技术领域本发明属于药物制备工艺及其在药学上的新应用领域，具体涉及到从油菜籽粕中制备芥子碱硫氰酸盐及其在治疗阿尔茨海默病的应用。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer'sDisease，简称AD)是一种病因未明的慢性进行性神经系统性病变。它危害人类健康，是仅次于心血管病、癌症、艾滋病的第四致死病。临床上起病隐袭，常伴有日常生活处理能力和精神行为受损，记忆减退及其他认知功能障碍。病理上主要为弥漫性脑萎缩、选择性神经细胞丢失、神经细胞内的神经纤维缠结、神经细胞外的老年斑和脑动脉淀粉样变性等。目前，全世界AD患者总数(包括轻、中、重度患者)接近3000万，而中国接近1000万，且随着我国人口老年化趋势加重，未来我国AD患者人数将成为世界总AD患者的三倍，将严重威胁我国社会稳定和家庭幸福，成为社会的巨大挑战。AD患者胆碱能神经元明显减少，胆碱能神经纤维缠结，胆碱酯酶和胆碱乙酰转移酶活性增强，与记忆相关的烟碱型乙酰胆碱受体和毒蕈碱型乙酰胆碱受体明显降低，使乙酰胆碱的合成减少，分解增加，打破脑内系统平衡，最终发生AD。美国FDA批准上市的乙酰胆碱酯酶抑制剂有他克林、多奈哌齐、加兰他敏、艾斯能。此外还有很多乙酰胆碱酯酶抑制剂正在被研发。但是现有的乙酰胆碱酯酶抑制剂具有半衰期短、血脑屏障通透性低、水溶性小、肝毒性强等缺点，限制其发展前景。AD发病机制复杂，针对多重致病因素寻找多靶点治疗药物是抗AD药物研发的热点方向。在NSFC：31201336资助下，我们做了芥子碱硫氰酸盐对乙酰胆碱酯酶的抑制作用、钙通道作用、NO抑制作用，发现芥子碱硫氰酸盐在体内外均具有抑制乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，简称AChE)的作用，也就是说芥子碱硫氰酸盐可以通过抑制AChE，从而抑制了乙酰胆碱的水解，使体内乙酰胆碱堆积呈现出类似胆碱受体激动剂的效果。这一研究结果使我们颇为兴奋，因为在众多防治AD的药物种类中，AChE抑制剂是治疗AD最有效的药物之一。高血压又是AD三大危险因素之首，芥子碱硫氰酸盐如果能够同时实现降压且治疗AD将成为新一代AD治疗药物。十字花科植物果实油菜籽粕中含有大量芥子碱硫氰酸盐成分，芥子碱硫氰酸盐具有降压、平喘、舒张平滑肌、抑制胆碱酯酶活性功能，研究发现芥子碱硫氰酸盐抑制乙酰胆碱酯酶活性、拮抗钙离子及抑制一氧化氮作用时，能够改善阿尔海默病模型鼠的认知功能，芥子碱硫氰酸盐浓度升高，抑制乙酰胆碱酯酶作用增强，半数抑制浓度为24.86mg/ml，芥子碱硫氰酸盐低剂量时是钙离子拮抗剂，芥子碱硫氰酸盐低剂量时抑制一氧化氮作用显著(P＜0.05)，芥子碱硫氰酸盐可结合三条途径发挥治疗AD的作用。
技术实现要素：
为了克服上述的不足，本发明的目的在于提供从油菜籽粕中制备芥子碱硫氰酸盐及其在治疗阿尔茨海默病的应用。本发明的从油菜籽粕中制备芥子碱硫氰酸盐的方法，包括如下步骤：1、首先将水完全没过油菜籽粕，(油菜籽粕kg：自来水L＝1：4～1：10)，浸泡2～6个小时。然后放置在电加热套上加热，使用电压调节仪调节电压，使其始终保持在微沸腾状态，每分钟搅拌5～6下，提取3～4次，每次3～5小时，提取所需水量比例比为(5：4：4：3)。用6层纱布过滤，将滤液用旋转蒸发仪浓缩，得到浸膏。以浸膏(克)：乙醇(升)＝1：10～1:20的比例用乙醇对所得浸膏进行萃取，萃取3～4次，每次3～4小时。将萃取所得溶液进行抽滤，沉淀层丢弃，乙醇抽滤层用旋转蒸发仪进行浓缩至无醇味。2、将浓缩至无醇味的浸膏用蒸馏水进行稀释，比例为水(升)：浸膏(克)＝10：1～30:1，把稀释的溶液抽滤，加入适量的20％硫氰酸钾，根据经验公式：“所需硫氰酸钾的质量”＝油菜籽粕质量*(7％～8％)312*97”。将硫氰酸钾溶液与稀释液充分混合，置于4℃冰箱中冷却48～72小时，后将沉淀层滤出，沉淀层即为所得芥子碱硫氰酸盐。滤除沉淀后，继续放置在4℃冰箱中冷却结晶12～24小时，取出过滤，如此反复结晶。将芥子碱硫氰酸盐沉淀用40℃～50℃的甲醇溶解，芥子碱硫氰酸盐(克)：甲醇(毫升)＝1：100～1：200；溶解后趁热过滤，滤液层在室温下静置6～8小时，有灰色结晶物产生，将结晶刮出，放在减压干燥箱里干燥24～48h，就得到芥子碱硫氰酸盐的粉末。沉淀层再用40℃～50℃甲醇溶，有部分溶解，按照上面操作3～5次。得到纯度大于90％的芥子碱硫氰酸盐(结果用高效液相色谱检验)。本发明的另一个目的是给出了芥子碱硫氰酸盐在治疗阿尔茨海默病的应用，其应用包括：1、芥子碱硫氰酸盐对胆碱酯酶的抑制作用2、芥子碱硫氰酸盐对钙离子通道的抑制作用3、芥子碱硫氰酸盐对血清中一氧化氮的抑制作用本发明的有益效果是：本发明在于从油菜籽粕中分离得到芥子碱硫氰酸盐，并用其制备治疗阿尔茨海默病的药物，其具有作用效果强、高效、高选择性、副作用低、可逆性等优点，能够满足治疗阿尔茨海默病的要求。附图说明图1是不同浓度的芥子碱硫氰酸盐对AChE的影响；图2是芥子碱硫氰酸盐对L型钙离子通道的抑制作用；图3是芥子碱硫氰酸盐对电压依赖性钾通道的作用与影响；图4芥子碱硫氰酸盐对血清中一氧化氮的抑制作用。具体实施方式下面结合图1、图2、图3和图4和实施例对本发明做进一步说明：一、本发明的从油菜籽粕中制备芥子碱硫氰酸盐的方法主要包括如下具体步骤：1、首先将水完全没过油菜籽粕，(油菜籽粕kg：自来水L＝1：4～1：10)，浸泡2～6个小时。然后放置在电加热套上加热，使用电压调节仪调节电压，使其始终保持在微沸腾状态，每分钟搅拌5～6下，提取3～4次，每次3～5小时，提取所需水量比例比为(5：4：4：3)。用6层纱布过滤，将滤液用旋转蒸发仪浓缩，得到浸膏。以浸膏(克)：乙醇(升)＝1：10～1:20的比例用乙醇对所得浸膏进行萃取，萃取3～4次，每次3～4小时。将萃取所得溶液进行抽滤，沉淀层丢弃，乙醇抽滤层用旋转蒸发仪进行浓缩至无醇味。2、将浓缩至无醇味的浸膏用蒸馏水进行稀释，比例为水(升)：浸膏(克)＝10：1～30:1，把稀释的溶液抽滤，加入适量的20％硫氰酸钾，根据经验公式：“所需硫氰酸钾的质量”＝油菜籽粕质量*(7％～8％)312*97”。将硫氰酸钾溶液与稀释液充分混合，置于4℃冰箱中冷却48～72小时，后将沉淀层滤出，沉淀层即为所得芥子碱硫氰酸盐。滤除沉淀后，继续放置在4℃冰箱中冷却结晶12～24小时，取出过滤，如此反复结晶。将芥子碱硫氰酸盐沉淀用40℃～50℃的甲醇溶解，芥子碱硫氰酸盐(克)：甲醇(毫升)＝1：100～1：200；溶解后，趁热过滤，滤液层在室温下静置6～8小时，有灰色结晶物产生，将结晶刮出，放在减压干燥箱里干燥24～48h，就得到芥子碱硫氰酸盐的粉末。沉淀层再用40℃～50℃甲醇溶，有部分溶解，按照上面操作3～5次。得到纯度大于90％的芥子碱硫氰酸盐(结果用高效液相色谱检验)。芥子碱硫氰酸盐结构式：分子式：C16H24NO5.SCN，分子量：374。二、Morris水迷宫实验检测芥子碱硫氰酸盐对阿尔茨海默病动物的治疗作用本研究选择5月龄的APPswe/PS△E9转基因阳性鼠进行实验，并选择20只5月龄野生鼠作为对照组，这些小鼠在性别、体重相匹配，将转基因小鼠分为安慰剂组、芥子碱硫氰酸盐组(50mg/kg/d)。安慰剂组及野生对照组小鼠给予常规的标准鼠粮，芥子碱硫氰酸盐治疗组在常规的标准鼠粮中加入相应剂量的芥子碱硫氰酸盐，各组累计给药28天。鼠粮和饮水保持新鲜，每3天更换一次，治疗期间，小鼠常规饲养，环境温度为22-24℃。表1、Morris水迷宫实验检测芥子碱硫氰酸盐对阿尔茨海默病动物的治疗作用※与安慰剂比较差异具有统计学意义(P＜0.05)三、芥子碱硫氰酸盐对胆碱酯酶的抑制作用1、实验材料受试化合物：芥子碱硫氰酸盐，由大连大学生命科学与技术学院制药工程教研室合成；乙酰胆碱酯酶测试盒：南京建成生物工程研究所，批号20160113；其他试剂均为市售AR级；仪器设备：电子天平，卡特勒-托利多仪器(上海)有限公司，型号为AL104电热恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司，型号为HH-ZK2多功能酶标仪，上海多功能酶标仪，型号为SM800。2、方法2.1乙酰胆碱酯酶标准曲线绘制将1μmol/L，0.5μmol/L，0.25μmol/L，0.125μmol/L，0.0625μmol/L的乙酰胆碱酯酶标准品检测酶活性结果绘制成标准曲线。2.2配置芥子碱硫氰酸盐6个浓度梯度将芥子碱硫氰酸盐按照50mg/mL，25mg/mL，12.5mg/mL，6.25mg/mL，3.125mg/mL梯度配置。2.3芥子碱硫氰酸盐抑制乙酰胆碱酯酶结果按乙酰胆碱酯酶测试盒说明，于EP管中不同浓度的供试品溶液(芥子碱硫氰酸盐50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml)50μL，酶液50μL，底物缓冲液500μL，显色应用液500μL，混匀，37℃准确反应6分钟，加抑制剂30μL，透明剂100μL，混匀，静置15分钟，波长412nm，双蒸水调零，测各管吸光度OD值。并按下式计算抑制率：抑制率(％)＝[A对照‐(A样品‐A空白)]/A对照×100％其中，A对照为未加样品溶液时的吸光值；A样品为添加样品溶液的吸光值；A空白为未添加酶液时的样品溶液本体吸光值。结果：表2不同浓度的芥子碱硫氰酸盐对AChE的影响对数据线性回归，y(抑制率)＝0.0084x+0.29121，R2＝0.999。由表2、图1表明，随着芥子碱硫氰酸盐浓度的升高，其对AChE的抑制作用增强，芥子碱硫氰酸盐对AChE的半数抑制浓度为24.86mg/ml，在神经调节通路研究中，我们发现芥子碱硫氰酸盐在体内外均具有抑制AChE的作用，也就是说芥子碱硫氰酸盐可以通过抑制AChE，从而抑制了ACh的水解，使体内ACh堆积呈现出类似胆碱受体激动剂的效果。这一研究结果使我们颇为兴奋，因为在众多防治治疗阿尔茨海默病的药物种类中，AChE抑制剂是治疗治疗阿尔茨海默病最有效的药物之一，将具有AChE抑制作用的芥子碱硫氰酸盐开发为治疗阿尔茨海默病治疗药物具有极大可能性。且高血压又是治疗阿尔茨海默病三大危险因素之首，芥子碱硫氰酸盐如果能够同时实现降压且治疗治疗阿尔茨海默病将成为新一代治疗阿尔茨海默病治疗药物。四、芥子碱硫氰酸盐对钙离子通道的抑制作用实验原理：L‐型电压门控钙通道表达于细胞膜表面，其调节多个过程，包括兴奋性、收缩、基因表达和记忆存储。有机钙通道阻滞剂对L‐型电压门控钙通道的抑制作用是治疗高血压和心肌缺血的一种行之有效的药效学方法。A10细胞(大鼠主动脉血管平滑肌细胞)分离自正常大鼠主动脉组织。细胞呈长梭型，放射状生长，束状生长，平行排列呈峰谷状。体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。实验方法：膜片钳实验考察油菜籽粕芥子碱是否是通过抑制细胞膜钙通道发挥降压作用，从血管平滑肌细胞信号转导角度，揭示芥子碱降压机制。L‐型钙通道电流记录方法：将A10细胞(大鼠主动脉血管平滑肌细胞)钳制在‐40mV，使钠通道和T型钙通道失活，电极内液用CsCl代替KCl阻断K+电流外流。给予从‐40mV至0mV持续250ms的除极电压，获得L型钙通道电流。向反应体系内加入50mg/ml浓度的芥子碱，对比给予芥子碱硫氰酸盐前后通道电流随时间经过的变化状况，考察芥子碱硫氰酸盐洗脱后电流的恢复情况。记录给药前、给药中电流峰值和电流轨迹，计算芥子碱硫氰酸盐对A10细胞L‐型钙通道电流峰值的抑制率，考察这种抑制效应是否与浓度存在依赖性。表3芥子碱硫氰酸盐显著对L型钙通道电流作用在平滑肌调节通路中我们通过膜片钳技术检测了芥子碱硫氰酸盐对血管平滑肌细胞离子通道的影响，图2、图3、表3结果显示：芥子碱硫氰酸盐对电压依赖性钾通道没有影响，但对L型钙通道具有明显的阻断作用，低剂量(50mg/ml)时抑制率即可达到93±2％，而钙拮抗剂恰巧又是治疗阿尔茨海默病药物研发的又一新方向。五.芥子碱硫氰酸盐对血清中一氧化氮的抑制作用实验方法及过程：40只SD大鼠随机分为4组，每组10只。一组为空白对照组，其余三组为芥子碱硫氰酸盐低、中、高剂量组。采用20％乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠(5mL/kg)，将麻醉后的大鼠仰卧位固定，行颈部手术分离左侧颈总动脉，远心端用细线结扎，动脉夹闭塞动脉血管近心端，在分离的左侧颈总动脉处剪一个V形口，进行动脉插管，用细线将插管固定于动脉血管内，开放动脉夹，EP管采集插管内流出的血液样本，即给药前血液样品；各组采取股静脉给药方式给予相应药物：空白对照组，静脉给予0.9％生理盐水0.2mL，芥子碱硫氰酸盐低、中、高剂量组(分别静脉给予芥子碱硫氰酸盐25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL)0.2mL。给药1分钟后，分别采集实验动物血液样品。给药前后的血液样品室温下静止过夜，次日再将血液样品至于离心机中离心(4000r/min，10分钟)，移液器采集上层血清用于后续实验。NO试剂盒按说明书方法进行加样操作，在550nm下测定NO吸光度值。实验结果表明芥子碱硫氰酸盐具有抑制血清中NO含量的作用，但其作用仅在低剂量时抑制作用显著(P＜0.05)，中、高剂量的抑制作用反而不显著(图4)。NO作为血管舒张因子，其降低对我们预想的降压通路完全相反，但却对治疗阿尔茨海默病的治疗有益，因为芥子碱硫氰酸盐抑制NO含量可起到抗氧化的作用，从而通过抗氧化应激途径发挥治疗治疗阿尔茨海默病的作用。本发明实验表明：随着芥子碱硫氰酸盐浓度的升高，其对AChE的抑制作用增强，芥子碱硫氰酸盐对AChE的半数抑制浓度为24.86mg/ml。芥子碱硫氰酸盐对电压依赖性K通道没有影响，但对L型钙通道具有明显的阻断作用，低剂量(50mg/ml)时抑制率即可达到93±2％，而钙拮抗剂恰巧又是治疗阿尔茨海默病药物研发的又一新方向。NO作为血管舒张因子，其降低与我们预想的降压通路完全相反，但对治疗阿尔茨海默病的治疗有益，因为芥子碱硫氰酸盐抑制NO含量即可起到抗氧化的作用，从而通过抗氧化应激途径发挥治疗治疗阿尔茨海默病的作用。综上，芥子碱硫氰酸盐是治疗治疗阿尔茨海默病的新药物，验证了本发明的另一个目的，就是给出了芥子碱硫氰酸盐在治疗阿尔茨海默病的应用，其应用包括：芥子碱硫氰酸盐对胆碱酯酶的抑制作用，芥子碱硫氰酸盐对钙离子通道的抑制作用，芥子碱硫氰酸盐对血清中一氧化氮的抑制作用。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明技术披露的范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖与本发明的保护范围之内。