,4-二甲氧基肉桂酸7.13,4-二甲氧基肉桂酸的酶促展示(darstellung)2mm阿魏酸溶解于50mmtris缓冲液，ph7.5连同4mms-腺苷甲硫氨酸和50μgcbmomt、cbmomt-l322n、cbmomt-t133s、 cbmomt-t133s/l322n(seqidno.:86)或gmsomt蛋白质在350μl的总体积中在30℃下孵育6h。然后，通过添加350μl乙脲终止反应。然后，所获得的反应混合物借助hplc分析。使用具有2.1mm直径和100mm长度的poroshell120sb-c18(2.7μm)分离柱来分析。借助下面示出的梯度法，在40℃的柱温下进行分离。具有0.1％蚁酸(a)和乙脲(b)的水在0.4ml/min流速的情况下用作移动相。在320nm波长的情况下进行检测。根据外标法用相应的基准物质进行滞留时间的确定以及定量的确定。根据实例7.1所述的梯度法：0.00mina:95％b:5％0.10mina:95％b:5％10.00mina:50％b:50％12.00mina:0％b:100％15.00mina:0％b:100％15.01mina:95％b:5％7.23,4-二甲氧基肉桂酸的发酵展示用pet28a_cbmomt-l322n或用pet28a_cbmomt-l322n_scsams转化的大肠杆菌bl21(de3)细胞在tb培养基中(23.6g/l酵母提取液、11.8g/l胰蛋白、9.4g/lk2hpo4、2.2g/lkh2po4、4ml/l甘油)培养直至在600nm中光密度为0.6并且通过添加0.2mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导蛋白质产生。直接在添加诱导因子之后，用5mm阿魏酸掺入培养液并且在30℃和130rpm下孵育48h。然后，如在实例7.1中示出，借助hplc分析获得的反应混合物。实例8:生物技术制备3,4-二甲氧基苯乙胺8.1基于左旋多巴酶促展示3,4-二甲氧基苯乙胺1mm左旋多巴连同50μgmcpfomt、50μgcbmomt、50μgdmddc(seqidno.:1，密码子优化的序列)、140μm氯化镁、40μm磷酸吡哆醛和4mms-腺苷甲硫氨酸在100mm磷酸钾缓冲液，ph7.5中混合并且在30℃下孵育24h。然后，借助hplc分析获得的反应混合物。使用具有4mm直径和250mm长度的gromsilods-4he(5μm)分离柱来分析。借助下面示出的梯度法，在40℃的柱温下进行分离。20mm磷酸钾缓冲液ph4.0(a)和乙脲(b)在0.8ml/min流速的情况下用作移动相。在214nm波长下进行检测。根据外标法用相应的基准物质进行滞留时间的确定以及定量的确定。根据实例8.1所述的梯度法：0.00mina:100％b:0％15.00mina:80％b:20％16.00mina:100％b:0％21.00mina:100％b:0％8.2基于左旋多巴来发酵展示3,4-二甲氧基苯乙胺用psym_ddcandpet28a_mcpfomt_cbmomt-t133s转化的大肠杆菌bl21(de3)细胞在tb培养基中(23.6g/l酵母提取液、11.8g/l胰蛋白、9.4g/lk2hpo4、2.2g/lkh2po4、4ml/l甘油)分开培养直至在600nm中光密度为0.6并且紧接着混合，使得两种培养液分别在600nm中光密度为0.5。紧接着添加1mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷和0.1％阿拉伯糖来诱导蛋白质表达以及添加5mm左旋多巴作为底物。培养液在30℃和170rpm下孵育48h之后，如在实例8.1中示出， 借助hplc分析发酵上清液。8.3基于多巴胺酶促展示3,4-二甲氧基苯乙胺酶1.3mm多巴胺连同50μgmcpfomt、50μgcbmomt、50μgdmddc(seqidno.:1，密码子优化的序列)、140μm氯化镁、40μm磷酸吡哆醛和5.2mms-腺苷甲硫氨酸在100mm磷酸钾缓冲液，ph7.5中混合并且在30℃下孵育24h。然后，如在实例8.1中描述，借助hplc分析获得的反应混合物。8.4基于多巴胺发酵展示3,4-二甲氧基苯乙胺用pet28a_mcpfomt_cbmomt-t133s转化的大肠杆菌bl21(de3)细胞在tb培养基中(23.6g/l酵母提取液、11.8g/l胰蛋白、9.4g/lk2hpo4、2.2g/lkh2po4、4ml/l甘油)培养直至600nm中光密度为1.1。紧接着添加0.2mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷来诱导蛋白质表达并且添加5mm多巴胺作为底物。培养液在30℃和150rpm下孵育48h之后，如在实例8.1中示出，借助hplc分析发酵上清液。实例9:生物技术制备罗宾红素用pcdfduet_at4cl2_catht、pma7-1和pet28a_cbmomt-l322n_scsams转化的大肠杆菌bl21(de3)细胞在tb培养基中(23.6g/l酵母提取液、11.8g/l胰蛋白、9.4g/lk2hpo4、2.2g/lkh2po4、4ml/l甘油)分开地培养直至在600nm时光密度为1.3并且紧接着混合，使得所有培养液在600nm中光密度分别为0.5。紧接着添加0.8mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷来诱导蛋白质表达并且添加5mm左旋多巴和5mm异阿魏酸作为底物。培养液在30℃和150rpm下孵育48h之后，借助lc-ms分析发酵上清液。为了分析使用watersacquityuplc和brukermicrotofq-ii检测器。借助具有2.1mm直径和100mm长度的phenomenexkinetexc18(1.7μm)分离柱在50℃柱温的情况下借助下面描述的梯度法进行试样分离。具有0.1％蚁酸(a)和0.09％蚁酸(b)的乙脲的水在0.3ml/min流速下用作移动 相。根据外标法用相应的基准物质进行滞留时间的确定以及定量确定。根据实例9所述的梯度法：0.00mina:90％b:10％25.00mina:65％b:35％26.00mina:0％b:100％30.00mina:0％b:100％实例10:生物技术制备阿魏酰-3-甲氧基酪胺用pcdfduet_nt4cl1_nttht和pma7-2转化的大肠杆菌bl21(de3)细胞在tb培养基中(23.6g/l酵母提取液、11.8g/l胰蛋白、9.4g/lk2hpo4、2.2g/lkh2po4、4ml/l甘油)分开培养直至在600nm中光密度为1.0并且紧接着混合，使得两种培养液在600nm中光密度分别为0.5。紧接着添加1mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷来诱导蛋白质表达并且5mm左旋多巴和5mm异阿魏酸作为底物。培养液在30℃和150rpm下孵育48h之后，如在实例9中示出，借助lc-ms分析发酵上清液。实例11:基于(e)-3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-n-[2-(4-羟苯基)乙基]2-丙烯酰胺酶促展示(e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羟苯基)乙基]2-丙烯酰胺0.64mm(e)-3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-n-[2-(4-羟苯基)乙基]2-丙烯酰胺连同50μgcbmomt和1.3mms-腺苷甲硫氨酸在50mmtris缓冲液，ph7.5中混合并且在30℃下孵育24h。如在实例9中描述，随后借助lc-ms分析获得的反应混合物。实例12:基于(e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羟苯基)乙基]2-丙烯酰胺酶促展示二甲氧基肉桂酰甲氧酪胺1.22mm(e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羟苯基)乙基]2-丙烯酰胺连同1mgcbmomt裂解液、1mgtaomt2裂解液或1mggmsomt裂解液和4.88mms-腺苷甲硫氨酸在50mmtris缓冲液，ph7.5中混合并且在30℃下孵育24h。如在实例9中示出，借助lc-ms分析获得的反应混合物。实例13:不同的甲基转移酶与肉桂酸、苯乙胺和肉桂酸酰胺的反应的研究200ppm待研究的底物连同与底物相比双倍摩尔量的s-腺苷甲硫氨酸和50μg酶在相应的缓冲液(见表3)中混合并且在30℃下孵育24h。随后借助lc-ms分析获得的反应混合物。在此，如在实例9中示出，分析包含肉桂酸或肉桂酸酰胺的反应混合物。为了分析苯乙胺，使用watersacquityuplc和brukermicrotofq-ii检测器。借助具有2.1mm直径和150mm长度的acquityhsst3(1.8μm)分离柱在50℃柱温下借助下面描述的梯度法进行试样分离。具有0.1％蚁酸(a)和0.09％蚁酸(b)的乙脲的水在0.35ml/min流速下用作移动相。根据外标法用相应的基准物质进行滞留时间的确定以及定量确定。根据实例13所述的梯度法：0.00mina:100％b:0％22.00mina:5％b:95％27.00mina:5％b:95％30.00mina:0％b:100％表3：在实例13中使用的缓冲液列表实例14:肉桂酸酯和苯乙胺酶促反应成相应的肉桂酸酰胺0.1mmol肉桂酸酯与0.1mmol苯乙胺溶解在5ml三乙胺中并且连同50mg固化的源于南极假丝酵母的连接酶b(roche,mannheim)在回流条件下在70℃下搅拌24h。紧接着固化的酶通过过滤回收。借助lc-ms分析滤液。实例15:产生pd1214_cbmomt质粒为了将cbmomt(seqidno.:7)克隆到修饰的pd1214穿梭载体(由dna2.0，usa提供)，基因的编码序列利用onetaq聚合酶(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))根据普遍的、本领域的技术人员已知的实践借助聚合酶链式反应(pcr)扩增。在此，借助特定的引物(seqidno.:45，seqidno.:46)在片段的5′端和3′端产生用于bsai的位点。紧接着，pcr制备物在1％的琼脂糖凝胶上分离并且具有1143碱基对长度的目的片段借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)从凝胶洗脱出来。100ng载体与20ng纯化的pcr片段在15μl反应制备物中在37℃下孵育1h，所述反应制备物具有1xnebt4连接酶缓冲液(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))、0.1mg/mlbsa(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))、20ubsai(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))和100unebt4dna连接酶(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))，紧接着在50℃下孵育5min并且为了终止反应，在80℃下孵育5min。实例16:产生pd1214_cbmomt_sams质粒为了将sams克隆到穿梭载体pd1214_cbmomt(见实例15)，基因的编码序列连同用于限制性内切酶bamhi和bglii的识别序列利用onetaq聚合酶(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))根据普遍的、本领域技术人员已知的实践在pcr(引物:seqidno.:47，seqidno.:48)中扩增。紧接着，pcr制备物在1％的琼脂糖凝胶上分离并且具有1175碱基对长度的目的片段借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)从凝胶洗脱出来。与此并行，将3μgpd1214_cbmomt载体与10ubamhi和5ubglii(两者都来自newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))在30μl反应制备物中在37℃下孵育4h，所述反应制备物具有1xneb缓冲液3(newenglandbiolabs，美因河畔法兰克福(frankfurtammain))。 在紧接着添加1u小牛肠碱性磷酸酶(calfintestinealkalinephosphatase)(lifetechnologies有限责任公司，达姆施塔特(darmstadt))之后，制备物在37℃下孵育1h。紧接着，制备物在1％的琼脂糖凝胶上以层析法分离并且线性的载体借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)从糖凝胶洗脱出来。为了连接，30fmol洗脱的载体与90fmol纯化的pcr片段连同5uexpresslinkt4dna连接酶(lifetechnologies有限责任公司，达姆施塔特(darmstadt))在20μl反应制备物中混合，所述反应制备物具有1xexpresslink连接酶缓冲液(lifetechnologies有限责任公司，达姆施塔特(darmstadt))并且在室温下孵育5min。实例17:穿梭载体的增殖为了类似于实例15和实例16制备的质粒的增殖，在化学感受态的大肠杆菌xl1blue细胞首先在冰上孵育5分钟之后，分别将5μl反应制备物添加到各50μl的所述化学感受态的大肠杆菌xl1blue细胞中。紧接着，制备物在冰上继续孵育30分钟。转化通过悬浮液转在加热模块在42℃下孵育30s并且接着转移到湿冰上孵育2min来进行。然后添加600μllb培养基(carlroth有限责任公司，卡尔斯鲁厄(karlsruhe))以及细胞在37℃和180rpm下孵育1h。最后200μl培养液涂布在具有相应的抗生素的lb琼脂上(carlroth有限责任公司，卡尔斯鲁厄(karlsruhe))并且将皮氏培养皿在37℃下孵育16h。实例18:在酿酒酵母中转化为了实例15或实例16中的质粒dns的转化，首先用150mlypd培养基(formedium，英国)从酿酒酵母菌株by4741的过夜培养液中接种主培养液。在达到od600nm～0.2之后，离心分离培养液，弃掉上清液并且所获得的沉淀在1.5ml1xte/1xliac缓冲液(10mmtris-hcl、1mmedta、0.1m醋酸锂，ph7.5)中重悬。与此并行，对于每种待转化的质粒dns，将10mg/ml的鲱鱼精dna溶液(lifetechnologies有限责任公司，达姆施塔特(darmstadt))的10μl等分试样在95℃变 性5min并且接着在冰箱中冷却。紧接着，向所述等分试样添加100ng质粒dns以及100μl酿酒酵母细胞，所述酿酒酵母细胞在1xte/1xliac缓冲液(10mmtris-hcl、1mmedta、0.1m醋酸锂，ph7.5)中重悬。在添加600μl无菌peg/liac溶液(40％peg4000、10mmtris-hcl、1mmedta、0.1m醋酸锂，ph7.5)之后，试样涡旋10s并且紧接着在30℃和200rpm下孵育30min。在添加70μldmso之后，在42℃下孵育15分钟，接着在湿冰上冷却2min。紧随其后短时间地离心分离细胞，弃掉上清液并且所获得的沉淀在500μl1xte缓冲液(10mmtris-hcl、1mmedta，ph7.5)中接纳。100μl所述悬浮液涂布在相应的选择性培养基上并且在30℃下孵育48h。实例19:用酿酒酵母细胞发酵展示3,4-二甲氧基肉桂酸用pd1214_cbmomt或pd1214_cbmomt_sams转化的酿酒酵母细胞在sdglu-ura培养基(1.9g/lyeastnitrogenbase[formedium，英国]、0.77g/l不具有尿嘧啶的完全补充混合物[formedium,greatbritain]、20g/l葡萄糖、5g/l硫酸铵)中在30℃下培养直至在600nm中光密度为0.2。为了与pd1214_cbmomt反应，，立即在达到od之后向培养基添加1mm阿魏酸并且制备物在30℃和200rpm下孵育48h。随后借助hplc分析获得的反应混合物。为了与pd1214_cbmomt_sams反应，在达到od之后，首先离心分离细胞，弃掉上清液并且将所获得的沉淀置于sdgal-ura培养基(1.9g/lyeastnitrogenbase[formedium，英国]、0.77g/l不具有尿嘧啶的完全补充混合物[formedium，英国]、20g/l半乳糖、5g/l硫酸铵)中。然后添加1mm阿魏酸并且制备物在30℃和200rpm下孵育48h。同样地，如实例7.1中描述，借助hplc分析获得的反应混合物。当前第1页12