一种快速扩增生产细菌纤维素菌种的方法与流程

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种快速扩增生产细菌纤维素菌种的方法。

背景技术：

细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是指在不同条件下，由醋酸菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)等中的某种微生物合成的纤维素的统称。与天然纤维素相比，细菌纤维素具有高纯度、高结晶度、高抗张强度及高持水能力等优点，被认为是目前世界上性能最好的纤维素。作为一种新型的生物材料，其在食品、化妆品、生物医学材料、医药、造纸及化工等领域均有良好的应用前景。自该产品面市以来，在国际市场上一直畅销不衰。现有细菌纤维素生产企业的生产能力远无法满足市场对细菌纤维素的大量需求。因此改进细菌纤维素的发酵工艺得到理想的产量已成为当今的研究热点。

细菌纤维素的制备方法目前主要为静态培养与动态培养两种。静态培养周期较长，成本较高，细菌纤维素产量无法满足大规模生产的要求，因此目前大都采用动态培养的方法。动态培养是指在培养过程中，将氧气或空气以气泡形式通入培养容器中并结合机械搅拌的方式，人为的使原本氧气含量十分有限的培养液含有接近空气中的氧气含量，制备细菌纤维素。有研究发现在动态培养条件下会产生菌种细胞变异体，变异体不具有产生纤维素的能力，因此动态培养时间过久会抑制纤维素的产量。

现有的细菌纤维素的生产技术，由于没有将菌体生长繁殖与发酵生产分开，或选用的培养基、培养条件和发酵条件不合适，普遍存在细菌纤维素的生长周期长，产量低等缺点。因此现有一些研究逐渐将菌体增殖和发酵分开进行来缩短细菌纤维素的生长周期和提高产量。由于在菌体扩培过程中，往往会产生大量的纤维素，不仅束缚了菌体阻碍物质的传递，使菌体难以大量增殖，而且影响设备的使用，特别是在发酵罐中，会造成发酵罐难以清洗、发酵罐管道堵塞等问题，菌种难以大量扩培一直是阻碍细菌纤维素大规模工业生产的关键。因此，在菌种扩培时阻碍细菌纤维素聚集形成膜团可大大的提高细菌纤维素的产量。中国专利CN103740784 A通过在发酵过程中添加荧光增白剂培养后，可降低细菌纤维素纤维带的聚集情况，从而降低细菌纤维素的结晶度。但该方法虽然能降低细菌纤维素纤维带的聚集情况，但所添加荧光增白剂均具有一定的毒害性。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术存在的缺陷和不足，本发明提供了一种快速扩增生产细菌纤维素菌种的方法。本方法简单易行，成本低廉、安全可控，可使菌体在发酵罐中大量增殖，从而可有效的缩短生产时间和提高细菌纤维素的产量。

本发明的技术方案一方面公开了羧甲基纤维素钠在快速扩增生产细菌纤维素菌种中的应用。

本发明的技术方案另一方面提供了一种快速扩增生产细菌纤维素菌种的方法，休眠的菌种经过斜面培养和摇瓶培养后，在发酵罐中进一步扩增培养，发酵罐中的种子培养基中含有羧甲基纤维素钠。

在本发明的一些实施方式中，摇瓶培养和发酵罐中的培养基，均为种子培养基，组分一致。

在本发明的一些实施方案中，种子培养基中羧甲基纤维素钠的粘度为200～1200mpa·s。

在本发明的一些实施方案中，种子培养基中羧甲基纤维素钠的粘度为200～800mpa·s。

在本发明的一些实施方案中，种子培养基中羧甲基纤维素钠的质量为培养基总质量的0.1％-2％。

在本发明的一些实施方案中，斜面培养的条件为将生产菌种接种于斜面培养基上，于25℃～32℃静置培养2～3天。

在本发明的一些实施方案中，摇瓶培养是指刮取斜面0.8cm×1.0cm～1.6cm×2.0cm的菌苔于含种子培养基的三角摇瓶中，在25℃～32℃以100～200rpm的振速振荡培养1～2天。

在本发明的一些实施方案中，发酵罐种子培养基中扩培的培养温度为25℃～32℃，搅拌转速为100～200rpm，培养时间为1～3天。

在本发明的一些实施方案中，产细菌纤维素的菌株选自木醋杆菌、醋化醋杆菌、产醋醋杆菌、巴氏醋杆菌、气杆菌属(Aerobacter)、根瘤杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属、假单胞杆菌属、产碱杆菌属、八叠球菌属或动胶菌属。

在本发明的一些实施方式中，斜面培养基的组分为(质量比)：蔗糖2％～4％，硫酸铵0.2％～0.6％，硫酸镁0.01％～0.05％，氯化钙0.01％～0.04％，七水硫酸亚铁0.0003％～0.0010％，乙酸钠0.04％～0.10％，酵母膏0.03％～0.10％，琼脂2％，其余为水。

在本发明的一些实施方式中，种子培养基的组分为(质量比)：蔗糖2％～4％，硫酸铵0.2％～0.6％，硫酸镁0.01％～0.05％，氯化钙0.01％～0.04％，七水硫酸亚铁0.0003％～0.0010％，乙酸钠0.04％～0.10％，酵母膏0.03％～0.10％，琼脂2％和羧甲基纤维素钠0.1％～2％，其余为水。

在本发明的一些实施方式中，所用的器皿均为已灭菌的。

在本发明的一些实施方式中，所用的水均为纯化水。

除非明确地说明与此相反，否则，本发明引用的所有范围包括端值。例如，“种子培养基中羧甲基纤维素钠的粘度为200～1200mpa·s”，表示种子培养基中羧甲基纤维素钠的粘度为200≤μ≤1200mpa·s。

本发明使用的术语“或”表示备选方案，如果合适的话，可以将它们组合，也就是说，术语“或”包括每个所列出的单独备选方案以及它们的组合。例如，“所述菌种选自木醋杆菌、醋化醋杆菌、产醋醋杆菌、巴氏醋杆菌、气杆菌属(Aerobacter)、根瘤杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属、假单胞杆菌属、产碱杆菌属、八叠球菌属或动胶菌属。”表示生产细菌纤维素的菌种选自生产菌株可以是木醋杆菌、醋化醋杆菌、产醋醋杆菌、巴氏醋杆菌、气杆菌属(Aerobacter)、根瘤杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属、假单胞杆菌属、产 碱杆菌属、八叠球菌属或动胶菌属之中的一种，也可以是其一种以上的组合。

本发明中的数字均为近似值，无论有否使用“大约”或“约”等字眼。数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减。

由于不同粘度的羧甲基纤维素钠与细菌纤维素形成过程中羧甲基纤维素的氢键结合能力不同，当羧甲基纤维素钠的粘度在200-1200mpa·s范围内时，羧甲基纤维素与氢键的结合能力随其粘度的增加而降低。当粘度在200-800mpa·s时，由于羧甲基纤维素与细菌纤维素的氢键有较强的结合能力，因此，可以完全阻止细菌纤维素的聚集，从而使菌体能达到大量扩培的目的，其菌体的数量可达到10¹¹～10¹²cfu/ml，而当羧甲基纤维素的粘度在800-1200mpa·s之间时，由于羧甲基纤维素与氢键的结合能力不够强，因而导致其不能完全阻止细菌纤维素的聚集，最终导致具体的扩培数量可达10⁹～10¹⁰cfu/ml。

本发明在种子扩培过程中添加羧甲基纤维素钠，可以阻碍细菌纤维素结晶，即阻止细菌纤维素微纤维形成带纤维。该方法不仅解除了纤维素对菌体的束缚，加快物质传递，使菌体快速增殖，而且在罐中不形成膜团，加大了设备的利用率，减轻大规模生产难度。且羧甲基纤维素钠主要用于食品、医药等领域，安全性高、价格低廉，在细菌纤维素生产中使用具有很大优势。

与现有菌种扩培方法相比，本发明简单易行，成本低廉、安全可控，既可解除纤维素对菌体的束缚，加快物质传递，使菌体快速增殖，又可在罐中不形成膜团，加大设备的利用率，减轻大规模生产难度。

附图说明

图1为对比例1摇瓶中形成膜团情况。

图2为实施例3摇瓶中形成膜团情况。

图3为实施例1摇瓶中菌液的镜检图。

图4为实施例3摇瓶中菌液的镜检图。

具体实施方式

以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。实施例中所用的原料均可以通过商业途径获得。

实施例1

斜面培养基为(质量比)：蔗糖2％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.01％，氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.0003％，乙酸钠0.04％，酵母膏0.03％，琼脂2％，其余为水。

摇瓶中与发酵罐中种子培养基为(质量比)：蔗糖2％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.01％，氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.0003％，乙酸钠0.04％，酵母膏0.03％，粘度为1200mpa·s的羧甲基纤维素钠0.1％，其余 为水。

(1)斜面种子培养：将木醋杆菌菌种接种于斜面培养基上，25℃静置培养3天；

(2)摇瓶种子液培养：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于含100mL种子培养基的500ml三角摇瓶中，25℃200rpm振荡培养2天；

(3)发酵罐种子液扩培：将摇瓶种子液转接于添加了10L种子培养基的发酵罐中，25℃200rpm扩培3天。

采用平板稀释涂布计算活菌量的方法计数得发酵罐中菌浓可达5.20×10⁹cfu/ml，且罐中不产生细菌纤维素膜团。

实施例2

斜面培养基为(质量比)：蔗糖2％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.02％，七水硫酸亚铁0.0003％，乙酸钠0.04％，酵母膏0.03％，琼脂2％，其余为水。

摇瓶中与发酵罐中种子培养基为(质量比)：蔗糖2％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.02％，七水硫酸亚铁0.0003％，乙酸钠0.04％，酵母膏0.03％，粘度为800mpa·s的羧甲基纤维素钠0.5％，其余为水。

(1)斜面种子培养：将木醋杆菌菌种接种于斜面培养基上，28℃静置培养2天；

(2)摇瓶种子液培养：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于含100mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，28℃150rpm振荡培养1.5天；

(3)发酵罐种子液扩培：将摇瓶种子液转接于添加了10L种子培养基的发酵罐中，28℃150rpm扩培2天。

采用平板稀释涂布计算活菌量的方法计数得发酵罐中菌浓可达3.86×10¹²cfu/ml，且罐中不产生细菌纤维素膜团。

实施例3

斜面培养基为(质量比)：蔗糖3％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.02％，七水硫酸亚铁0.0006％，乙酸钠0.08％，酵母膏0.07％，琼脂2％，其余为水。

摇瓶中与发酵罐中种子培养基为(质量比)：蔗糖3％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.02％，七水硫酸亚铁0.0006％，乙酸钠0.08％，酵母膏0.07％，粘度为200mpa·s的羧甲基纤维素钠2.0％，其余为水。

(1)斜面种子培养：将木醋杆菌菌种接种于斜面培养基上，32℃静置培养2天；

(2)摇瓶种子液培养：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于添加了粘度为200mpa·s、浓度为2.0％的羧甲基纤维素钠含100mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，32℃100rpm振荡培养1天；

(3)发酵罐种子液扩培：将摇瓶种子液转接于添加了粘度为200mpa·s的羧甲基纤维素钠2.0％的10L发酵罐种子培养基中，32℃100rpm扩培1天。

采用平板稀释涂布计算活菌量的方法计数得发酵罐中菌浓可达9.33×10¹¹cfu/ml，且罐中不产生细菌纤 维素膜团，见图2。将菌液进行镜检，结果见图4。

实施例4

斜面培养基为(质量比)：蔗糖4％，硫酸铵0.6％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.04％，七水硫酸亚铁0.0006％，乙酸钠0.08％，酵母膏0.07％，琼脂2％，其余为水。

摇瓶中与发酵罐中种子培养基为(质量比)：蔗糖4％，硫酸铵0.6％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.04％，七水硫酸亚铁0.0006％，乙酸钠0.08％，酵母膏0.07％，粘度为1200mpa·s的羧甲基纤维素钠0.05％，粘度为200mpa·s的羧甲基纤维素钠1.0％，其余为水。

(1)斜面种子培养：将木醋杆菌菌种接种于斜面培养基上，30℃静置培养2.5天；

(2)摇瓶种子液培养：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于含100mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，30℃150rpm振荡培养1.5天；

(3)发酵罐种子液扩培：将摇瓶种子液转接于添加了10L种子培养基的发酵罐中，30℃150rpm扩培1.5天。

采用平板稀释涂布计算活菌量的方法计数得发酵罐中菌浓可达5.92×10¹⁰cfu/ml，且罐中不产生细菌纤维素膜团。

实施例5

斜面培养基为(质量比)：蔗糖4％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.03％，七水硫酸亚铁0.0010％，乙酸钠0.10％，酵母膏0.10％，琼脂2％，其余为水。

摇瓶中与发酵罐中种子培养基为(质量比)：蔗糖4％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.03％，七水硫酸亚铁0.0010％，乙酸钠0.10％，酵母膏0.10％，粘度为800mpa·s的羧甲基纤维素钠0.6％，粘度为200mpa·s的羧甲基纤维素钠0.6％，其余为水。

(1)斜面种子培养：将木醋杆菌菌种接种于斜面培养基上，28℃静置培养2天；

(2)摇瓶种子液培养：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于含100mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，28℃150rpm振荡培养1.5天；

(3)发酵罐种子液扩培：将摇瓶种子液转接于添加了10L种子培养基的发酵罐中，28℃150rpm扩培2天。

采用平板稀释涂布计算活菌量的方法计数得发酵罐中菌浓可达9.80×10¹²cfu/ml，且罐中不产生细菌纤维素膜团。

实施例6

斜面培养基为(质量比)：蔗糖4％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.03％，七水硫酸亚铁0.0010％，乙酸钠0.08％，酵母膏0.08％，琼脂2％，其余为水。

摇瓶中与发酵罐中种子培养基为(质量比)：蔗糖4％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.03％， 七水硫酸亚铁0.0010％，乙酸钠0.08％，酵母膏0.08％，粘度为200mpa·s的羧甲基纤维素钠0.8％，粘度为800mpa·s的羧甲基纤维素钠0.2％，粘度为1200mpa·s的羧甲基纤维素钠0.02％，其余为水。

(1)斜面种子培养：将木醋杆菌菌种接种于斜面培养基上，30℃静置培养2.5天；

(2)摇瓶种子液培养：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于含100mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，30℃150rpm振荡培养1.5天；

(3)发酵罐种子液扩培：将摇瓶种子液转接于添加了10L种子培养基的发酵罐中，30℃150rpm扩培1.5天。

采用平板稀释涂布计算活菌量的方法计数得发酵罐中菌浓可达8.83×10¹¹cfu/ml，且罐中不产生细菌纤维素膜团。

对比例1

斜面培养基为(质量比)：蔗糖2％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.01％，氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.0003％，乙酸钠0.04％，酵母膏0.03％，琼脂2％，其余为水。

摇瓶中与发酵罐中种子培养基A为(质量比)：蔗糖2％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.01％，氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.0003％，乙酸钠0.04％，酵母膏0.03％，其余为水。

(1)斜面种子培养：将木醋杆菌菌种接种于斜面培养基上，25℃静置培养3天；

(2)摇瓶种子液培养：刮取1.6cm×2.0cm的斜面菌苔于100mL种子培养基A的500mL三角摇瓶中，25℃200rpm振荡培养2天；

(3)发酵罐种子液扩培：将摇瓶种子液转接于10L种子培养基A的发酵罐中，25℃200rpm扩培3天。

采用平板稀释涂布计算活菌量的方法计数得发酵罐中菌浓为2.00×10⁶cfu/ml，罐中产生大量膜团，见图1。将菌液进行镜检，结果见图3。