核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物、引物设计方法及miRNA检测方法与流程

技术特征：

1.一种具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，用于设计miRNA qPCR检测所用的正向引物。

2.一种具有SEQ ID NO:2的通用反向引物，用于在miRNA qPCR检测中进行cDNA分子扩增。

3.根据权利要求2所述的具有SEQ ID NO:2的通用反向引物，其中所述通用反向引物的Tm值为59.1℃。

4.一种通用反转录引物，用于对待测miRNA进行cDNA合成，所述通用反转录引物为以下方通式表示的核苷酸序列：

R-(dT)nVN

其中R为5’端的核苷酸序列且为SEQ ID NO:2，(dT)n为中间部分n个连续的胸腺嘧啶残基(thymine residue)，n为19，VN为3’端由核苷酸残基组成的序列，V为腺嘌呤残基(adenine residue)、鸟粪嘌呤残基(guanine residue)或胞嘧啶残基(cytosine residue)，N为腺嘌呤残基、鸟粪嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。

5.一种引物设计方法，所述引物用于miRNA qPCR检测，包括：

确认待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的序列相似度，

当序列相似度低于90％时，以第一设计方法设计正向引物，所述第一设计方法包括：

第一调整步骤，使正向引物与具有SEQ ID NO:2的通用反向引物之间的Tm值差异不超过2度，当正向引物的Tm值低于57℃时，在5’端依序地增加具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，以使正向引物的Tm值达到57℃至61℃；以及

第一确认步骤，确认正向引物的二聚体的△G大于-7.5千卡/摩尔，

其中当二聚体的△G小于-7.5千卡/摩尔时，删减二聚体区域的正向引物序列，以避开形成二聚体的区域，并重新进行所述第一调整步骤及所述第一确认步骤，

当序列相似度高于90％时，以第二设计方法设计正向引物及反向引物，所述第二设计方法包括：

重叠设计步骤，比对待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的核苷酸差异位置，并使正向引物及反向引物的3’端的最后一个核苷酸残基设计至所述核苷酸相异位置上，若仍无法区分待测miRNA与同物种中的其他miRNA，将正向引物或反向引物再往前增加一个重叠的碱基，或将正向引物和反向引物同时再增加一个重叠的碱基；

第二调整步骤，使正向引物与反向引物之间的Tm值差异不超过2度，当正向引物的Tm值低于55℃时，在5’端依序地增加具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，当反向引物的Tm值低于55℃时，在5’端依序地增加具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，以使正向引物与反向引物的Tm值达到55℃至61℃；以及

第二确认步骤，确认正向引物及反向引物的二聚体的△G大于-7.5千卡/摩尔，

其中当二聚体的△G小于-7.5千卡/摩尔时，更换增加于正向引物5’端的具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，以避开形成二聚体的区域，并重新进行所述第二调整步骤及所述第二确认步骤，

当所述第二设计方法无法避开形成二聚体的区域时，若二聚体问题是由反向引物造成，进行第三设计方法，若二聚体问题是由正向引物造成，进行第四设计方法，

所述第三设计方法包括：

延长正向引物的3’端长度并缩短反向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，

其中所述核苷酸差异位置设计在正向引物或反向引物的3’端的最后四个核苷酸内，且在缩短反向引物的3’端长度后，若Tm值不足，则在反向引物的5’端依序地增加具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，

所述第四设计方法包括：

延长反向引物的3’端长度并缩短正向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，

其中所述核苷酸差异位置在正向引物或反向引物的3’端的最后四个核苷酸内，且在缩短正向引物的3’端长度后，若Tm值不足，则在正向引物的5’端依序地增加具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的引物设计方法，其中以所述第一设计方法设计出的正向引物与具有SEQ ID NO:2的通用反向引物在qPCR定量检测中进行cDNA分子扩增。

7.根据权利要求5所述的引物设计方法，其中在所述第一设计方法中，正向引物的二聚体包括正向引物的自身二聚体或正向引物与具有SEQ ID NO:2的通用反向引物之间形成的异二聚体。

8.根据权利要求5所述的引物设计方法，其中在所述第二设计方法中，正向引物及反向引物的二聚体包括正向引物及反向引物各自的自身二聚体或正向引物与反向引物之间形成的异二聚体。

9.根据权利要求5所述的引物设计方法，其中在所述第一设计方法中，无法避开形成二聚体的区域时，以下述方式设计正向引物及反向引物，以避开形成二聚体的区域，其中反向引物不为具有SEQ ID NO:2的通用反向引物：

延伸正向引物方式，延长正向引物的3’端长度并缩短反向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中正向引物的长度为12至18碱基，或

延伸反向引物方式，延长反向引物的3’端长度并缩短正向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中反向引物的长度为12至18碱基。

10.一种miRNA检测方法，包括：

对样品中的待测miRNA添加poly-A尾；

利用通用反转录引物对所述待测miRNA进行cDNA合成；以及

利用根据权利要求5至9中任一项所述的引物设计方法设计的正向引物及反向引物进行cDNA分子扩增，

其中所述通用反转录引物为以下方通式表示的核苷酸序列：

R-(dT)nVN

其中R为5’端的核苷酸序列且为SEQ ID NO:2，(dT)n为中间部分n个连续的胸腺嘧啶残基，n为19，VN为3’端由核苷酸残基组成的序列，V为腺嘌呤残基、鸟粪嘌呤残基或胞嘧啶残基，N为腺嘌呤残基、鸟粪嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。