技术领域本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR标量阳性对照建立的马驽巴贝斯虫病检测试剂盒，用于马属动物感染马驽巴贝斯虫病的临床诊断和日常监测。
背景技术：
马驽巴贝斯虫病是由马驽巴贝斯虫(Babesiacaballi)寄生于马属动物红细胞内所引起的一种血液原虫病，病畜多表现为贫血、黄疸、高热稽留、厌食、消瘦等临床症状。本病尤其对出入境动物危害严重，被OIE列为B类疫病。目前，市面上流通的治疗马驽巴贝斯虫病的药物效果一般，由于新疆特殊的地理环境条件，媒介蜱分布广而多，该病的发病率在我区(新疆)呈逐年上升趋势，严重影响了马产业的发展。因此，为了综合防治该病在我区发生和流行，必先建立特异性强、检出率高的诊断方法及时进行检疫马，故马驽巴贝斯虫病荧光PCR快速检测试剂盒的研制是我区兽医工作者努力研究、亟待解决的新课题之一。目前，对马驽巴贝斯虫病诊断方法大致可分为病原体显微镜检测方法、血清学诊断方法和分子生物学技术诊断方法。基层疫病监测部门该病的诊断仍停留在传统的镜检法，且受到制片与染色技术等多种因素的影响，易造成漏诊和误诊，特别是相似形态虫体的鉴别诊断以及大规模的流行病学调查较为困难。常规血清学诊断方法存在着抗原来源不足、敏感性和特异性较差等问题，且马驽巴贝斯虫体外培养尚未成功。所以在我区，每年的3～7月份，大量马因马驽巴贝斯虫病死亡，故唯一可行的，是借鉴流行病学研究，创建实用、简便、经济、灵敏度高的新诊断体系。荧光PCR检测技术作为一种较新的检测方法，尤其是目前在动物疾病研究领域应用十分广泛。与普通PCR技术相比较，实时荧光定量PCR技术的优势十分显著：操作简便，无需在扩增后进行凝胶电泳成像；由于省去了开盖后出现的二次污染，使得该技术出现假阳性的几率大大降低；通过计算机系统的介入，该方法可以对扩增过程进行实时定量监控，可对扩增产物进行准确的定量分析。荧光定量PCR原理是将荧光物质或具有荧光信号的特异性探针通过与靶基因的特异性结合，仪器实时监控每一个封闭的PCR反应，系统软件根据荧光信号的强弱自动绘制反应曲线，从而对整个PCR反应过程的荧光信号的增减进行实时监测。在荧光定量PCR技术中，值得了解的是Ct值，其中的C所代表的含义为Cycle，t所代表的含义为threshold，表示每个扩增反应达到阈值时所经历的循环数，每个样本的初始拷贝数与Ct值成线性相关，所以当Ct值很小时，就表示起始拷贝数很多。因此，当我们利用确定的标准品即可绘制出该标准品的标准曲线，由于特异性探针的所发出的报告基团荧光强度与PCR扩增产物数量表现为线性相关，当获知待测样本的Ct值后，就可从根据标准曲线计算出该样品的起始拷贝数，实现定量分析。近年来，马驽巴贝斯虫诊断技术逐步创新，从最早的显微镜观察虫体到现在的应用分子生物学手段检测马驽巴贝斯虫。1993年我国孔凡勇对马梨形虫病进行了马梨形虫病病原体显微镜检测。Camacho等(2005)对60匹马进行IFAT检测，马驽巴贝斯虫阳性率为28.3％。Kappmeyer等(1999)建立了马驽巴贝斯虫棒状蛋白重组抗原ELISA方法，cELISA方法的阳性率达49.5％。YohTamaki等(2003)应用Babesiacaballi棒状蛋白克隆并表达了重组蛋白BC134，可用于ELISA检测。Bashiruddin等(1999)建立了PCR检测方法，该试验对23份葡萄牙马匹进行了检测，结果表明发病率为34.8％。Badgar等(2001)对传播马梨形虫病的媒介蜱虫感染马梨形虫病应用PCR方法进行检测，结果表明54个样品中马驽巴贝虫染病率达到12.9％。Alhassan(2005)根据18SrRNA基因序列设计出了能够同时检测两种病的双重PCR方法。薛书江等(2007)利用马驽巴贝斯虫Bc48基因序列设计、合成特异性引物，建立了马驽巴贝斯虫病PCR检测方法，对35份采集样本进行检测发现阳性率为20％。Pitel等(2010)提取35匹患马梨形虫病却没有明显临床病症的马匹骨髓进行PCR扩增以检测是否感染马梨形虫病，检测结果显示普通PCR检测与在显微镜下检测符合率达100％。从血液涂片镜检到现在的PCR诊断技术，马驽巴贝斯虫病的检测技术正在逐步发展创新。在前期工作基础上，我们分离地方虫株(新疆虫株)，对其Bc-48基因克隆、表达。在上述基础，我们在引物、探针的设计、试剂用量、体系建立、条件的优化及配套组装试剂盒等方面进行探讨，最终研发了马驽巴贝斯虫病荧光PCR诊断试剂盒。用其快速、特异、价廉的诊断试剂，进行检测和防控马驽巴贝斯虫病，从而净化马群，根除该病对养马业的危害，保障畜牧业的健康发展。
技术实现要素：
本发明的目的：本发明的目的是提供一种马驽巴贝斯虫快速诊断技术及试剂盒解决常规检测试剂盒昂贵、特异性差、耗时等缺点。为解决现阶段马驽巴贝斯虫检测本发明通过设计检测引物和荧光探针，结合荧光定量PCR系统绝对定量分析，通过优化反应体系和循环条件，建立马驽巴贝斯虫病荧光PCR检测方法。并建立一种基于荧光定量PCR标量的马驽巴贝斯虫病荧光PCR检测试剂盒，适用于马驽巴贝斯虫病的临床诊断和流行病学监测。本发明的技术方案如下：一种用于检测马驽巴贝斯虫病(Babesiacaballi)的遗传标记物，其具有SEQIDNO.4所示的序列或其特异性片段。用于扩增上述遗传标记物的特异性引物对，其核苷酸序列为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示：上游引物：5’-CGCATTTGCAGTCAGGTCC-3’下游引物：5’-ACTGGTAGGGCTCAGGAAGG-3’。与上述的引物配合使用的荧光探针，其核苷酸序列为SEQIDNo.3所示：5’-AGGGGAGTAACTGCAGTGCTTCCGT-3’。一种检测马驽巴贝斯虫病的试剂盒，含有上述特异性引物对和上述荧光探针。还包括荧光定量PCR反应试剂，阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为马驽巴贝斯虫病的标准阳性模板，阴性对照品为灭菌去离子水。上述试剂盒，采用荧光PCR方法进行检测，制定标准阳性模板，其25μL反应体系为：试剂盒中的引物、探针荧光PCR工作程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，60℃变性45s，40次循环。上述试剂盒采用荧光定量PCR方法进行检测，优化后的荧光定量PCR反应体系为25μL：将上述的特异性引物对和荧光探针在制备检测马驽巴贝斯虫病试剂盒中的应用。实现方式，发明人下载GenBank数据库中已报道的不同国家和地区的马驽巴贝斯虫Bc-48基因序列，通过DNAMAN软件分析下载序列的同源性，找出特异性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，将该靶序列作为检测马驽巴贝斯虫病的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段只可作为检测马驽巴贝斯虫病的遗传标记物。设计检测引物、荧光探针和获得地方阳性目的基因片段①通过比对GenBank登录的马驽巴贝斯虫Bc-48基因保守序列，使用PrimerPrimier5和PrimerExpress3.0软件设计一对引物和一条探针，目的片段大小为157bp，由北京鼎国生物技术有限公司合成。②根据全血DNA提取试剂盒使用说明提取含有虫株的全血DNA，对提取的虫株全血DNA进行常规PCR扩增，PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测后使用胶回收试剂盒回收和纯化，将回收、纯化后的PCR产物与pEASY-T1Vector连接，构建质粒载体并送至北京鼎国生物技术公司进行测序分析，鉴定正确的质粒作为标准品并对其浓度进行测定。反应体系为25μL：10×PCRBuffer(Mg2+plus)2.5μL，dNTP(2.5mM)2μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.15μL，上、下游引物(10pM)各1μL，模板DNA1.5μL，ddH2O补足25μL。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸5min，扩增157bp的目的基因片段。目的基因的克隆、测序①PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测后使用胶回收试剂盒回收和纯化，将回收、纯化后的PCR产物与pEASY-T1Vector连接，再转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，经Amp+/LB培养基扩大培养后，运用PlasmidPurificationKit提取菌体质粒，并对质粒进行PCR鉴定。②将PCR鉴定为阳性的重组质粒和克隆菌送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序，测序结果与Bc-48基因(登录号：AB731211)序列进行相似性比对。建立马驽巴贝斯虫病实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)检测方法①鉴定正确的质粒作为标准品并对其浓度进行测定。以制备的标准阳性重组质粒为模板，采用矩阵法优化最佳浓度配比，最终建立如下反应体系：2×Real-TimePCRMix，引物(10μmol)各1μL，探针(10μmol)1μL，荧光校正液0.5μL，模板DNA1μL，加灭菌双蒸水至25μL体积。反应条件为：95℃2min；95℃10s、56℃40s，45个循环；每个循环延伸结束时采集荧光信号。②对测定好浓度的标准阳性质粒使用TEBuffer进行十倍倍比稀释(5.17×1010-5.17×101copies/μL)，于-20℃保存。按优化好的体系及条件对倍比稀释的阳性质粒进行实时荧光PCR，绘制标准曲线。以10倍系列梯度浓度(5.17×1010copies/μL～5.17×101copies/μL)的阳性重组质粒作为模板进行实时荧光PCR反应。模板浓度与Ct值呈良好的线性关系，斜率为-3.109，截距为42.01，从而可以得出标准曲线回归方程式：Ct＝-3.109×log拷贝数+42.01，相关系数R2＝0.9996。而待测样品的Ct值可以从仪器读取；把待测样品的Ct值代入表达式就可算出它的初始拷贝数。③对倍比稀释的阳性质粒进行实时荧光PCR试验，观察其最低能检测到的阳性质粒拷贝数，同时利用本实验设计的引物对倍比稀释的阳性质粒进行常规PCR扩增，观察常规PCR所能检测到的最低阳性拷贝数，并对二者的结果进行对比。结果显示，当浓度为5.17×101copies/μL时荧光PCR依然有扩增曲线，而常规PCR检测浓度为1.75×103copies/μL，说明常规PCR检测浓度远低于荧光定量PCR。④特异性试验：提取B.Caballi、Theileriaequi、Babesiabigemina、Theilerdiaannulata、Theilerdiasergenti和健康马血的DNA作为模板，用双蒸水做为空白对照，进行荧光定量PCR扩增，进行特异性试验，评价试验的特异性。结果显示只有B.caballi有特异性曲线，Theileriaequi、Babesiabigemina、Theilerdiaannulata、Theilerdia.sergenti和健康马血均无曲线，表明建立的荧光定量PCR方法对B.caballi具有较好的特异性。⑤选取5.17×106copies/μL～5.17×103copies/μL4个浓度的阳性模板进行组内和组间重复性试验，根据扩增反应的Ct值，计算变异系数(CV)，结果组内试验CV＜1.12％；组间重复性试验CV＜1.25％，表明所建立的方法具有较好的稳定性。⑥对采集于巴州地区和伊犁地区的共90份疑似病例马全血分别应用实时荧光PCR、常规PCR以及血液涂片进行检测，结果显示，荧光定量PCR检出48份阳性，常规PCR检出27份阳性，血液涂片检出10份阳性，常规PCR检出的阳性样品荧光PCR均显示为阳性，实时荧光PCR和常规PCR的检出阳性率分别为53％和30％，表明该荧光定量PCR有良好的临床灵敏性和实用性。有益效果：运用该检测试剂盒监测我区(新疆地区)马属动物马驽巴贝斯虫病，结合淘汰患畜的措施从而净化马群，根除该病对养马业的危害，保障畜牧业的健康发展，为保障我区畜牧业的健康发展奠定了良好的基础。附图说明附图1为：重组质粒PCR鉴定结果，其中：M.DNA分子质量标准；1.重组质粒PCR扩增产物；2.阳性对照；3.阴性对照；附图2为：PCR扩增产物序列比对结果；附图3为：PCR产物的电泳分析，其中：M.DNA分子质量标准；1～2.马驽巴贝斯虫阳性DNA的扩增产物；附图4为：荧光定量PCR动力学曲线和标准曲线，其中：1-10：5.17×1010copies/μL～5.17×101copies/μL；附图5为：荧光定量PCR特异性试验扩增曲线。具体实施方式实施例1、设计检测引物、荧光探针和获得地方阳性目的基因片段，发明人根据已发表的Bc48基因序列设计特异性引物如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，设计的特异性引物利用PCR技术扩增新疆地方虫株基因组获得目的抗原基因，作为特异性的目的抗原基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，将该目的抗原基因序列作为检测马驽巴贝斯虫病的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段只可作为检测马驽巴贝斯虫病的遗传标记物。获取目的抗原基因：(1)根据已发表的Bc48基因序列设计特异性引物如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示和探针如SEQIDNo.3所示；(2)利用PCR技术从地方虫株基因组中扩增目的抗原片段基因(参见附图1)；(3)马驽巴贝斯虫新疆株Bc48基因的克隆与表达：构建地方株Bc48-ZY原核克隆质粒，测序鉴定(参见附图2)。实施例2、马驽巴贝斯虫荧光PCR检测方法的建立：(1)应用特异性引物进行常规扩增(参见附图3)；(2)应用特异性引物和探针进行荧光扩增；(3)荧光PCR扩增体系的优化；(4)荧光PCR方法的灵敏性、特异性、稳定性的比较(参加附图4、附图5、附图2)；(5)荧光PCR方法与其它检测、诊断结果相比较，检测其符合率。实施例3、马驽巴贝斯虫病荧光PCR检测试剂盒的研制(1)试剂盒用途：本试剂盒用于检测马是否患有马驽巴贝斯虫病，是检测马属动物血液样品中是否含有马驽巴贝斯虫，这种检测方法可以用于流行病学研究和制定降低马驽巴贝斯虫在马群中流行的“净化马”措施。(2)试剂盒的原理：本试剂盒采用MGB荧光PCR检测方法，TaqManMGB探针是在TaqMan探针的基础上改进的，与TaqMan探针最大的不同之处在于其长度长度可缩短到13bp，荧光基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，在探针3’端标记了自身不发光的淬灭基团，荧光本底降低，是荧光管够分辨率大大提升而降低本底信号干扰；其次是探针3’端结合物，能结合双链DNA小沟部位，使探针有更好的特异性、敏感性，探针的Tm值提高，使其更具稳定性。(3)试剂盒的组成及试剂配制试剂盒组成(48T/kit)规格数量说明书1份2×Real-TimePCRMix1ml1管5-->荧光校正液0.5ml1管DEPC水1ml1管马驽巴贝斯虫阳性对照0.1ml1管马驽巴贝斯虫阴性对照0.1ml1管(4)试剂盒的保存条件及有效期：本试剂盒于-20℃保存，有效期为6个月。适用仪器：ABI7500，9600系列；Bio-Rad等荧光定量PCR仪均可；自备材料：荧光定量PCR仪；精密移液器及一次性吸头；八连管；冰盒；PCR管架等。(5)样本要求：样本采集选取有发热、贫血、黄疸、消瘦等相关临床症状的马匹，或被蜱虫叮咬过的马匹血液。血液采集后应及时进行DNA提取，并进行荧光PCR检测。若条件不允许，未能及时提取DNA，可先将血液置于-20℃冰箱保存，并及时提取DNA。(6)试剂盒操作及注意事项①荧光PCR灵敏度高，因此极易出现污染，因此在试验过程中应分别配备独立的配液室和上样室，保证PCR试剂和样品分开加样，以避免阳性样品污染试剂。②荧光PCR需要收集八联管或96孔板管盖和板盖内的荧光信后，因此在操作过程中，一定要保证管盖和板盖表明情节，以免荧光信号的收集出现误差。③PCR试剂、引物及Taq酶在常温下容易降解失火，因此在加样过程中，需要全程在冰盒上完成。④样品加样完毕后，应进行震荡使试剂完全混匀，同时瞬时离心，以离心下粘附在管壁和管盖表明的试剂，并立即置于荧光PCR仪内进行扩增。实施例4、实验方法：(1)将2×Real-TimePCRMix、DEPC水、10pM上游引物、10pM下游引物、10pM荧光探针、荧光校正液置室温平衡，即每个测试反应体系配制为：2×Real-TimePCRMix12.5μl+上游引物、下游引物、荧光探针各1μl+荧光校正液0.5μl+DEPC水8μl；(2)加入模板：将保存在-20℃的核酸提取物置室温解冻，阴、阳性对照使用前置室温解冻。在每个PCR反应管中分别加入模板或阴、阳性对照各1μl，盖好管盖，置于PCR仪上，记录相应样品号；(3)上机扩增：反应条件为95℃：5min，1个循环；95℃：15s，60℃：45s(信号收集)，40个循环。反应体系为50μl。信号采集时设定为FAM荧光素；(4)结果判定：a检测样品Ct值≤35.0时，报告阳性；b检测样品Ct值>35.0且Ct值<40时，需重复检测一次，如果Ct值仍<40，但曲线有明显的对数增长特性，报告为阳性，否则报告为阴性；c样品不显示Ct值时，报告阴性。实施例5、马驽巴贝斯虫病荧光PCR检测试剂盒的临床使用：应用建立的马驽巴贝斯虫荧光PCR检测方法对新疆伊犁地区采集的90份马血DNA进行检测，得出马驽巴贝斯虫阳性率达53.3％(48/90)。表2荧光定量PCR重复性试验缩略语和关键术语定义：下列缩略语适用于本标准：Bc-ZY：新疆株Bc48基因序列原核克隆载体；MGB探针：新型荧光探针；PCR：聚合酶链式反应；Taq：栖热水生菌DNA聚合酶；dNTP：脱氧核糖三磷酸；MGB：小沟结合分子。