本发明属于分子生物学检测
技术领域：
：，具体涉及一种用于检测SEPT7P2-PSPH融合基因的引物对、探针以及试剂盒。
背景技术：
：：鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma，NPC)是一种地区分布极不均衡的恶性肿瘤，为恶性度较高的肿瘤之一，其发病率为耳鼻咽喉科恶性肿瘤之首。中国是鼻咽癌高发区，据世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构(IARC)的资料，在全球统计的年鼻咽癌新发病例64796人中，中国达28022人，占43.2％；除了广东省和华南其他四个高发省份湖南、江西、广西和福建之外，东南亚、非洲和地中海周围的一些国家也具有较高的发病率，这些人口加起来，鼻咽癌威胁人数超过4亿。据移民流行病学研究显示，中国高发区居民移居美国、澳大利亚等低发国家数年后，鼻咽癌发病率虽然有所下降，但仍远高于当地居民，因此鼻咽癌被俗称为“中国癌”(Chinesecancer)，提示虽然居住环境发生改变，但其自身的遗传素质很可能是鼻咽癌持续高发的重要因素之一。鼻咽癌(NPC)是一种多基因遗传性疾病(polygeneticdiseases)，其发病与遗传因素(遗传易感性)、EB病毒感染、环境因素、饮食习惯等多种致瘤因素有关。鼻咽癌发病部位隐蔽，特别是在咽隐窝及鼻咽顶壁处，早期症状不明显，容易延误诊断和治疗。许多专家学者一直致力于寻找有效的方法来辅助鼻咽癌的早期诊断，疗效观察及预后判断，但目前鼻咽癌的发病机制还不十分清楚，治疗效果也不理想，5年生存率仍徘徊在50％左右，其原因主要与鼻咽癌发病部位隐蔽、鼻咽部组织构成复杂，治疗方式较单一、缺乏特异性治疗药物有关，且不同的鼻咽癌患者在病理类型、肿瘤分化程度、就诊时病变严重程度、临床表现、体质状况、对放化疗敏感性方面都存在着不同程度的差异。伴随分子生物学技术的发展，与鼻咽癌相关的生物学标记愈来愈受到关注，如果能够找到这些人群易感的机制，鉴定一个或数个鼻咽癌易感基因，就可针对性地研制高危人群筛查试剂盒，早期诊断试剂盒，还可开发出特异的新靶点药物，不仅具有重要的理论价值和学术意义，还将具有重大的经济价值和社会效益。因此，寻找鼻咽癌早期诊断及预后相关的特异性分子标志物对实现鼻咽癌的早期诊断及个体化治疗具有深远意义。SEPT7P2(septin7pseudogene2,ENSG00000214765,synonyms:DKFZp313J1114,SEPT13,SEPT7B)，定位在7号染色体7p12.3，负链，有13个外显子，目前发现由于可变剪切可以有9种转录本，为假基因不编码蛋白。Septins家族是保守的GTP结合蛋白，能够作为dynamic,regulatablescaffolds募集其他蛋白，与膜动力、囊泡运动、凋亡、细胞骨架重组、感染、神经退行性变和肿瘤的形成密切相关。PSPH(PhosphoserinePhosphatase)属于磷酸转移酶亚家族，该基因表达的蛋白属于磷酸转移酶(phosphotransferases)亚家族，PSPH定位在7号染色体短臂7p11，调控L-丝氨酸合成的第三步和最后一步，催化依赖于镁离子的L-磷酸丝氨酸，也参与L-丝氨酸和L-磷酸丝氨酸的互换。这个酶负责L-丝氨酸合成第三步和最后一步，催化镁离子依赖的L-磷酸丝氨酸的水解，同时参与L-丝氨酸和L-磷酸丝氨酸的互换作用。涉及的生物通路主要是丝氨酸合成代谢和碳代谢通路.丝氨酸通路为蛋白、核酸、酯类的合成提供必须前体，所以该代谢对细胞增殖包括肿瘤细胞有重要作用。多年来已有报道从基因组和功能证明丝氨酸合成通路的激活引起肿瘤。Pubmed文献中报道，70％的三阴乳腺癌细胞株中丝氨酸合成通路都上调，调控丝氨酸和甘氨酸的合成，促进肿瘤生长，丝氨酸合成通路与肿瘤形成、转移有关。SEPT7P2和PSPH这两个基因相邻，均位于染色体7上，正常情况下是负链转录，当发生病变时，SEPT7P2基因的1号外显子exon1和PSPH基因的4号外显子exon4融合成通路的激活引起肿瘤。研究表明，SEPT7P2-PSPH融合基因可能存在于包括鼻咽癌在内的多种实体肿瘤内，但以鼻咽癌的检出率最高，SEPT7P2-PSPH融合基因患者具有鲜明的临床特征，提示该靶点是鼻咽癌特异性较高的分子标记物。SEPT7P2-PSPH融合变异日前已经被鉴定为鼻咽癌的一个独特的分子亚型。SEPT7P2-PSPH融合基因阳性患者有其独特的临床病理特征；针对这一靶点的检测，将有助于鼻咽癌早期诊断及开发特异的靶点药物并开启鼻咽癌靶向治疗的新领域。目前国际上检测融合基因常见的技术方法有：逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)和免疫组织化学(IHC)等。RT-PCR是PCR的一种广泛应用的变形，在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR可能是确认融合基因的一种快速诊断方法，理论上，这种技术的优势在于其检测突变转录体的高敏感性，如发现扩增产物则意味着融合基因。但在临床实践中，该技术面临诸多挑战：(1)操作步骤繁琐，易污染；(2)福尔马林固定石蜡包埋的组织DNA高度片段化，不利于检测；(3)PCR结果常出现假阳性，很难作为常规临床检测方法。FISH是用特定荧光标记探针与靶DNA进行杂交，通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，在荧光显微镜下观察探针标记或位点的技术。FISH是检测融合基因更加特异的方法，其优势在于可商业开发系列探针，应用于检测融合基因。虽然FISH是一种敏感和特异的检测融合基因的方法，但也并非万无一失的，不同数量断裂信号的治疗策略以及结果判读目前仍无统一标准。此外FISH检测的实验操作较复杂，标本处理不当时较难以检出，易出现假阳性的结果，费用较高，需要一定的设备，使FISH在临床的应用不易推广。IHC是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。IHC的最大优势是检测肿瘤特异性抗原的表达而不丢失能鉴别正常组织和病理组织的细胞和组织结构特征。对于活检组织切片使用组织染色来检测蛋自表达，结果可能是微弱和局部的，同时IHC方法总是存在一定的主观性，对弱阳性结果的判断需要进一步用FISH等技术来验证。实时荧光定量PCR技术(rea1-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCR)于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。但目前还未见有应用荧光定量PCR技术对SEPT7P2-PSPH融合基因进行检测的报道。因此，亟需开发一种敏感性高、特异性强，并且能快速简便的检测SEPT7P2-PSPH融合基因的产品和方法。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明人经过创造性的劳动和大量的试验，得到了能够用于检测SEPT7P2-PSPH融合基因的引物对和探针，并且惊奇的发现，所述引物对和探针检测SEPT7P2-PSPH融合基因的特异性强、灵敏度高。由此提供了下述发明：本发明的一个方面涉及一种引物对(包含两条引物)，其中一条引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。正向引物：Variant1-ForwardPrimer：5’-AGAAGGTGCAACCGATCGC-3’(SEQIDNO.1)；反向引物：Variant1-ReversePrimer:5’-TCCTCAGCTCTGAGTGGGAGAC-3’(SEQIDNO.2)。上述引物对能够用于检测SEPT7P2-PSPH融合基因。本发明的另一方面涉及一种探针，其包含SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。探针序列：Variant1-Taqman-Probe:5’-CTGAGCCTGGGAGGAA-3’(SEQIDNO.3)。本发明的探针能够用于检测SEPT7P2-PSPH融合基因。具体的，所述探针带有可检测的标记，探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。所述荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为MGB。所述探针的3’端还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽。由于TaqMan-MGB探针的3’端采用了非荧光性的淬灭基因来吸收报告基团的能量，吸收能量后并不发射荧光，大大降低了本底信号的干扰。此外，TaqMan-MGB探针的3’端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值，而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高。在实验结果的准确性、重复性、特异性、灵敏度等方面均优于普通TaqMan探针。本发明的还一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明的引物对和探针。上述试剂盒中，还包含PCR反应缓冲液和Taq酶。上述试剂盒中，所述引物对和探针溶于PCR反应缓冲液中，浓度均为5uM。上述试剂盒中，还包含阳性对照，所述阳性对照为包含所检测SEPT7P2-PSPH融合基因基因组片断的DNA质粒。在本发明的一个具体实施方案中，所述的试剂盒，包含：荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM，阳性对照，2*TaqmanuniversalPCRMasterMix(购自美国应用生物公司)和ddH2O。本发明的试剂盒能够用于检测SEPT7P2-PSPH融合基因。本发明的还一方面涉及一种非诊断目的的检测SEPT7P2-PSPH融合基因的方法，包括使用本发明的引物对、探针或者试剂盒的步骤。在本发明的一个具体实施方案中，所述的非诊断目的的检测SEPT7P2-PSPH融合基因的方法，包括下述步骤：采用上述引物对对待测样品的目的基因进行PCR扩增，利用Taqman探针对扩增产物进行特异性微点检测，根据PCR扩增后荧光信号的强弱对SEPT7P2-PSPH融合基因进行定性或定量检测。上述方法，所述PCR扩增的条件为：95℃预变性60秒；按95℃15秒，60℃20秒，扩增反应15个循环；再按95℃15秒，58℃34秒，扩增反应40个循环。本发明的还一方面涉及本发明的引物对、探针或试剂盒在制备检测SEPT7P2-PSPH融合基因的试剂中的用途。本发明对SEPT7P2-PSPH融合基因检测的原理为：采用荧光定量PCR方法对SEPT7P2-PSPH融合基因进行定量检测。针对SEPT7P2-PSPH融合基因变体的保守序列特异设计TaqMan探针及引物一对，当遇到SEPT7P2-PSPH融合基因相应融合变体特定基因序列时，TaqMan探针可与之完全结合，PCR扩增时，荧光报告基团因酶解分离而发出荧光，能够实时检测相应荧光信号的积累，从而实现检测SEPT7P2-PSPH融合基因的目的。需要说明的是，SEPT7P2-PSPH融合基因变体的保守序列目前还未有报道，因此，在设计引物时需要对SEPT7P2-PSPH融合基因变体的保守序列进行筛选比对以及实验验证，在选定好保守序列之后再进行引物设计，这无疑大大增加了引物设计的难度。本发明针对的是SEPT7P2-PSPH融合基因变体的检测，其中，SEPT7P2基因的exon1和PSPH基因的exon4融合。本发明在引物设计过程中首先按常规的融合基因的引物设计方法，将引物设计在SEPT7P2基因的第1号外显子或PSPH基因4号外显子上(引物序列参见实施例1的表1中Variant1-ForwardPrimer1、Variant1-ReversePrimer1)，虽然能检测出大多数的融合基因变体，但容易出现漏检的或假阳性的现象。由于SEPT7P2断点的上游序列为假基因，正常情况下不表达蛋白；PSPH断点在起始密码之前，理论上融合之后，包含整个编码蛋白的区域。用NCBIORFfingder预测融合后序列的开放阅读框，发现有多种可能性，因此，增加了对SEPT7P2-PSPH融合基因变体的保守序列的筛选比对和实验验证的难度，本发明经过多次试验验证后发现，以融合点上游19个碱基和融合点下游241个碱基作为保守序列设计引物，可以在保证扩增效率和扩增特异性的基础上，实现对SEPT7P2-PSPH融合基因变体的准确、全面检测，临床试验表明，采用本发明优化的引物和探针进行检测，无假阳性和假阴性的检测结果。本发明采用的TaqMan-MGB探针，与传统的TaqMan-TAMRA探针相比较，MGB探针具有提高TM值，使探针的长度缩短，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异；提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；更简化实验，MGB探针实验优化步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高等优势。本发明提供的两端都标有荧光发光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，TaqDNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5′-3′外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。本发明的有益效果：(1)本发明首次建立了SEPT7P2-PSPH融合基因的检测方法，利用此检测方法可以对待测样品中的SEPT7P2-PSPH融合基因进行定性或定量检测。(2)检测灵敏度高，特异性好：针对SEPT7P2-PSPH融合基因变异体保守序列设计了特异性引物和荧光探针，提高检测敏感性和特异性，假阳性低。(3)线性关系好，可定量检测，由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小。(4)操作简单，自动化程度高，荧光定量PCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少，因此也就降低了结果偏差的几率。(5)结果判读明确、直观，可对结果进行定量分析。荧光定量PCR法结果的判读：在域值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本，结果判读非常简单、直观。(6)安全：整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。(7)没有后处理，不用杂交、电泳、拍照。附图说明图1：SEPT7P2和PSPH融合的位置示意图；图2：SEPT7P2-PSPH融合基因的FQ-PCR图；图3：正常野生型基因的FQ-PCR图；图4：SEPT7P2-PSPH融合基因的测序结果图。具体实施方式结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。实施例1：特异性引物和探针的筛选试验1.检测SEPT7P2-PSPH融合基因的引物和探针设计本发明人设计了针对SEPT7P2-PSPH融合基因的多个荧光定量PCR扩增引物和探针，具体序列如表1所示。表1用于检测SEPT7P2-PSPH融合基因的引物和探针2.荧光定量PCR的反应体系及条件SEPT7P2-PSPH融合基因荧光定量PCR检测的反应体系和反应条件如下：反应体系为25μL，荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM)2μL，样品模板DNA2μL(100-300ng/μL)，2*TaqmanuniversalPCRMasterMix(购自美国应用生物公司)15μL，ddH2O6μL。反应条件为：95℃预变性60秒；按95℃15秒，60℃20秒，扩增反应15个循环；再按95℃15秒，58℃34秒，扩增反应40个循环。3.结果判定对比不同的引物对与探针组合的扩增情况，遵循特异性原则、敏感性原则和最高扩增原则，选定特异性好，敏感性高，可靠性好的SEPT7P2-PSPH融合基因检测用引物对和探针组合。引物和探针的具体优化筛选方法如下：任选一对引物与一条探针进行组合，以能同时获得最小的Ct值和最高的扩增效率(根据荧光PCR仪提供的“PCREfficiency”数据报告，数值越高扩增效率越高)为筛选标准，选出最佳引物与探针组合。通过多次反复、对比试验，选定SEPT7P2-PSPH融合基因检测用引物对与探针的最佳组合，其具有非常好的特异性和最优的扩增效率，组合筛选结果图略，具体序列见表2。表2：引物对与探针的优选组合名称序列(5，-3，)Variant1-ForwardPrimer3AGAAGGTGCAACCGATCGCVariant1-ReversePrimer4TCCTCAGCTCTGAGTGGGAGACVariant1-Taqman-Probe1CTGAGCCTGGGAGGAA实施例2：用于SEPT7P2-PSPH融合基因检测的试剂盒试剂盒的组成包括：荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM，阳性对照，2*TaqmanuniversalPCRMasterMix(购自美国应用生物公司)和ddH2O。引物和探针为实施例1中筛选优化得到的。阳性对照为包含所检测SEPT7P2-PSPH融合基因基因组片断的DNA质粒，为现有技术常规方法制备得到。采用该试剂盒进行临床检测时的扩增体系及扩增方法为：反应体系为25μL，荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM)2μL，样品模板DNA2μL(100-300ng/μL)，2*TaqmanuniversalPCRMasterMix(购自美国应用生物公司)15μL，ddH2O6μL。反应条件为：95℃预变性60秒；按95℃15秒，60℃20秒，扩增反应15个循环；再按95℃15秒，58℃34秒，扩增反应40个循环。实施例3：试剂盒的灵敏度检测取含有SEPT7P2-PSPH融合基因基因组片断DNA质粒(宝生物工程(大连)有限公司合成)，进行梯度稀释，至浓度分别为101拷贝/微升、102拷贝/微升、103拷贝/微升、105拷贝/微升，作为样品。然后采用实施例2的试剂盒在优化反应体系进行ARMS-qPCR的检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM)2μL，样品模板DNA2μL(100-300ng/μL)，2*TaqmanuniversalPCRMasterMix(购自美国应用生物公司)15μL，ddH2O6μL。反应条件为：95℃预变性60秒；按95℃15秒，60℃20秒，扩增反应15个循环；再按95℃15秒，58℃34秒，扩增反应40个循环。结果表明本发明的试剂盒可以准确检测SEPT7P2-PSPH融合基因变体，最低能够检测到10拷贝SEPT7P2-PSPH融合基因中的基因突变。实施例4：临床样本检测在检测者知情同意的情况下，采集样本，各样本均获自中山大学附属肿瘤医院，样本数量为148例，采用本发明实施例2的试剂盒进行检测，检测方法为：将提取的样本DNA在PCR反应管内采用本发明的试剂盒进行检测。反应条件为：95℃预变性60秒；按95℃15秒，60℃20秒，扩增反应15个循环；再按95℃15秒，58℃34秒，扩增反应40个循环。检测结果表明，所检测的148例样本中有4例发生了SEPT7P2-PSPH融合基因突变。所有的样本均经过直接测序检测验证，结果与采用本发明的试剂盒的分型检测结果完全一致，说明本发明的试剂盒及其检测方法准确、有效，特异性强，检测结果无假阳性和假阴性。部分样本的检测的FQ-PCR图如图2和图3所示，其中，图2为其中1例阳性样本的FQ-PCR图，具有典型的S型扩增曲线；图3为阴性样本(即正常野生型基因型)的FQ-PCR图，无扩增曲线。将荧光定量检出的阳性样本进行测序验证，结果如图4所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的SEPT7P2-PSPH基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。说明采用本发明的试剂盒能够准确地确定SEPT7P2-PSPH基因融合突变情况。本发明试剂盒可在两小时内完成检测盒出具检测报告，包括样本DNA的提取需要1小时左右，荧光定量PCR的检测1小时左右。当前第1页1 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