本发明是有关于一种核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物、引物设计方法及miRNA检测方法，且特别是有关于一种应用于miRNA检测、定量和表达谱分析的核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物、引物设计方法及miRNA检测方法。
背景技术：
：miRNA为高度保守的非编码RNA，长度约为18-25个核苷酸，其能够调控生物体的基因表现。近年来，研究结果显示miRNA与许多疾病相关，特别是癌症，miRNA具有致癌基因或抑癌基因的作用，在人类癌症的病理生理学中扮演重要角色。更详细而言，miRNA在癌症病例中的表现情形，可作为癌症诊断和预后判断的工具，甚至能够进一步预测病患的存活率，已成为新一代的癌症生物标记(Biomarker)。此外，也基于健康个体与癌症病患之间的miRNA表现差异，发展出各种癌症诊断工具。因此，用于miRNA检测、定量和表达谱分析(expressionprofiling)的材料和方法是重要且关键的。在现有技术中，检测与定量miRNA的方法包括北方墨点杂交法(Northernblothybridization)、转殖技术(cloning)、微阵列基因芯片分析及次世代定序技术。相较于现有技术，即时定量反转录聚合酶链锁反应(qRT-PCR，quantitativereal-timereversetranscriptionPCR)方法具有较高的敏感度及特异性。目前已发展出各种不同的qRT-PCR方法，这些方法主要可分成以下两种。第一种方法是使用茎环反转录引物(stem-loopRTprimer)进行cDNA合成，并使用miRNA特异性探针(miRNAspecificprobe)或通用探针(universalprobe)对miRNA进行定量。第二种方法则是使用线性的通用反转录引物(universalRTprimer)进行cDNA合成，并使用miRNA特异性正向引物(miRNAspecificforwardprimer)、反转录引物特异性反向引物(RT-primerspecificreverseprimer)以及双股DNA结合染料(double-strandedDNAintercalatingdye)进行miRNA的定量。针对上述qRT-PCR方法，第一种方法的反转录引物因含有一个茎环结构，具有较佳的特异性，但所使用的miRNA特异性探针或通用探针的成本较高。第二种方法不需使用探针，因此，可进一步降低成本。然而，第二种方法所使用的线性通用反转录引物的特异性较第一类的茎环反转录引物差，且目前市售的通用反转录引物可能需要进一步修饰。基于上述，如何提升线性通用反转录引物及反向引物的特异性及敏感度，同时兼具降低成本及方便使用的特性，以检测、定量和分析miRNA的表现量，为目前所需改良的重要课题。技术实现要素：本发明提供一种核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物及引物设计方法，适用于miRNA检测、定量和表达谱分析的qRT-PCR方法，其中通用反向引物、通用反转录引物以及由引物设计方法所设计出的引物具有较佳的特异性及敏感度，同时兼具降低成本及方便使用的特性，且不需对引物进行额外的核酸修饰(oligonucleotidemodification)。本发明提供一种具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，用于设计miRNAqPCR检测所用的正向引物，与反向引物搭配以进行cDNA分子扩增。本发明提供一种具有SEQIDNO:2的通用反向引物，用于miRNAqPCR检测中与正向引物搭配进行cDNA分子扩增。在本发明的一实施例中，通用反向引物的Tm值为59.1℃。本发明提供一种通用反转录引物，用于对待测miRNA样品进行cDNA合成，通用反转录引物为以下方通式表示的核苷酸序列：R-(dT)nVN其中R为5’端的核苷酸序列且为SEQIDNO:2，(dT)n为中间部分n个连续的胸腺嘧啶残基(thymineresidue)，n为19，VN为3’端由核苷酸残基组成的序列，V为腺嘌呤残基(adenineresidue)、鸟粪嘌呤残基(guanineresidue)或胞嘧啶残基(cytosineresidue)，N为腺嘌呤残基、鸟粪嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。本发明提供一种引物设计方法，所述引物用于miRNAqPCR检测，包括以下步骤。确认待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的序列相似度。当待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的序列相似度低于90％时，以第一设计方法设计正向引物，第一设计方法包括第一调整步骤以及第一确认步骤。在第一调整步骤中，使正向引物与具有SEQIDNO:2的通用反向引物之间的Tm值差异不超过2度，当正向引物的Tm值低于57℃时，在5’端依序地增加具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，以使正向引物的Tm值达到57℃至61℃。在第一确认步骤中，确认正向引物的二聚体(dimer)的△G大于-7.5千卡/摩尔。当二聚体的△G小于-7.5千卡/摩尔时，删减二聚体区域的正向引物序列，以避开形成二聚体的区域，并重新进行第一调整步骤及第一确认步骤。当待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的序列相似度高于90％时，以第二设计方法设计正向引物及反向引物，第二设计方法包括重叠设计步骤、第二调整步骤以及第二确认步骤。在重叠设计步骤中，比对待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的核苷酸差异位置，并使正向引物及反向引物的3’端的最后一个核苷酸残基设计至所述核苷酸相异位置上，若仍无法区分待测miRNA与同物种中的其他miRNA，将正向引物或反向引物再往前增加一个重叠的碱基，或将正向引物和反向引物同时再增加一个重叠碱基。在第二调整步骤中，使正向引物与反向引物之间的Tm值差异不超过2度，且当正向引物的Tm值低于55℃时，在5’端依序地增加具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，当反向引物的Tm值低于55℃时，在5’端依序地增加具有SEQIDNO:2的核苷酸序列，以使正向引物与反向引物的Tm值达到55℃至61℃。在第二确认步骤中，确认正向引物及反向引物的二聚体的△G大于-7.5千卡/摩尔。当二聚体的△G小于-7.5千卡/摩尔时，更换增加于正向引物5’端的具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，其中具有SEQIDNO:1的核苷酸序列具有不同的核苷酸残基组合，以避开形成二聚体的区域，并重新进行第二调整步骤及第二确认步骤。当第二设计方法无法避开形成二聚体的区域时，若二聚体问题是由反向引物造成，进行第三设计方法，若二聚体问题是由正向引物造成，进行第四设计方法。第三设计方法包括延长正向引物的3’端长度并缩短反向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中核苷酸差异位置设计在正向引物或反向引物的3’端的最后四个核苷酸内，且在缩短反向引物的3’端长度后若Tm值不足，则在反向引物的5’端依序地增加具有SEQIDNO:2的核苷酸序列。第四设计方法包括延长反向引物的3’端长度并缩短正向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中核苷酸差异位置设计在正向引物或反向引物的3’端的最后四个核苷酸内，在缩短正向引物的3’端长度后若Tm值不足，则在正向引物的5’端依序地增加具有SEQIDNO:1的核苷酸序列。在本发明的一实施例中，以第一设计方法设计出的正向引物与具有SEQIDNO:2的通用反向引物在qPCR检测中进行cDNA分子扩增。在本发明的一实施例中，在第一设计方法中，正向引物的二聚体包括正向引物的自身二聚体(self-dimer)或正向引物与具有SEQIDNO:2的通用反向引物之间形成的异二聚体(hetero-dimer)。在本发明的一实施例中，在第二设计方法中，正向引物及反向引物的二聚体包括正向引物及反向引物各自的自身二聚体或正向引物与反向引物之间形成的异二聚体。在本发明的一实施例中，在第一设计方法中，无法避开形成二聚体的区域时，以下述方式设计正向引物及反向引物，以避开形成二聚体的区域，其中反向引物不为具有SEQIDNO:2的通用反向引物。延伸正向引物方式，延长正向引物的3’端长度并缩短反向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中正向引物的长度为12-18碱基，或延伸反向引物方式，延长反向引物的3’端长度并缩短正向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中反向引物的长度为12-18碱基。本发明提供一种miRNA检测方法，包括以下步骤。首先，对样品中的待测miRNA添加poly-A尾。之后，利用通用反转录引物对待测miRNA进行cDNA合成。接着，利用本发明引物设计方法设计的正向引物及反向引物进行cDNA分子扩增。其中，通用反转录引物为以下方通式表示的核苷酸序列：R-(dT)nVN，其中R为5’端的核苷酸序列且为SEQIDNO:2，(dT)n为中间部分n个连续的胸腺嘧啶残基，n为19，VN为3’端由核苷酸残基组成的序列，V为腺嘌呤残基、鸟粪嘌呤残基或胞嘧啶残基，N为腺嘌呤残基、鸟粪嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。在本发明的一实施例中，反向引物为具有SEQIDNO:2的通用反向引物。基于上述，本发明提供一种核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物、引物设计方法及miRNA检测方法，于miRNA检测方法中，通用反转录引物用于对miRNA样品进行cDNA合成，通用反向引物用于qPCR定量检测时扩增所述cDNA分子，而引物设计方法则是使用通用反向引物序列、核苷酸序列及设计规则，以设计qPCR定量检测所用的引物。本发明的通用反转录引物、通用反向引物以及由引物设计方法所设计出的引物具有较佳的特异性及敏感度，同时兼具降低成本及方便使用的特性，且不需对引物进行额外修饰。为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明如下。附图说明图1为本发明的miRNA检测方法的流程示意图。具体实施方式本发明提供一种核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物及引物设计方法，适用于miRNA检测、定量和表达谱分析的qRT-PCR方法。下文中，先针对说明书内文所使用的名词加以定义说明。“△G”为吉布斯自由能(GibbsFreeEnergy)，其为一种描述化学反应的热力学函数。二聚体结构的稳定性可由△G表示，其意义为用来打断二聚体所需的能量。较大的△G负值(本发明定为△G<-7.5千卡/摩尔)代表出现稳定、非所需的二聚体结构，对PCR反应造成不良影响。“qPCR”或”real-timequantitativePCR”(即时定量聚合酶链锁反应)是指使用PCR以扩增并同时定量目标DNA的实验方法。利用多种测定化学物质来进行定量(包括诸如green的荧光染料或Taqman探针的荧光报告寡核苷酸探针等)，随着每次扩增循环之后反应中积累的扩增DNA来对其进行即时定量。“qRT-PCR”(即时定量反转录聚合酶链锁反应)是指以待测样品逆转录反应中所产生的cDNA，作为PCR扩增过程的起始DNA模板的定量逆转录聚合酶链式反应，随后进行qPCR对待测miRNA进行定量。“Tm”(解链温度)，通常将Tm定义为核苷酸和互补核苷酸链之间形成的双股螺旋有50％解离为单链时的温度。核苷酸的长度和核苷酸组成，例如核苷酸序列中G和C核苷酸的含量是影响Tm的重要因素。由于Tm的测量方法为本发明所述
技术领域：
的现有技术，故在此不予赘述。“cDNA”(complementaryDNA，互补DNA)是指利用逆转录酶对RNA模板进行逆转录所产生的互补DNA。“核苷酸”包括腺嘌呤(A)、鸟粪嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)。“microRNA”为miRNA的同义简写。“Ct值”为qPCR操作流程中，开始显著地增加荧光强度时的扩增循环数目。本发明提供一种引物设计方法，所设计出的引物可适用于检测miRNA的qPCR方法。在本发明的引物设计方法中，先确认待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的序列相似度，将待测miRNA与同物种中的其他miRNA的序列进行比较，评估差异的核苷酸序列碱基数所占的比例，再依据序列相似度判断进行第一设计方法或第二设计方法。更详细而言，同物种中的其他miRNA的相关信息可从本领域相关科技文献或诸如miRBase数据库(http://microRNA.sanger.ac.uk/)的公开数据库取得。当序列相似度低于90％时，以第一设计方法设计正向引物；当序列相似度高于90％时，以第二设计方法设计正向引物及反向引物。正向引物的序列设计通常包含与待测miRNA序列5’端相同的12至18个核苷酸残基。反向引物的序列设计通常包含与待测miRNA序列3’端互补的2至8个核苷酸残基，接着包含19个胸腺嘧啶残基以及长度不一的尾端(SEQIDNO:2序列)，其中19个胸腺嘧啶残基及尾端与通用反转录引物的一部分相同。之后，再依据本发明所提出的引物设计方法，依其设计规则由第一设计方法至第四设计方法中选择其中一种方法对引物进行设计。<第一设计方法>第一设计方法包括第一调整步骤以及第一确认步骤。首先，进行第一调整步骤，使正向引物与具有序列5’-CAACTCAGGTCGTAGGCAATTCGT-3’(SEQIDNO:2)的通用反向引物之间的Tm值差异不超过2度，其中通用反向引物的Tm值为59.1℃。更详细而言，当正向引物的Tm值低于57℃时，在5’端依序地增加具有序列CGWTSSRCRC(SEQIDNO:1)的核苷酸序列，以使正向引物的Tm值达到57℃至61℃。当正向引物本身序列的Tm值即为57℃至61℃时，则不需在5’端依序地增加所述核苷酸序列。必须说明的是，在具有序列CGWTSSRCRC(SEQIDNO:1)的核苷酸序列中，W为腺嘌呤残基或胸腺嘧啶残基(A或T)，S为鸟粪嘌呤残基或胞嘧啶残基(G或C)，R为腺嘌呤残基或鸟粪嘌呤残基(A或G)。于正向引物5’端依序地增加具有SEQIDNO:1的核苷酸序列能够较容易地使正向引物的Tm值达到所需的范围，且具有高度特异性，更能够进一步防止自身二聚体(self-dimer)及异二聚体(hetero-dimer)形成。接着，进行第一确认步骤，确认正向引物是否形成自身二聚体或正向引物与通用反向引物之间是否形成异二聚体。若自身二聚体与异二聚体的△G大于-7.5千卡/摩尔，则完成正向引物的设计。当自身二聚体与异二聚体中至少一者的△G小于-7.5千卡/摩尔时，删减二聚体区域的正向引物序列，以避开形成二聚体的区域，并重新进行第一调整步骤及第一确认步骤。若使用第一设计方法无法避开形成二聚体的区域，则可以以下述方式设计正向引物及反向引物，以避开形成二聚体的区域，其中反向引物不为具有SEQIDNO:2的通用反向引物。延伸正向引物方式，延长正向引物的3’端长度并缩短反向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中正向引物的序列长度约为12至18碱基。或者，延伸反向引物方式，延长反向引物的3’端长度并缩短正向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中反向引物的长度约为12至18碱基。使用第一设计方法设计出正向引物后，在miRNA检测方法中，使用通用反转录引物对待测miRNA进行cDNA合成，再以第一设计方法设计出的正向引物与具有SEQIDNO:2的通用反向引物在qPCR定量检测中进行cDNA分子扩增。更详细而言，通用反转录引物为以下方通式表示的核苷酸序列：R-(dT)nVN其中R为5’端的核苷酸序列且为SEQIDNO:2，(dT)n为中间部分n个连续的胸腺嘧啶残基，n为19，VN为3’端由核苷酸残基组成的序列，V为腺嘌呤残基、鸟粪嘌呤残基或胞嘧啶残基，N为腺嘌呤残基、鸟粪嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。<第二设计方法>第二设计方法包括重叠设计步骤、第二调整步骤以及第二确认步骤。首先，进行重叠设计步骤，比对出待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的核苷酸差异位置，并使正向引物及反向引物的3’端的最后一个核苷酸残基设计至所述核苷酸相异位置上的核苷酸残基。更详细而言，若重叠一个核苷酸残基仍无法区分待测miRNA与同物种中的其他miRNA，则可将正向引物或反向引物再向前增加一个重叠的碱基，或将正向引物与反向引物同时再增加一个重叠的碱基。接着，进行第二调整步骤，使正向引物与反向引物之间的Tm值差异不超过2度。更详细而言，当正向引物的Tm值低于55℃时，在正向引物5’端依序地增加具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，当反向引物的Tm值低于55℃时，在5’端依序地增加具有SEQIDNO:2的核苷酸序列，以使正向引物与反向引物的Tm值达到55℃至61℃。当正向引物与反向引物本身序列的Tm值即为55℃至61℃时，则不需在5’端依序地增加核苷酸序列。之后，进行第二确认步骤，确认正向引物及反向引物是否形成自身二聚体或正向引物与反向引物之间是否形成异二聚体。若自身二聚体与异二聚体的△G大于-7.5千卡/摩尔，则完成正向引物与反向引物的设计。若自身二聚体与异二聚体中至少一者的△G小于-7.5千卡/摩尔时，更换增加于正向引物的5’端的具有SEQIDNO:1的核苷酸序列(其中具有不同的核苷酸残基组合)，并重新进行第二调整步骤及第二确认步骤。使用第二设计方法设计出正向引物与反向引物后，在miRNA检测方法中，使用通用反转录引物对待测miRNA进行cDNA合成，再以第二设计方法设计出的正向引物与反向引物在qPCR定量检测中进行cDNA分子扩增。所使用的通用反转录引物与上文中所述的通用反转录引物相同，故在此不予赘述。当第二设计方法无法避开形成二聚体的区域，进行第三设计方法或第四设计方法。若二聚体问题是由反向引物造成，进行第三设计方法，若二聚体问题是由正向引物造成，进行第四设计方法。<第三设计方法>第三设计方法包括延长正向引物的3’端长度并缩短反向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中待测miRNA与同物种中的其他miRNA的核苷酸差异位置需设计在正向引物或反向引物的3’端的最后四个核苷酸内。当缩短反向引物的3’端长度后，若Tm值不足，则在5’端依序地增加具有SEQIDNO:2的核苷酸序列。如此一来，能够增加成功区分高度相似miRNA序列的机率。此外，在第三设计方法中，若无法避免二聚体问题时，亦可使用具有SEQIDNO:2的通用反向引物取代反向引物。<第四设计方法>第四设计方法包括延长反向引物的3’端长度并缩短正向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中待测miRNA与同物种中的其他miRNA的核苷酸差异位置需设计在正向引物或反向引物的3’端的最后四个核苷酸内。当缩短正向引物的3’端长度后，若Tm值不足，则在5’端依序地增加具有SEQIDNO:1的核苷酸序列。如此一来，能够增加成功区分高度相似miRNA序列的机率。本发明亦提出一种miRNA检测方法，图1为本发明的miRNA检测方法的流程示意图，将参照图1详细说明如下。请参照图1，在本发明的miRNA检测方法中，先利用poly(A)聚合酶对样品中的待测miRNA添加poly-A尾，其中poly(A)聚合酶将腺嘌呤残基添加到待测miRNA的3’端。之后，通过与通用反转录引物的杂交，使通用反转录引物与带poly-A尾的待测miRNA黏合。所使用的通用反转录引物与上文中所述的通用反转录引物相同，故在此不予赘述。接着，利用通用反转录引物对待测miRNA进行cDNA合成。最后，进行qPCR反应，利用本发明引物设计方法设计的正向引物及反向引物进行cDNA分子扩增，进行miRNA及时定量检测。更详细而言，若使用上文所述的第一设计方法设计引物，则用来进行cDNA分子扩增的正向引物及反向引物分别为由第一设计方法设计出的正向引物与具有SEQIDNO:2的通用反向引物。若使用上文所述的第二设计方法设计引物，则用来进行cDNA分子扩增的正向引物及反向引物分别为以第二设计方法设计出的正向引物与反向引物。以下，通过实验例来详细说明上述各设计方法。然而，下述实验例并非用以限制本发明。实验例为了证明本发明所提出的引物设计方法能够改善引物的专一性及特异性，以下特别作此实验例。第一设计方法以合成寡核苷酸hsa-miR-589-5p作为模板，并以第一设计方法所设计出的正向引物hsa-miR-589-5p-F与具有SEQIDNO:2的通用反向引物作为专一性引物对，进行miRNA检测方法。cDNA合成的实验步骤如下。首先，混合xμl(2ng)miRNA、0.5μl200μM通用反转录引物、1μl1mMATP(NewEnglandBioladsInc.，新英伦生物技术股份有限公司)、1μl10mMdNTP(NewEnglandBioladsInc.)、2μl10xM-MuLV反转录酶反应缓冲液、1μl(200U/μl)M-MuLV反转录酶(NewEnglandBioladsInc.)及1μl(5U/μl)E.coliPoly(A)聚合酶(NewEnglandBioladsInc.)，再加水至20μl以形成cDNA混合液。接着，将cDNA混合液于37℃下孵育1小时，再将M-MuLV反转录酶于80℃去活性5分钟。所获得的cDNA产物在使用前可先储存于-20℃。利用PanelStation(由奎克生技光电股份有限公司所制造)进行qPCR，其中反应条件如下。混合2μl的RT反应物及30μl2xqPCRMasterMix(Promega)，再加水至60μl以形成混合液。将混合液于95℃反应3分钟，随后以95℃下36秒及60℃下72秒进行39个循环。由实验结果可得知，正向引物hsa-miR-589-5p-F与具有SEQIDNO:2的通用反向引物可成功扩增出专一性产物，Ct值为26.5。hsa-miR-589-5p：5’-TGAGAACCACGTCTGCTCTGAG-3’(SEQIDNO:3)hsa-miR-589-5p-F：GCTGAGAACCACGTCTGCTC(SEQIDNO:4)其中正向引物hsa-miR-589-5p-F底线标示处为在第一调整步骤中所依序增加的具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，正向引物的性质测定数据：Tm＝58.2℃；自身二聚体的ΔG＝-6.3千卡/摩尔；异二聚体的ΔG＝-6.73千卡/摩尔。第二设计方法以序列相似度极高的合成寡核苷酸hsa-miR-18a-5p及hsa-miR-18b-5p作为模板，并以第二设计方法所设计出的正向引物hsa-miR-18a-5p-F与反向引物hsa-miR-18a-5p-R作为专一性引物对，进行miRNA检测方法，其中cDNA合成与qPCR的实验方法如上文第一设计方法的实验例中所述，故在此不予赘述。hsa-miR-18a-5p：5’-TAAGGTGCATCTAGTGCAGATAG-3’(SEQIDNO:5)hsa-miR-18b-5p：5’-TAAGGTGCATCTAGTGCAGTTAG-3’(SEQIDNO:6)其中合成寡核苷酸hsa-miR-18a-5p及hsa-miR-18b-5p底线标示处为核苷酸差异位置。hsa-miR-18a-5p-F：5’-GCTAAGGTGCATCTAGTGCAGA-3’(SEQIDNO:7)hsa-miR-18a-5p-R：5’-TCGTAGGCAATTCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAT-3’(SEQIDNO:8)其中正向引物hsa-miR-18a-5p-F底线标示处为在第二调整步骤中所依序增加的具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，反向引物hsa-miR-18a-5p-R底线标示处为在第二调整步骤中所依序增加的具有SEQIDNO:2的核苷酸序列，正向引物与反向引物的性质测定数据：正向引物Tm＝56.7℃；反向引物Tm＝55.9℃；正向引物与反向引物的自身二聚体的ΔG>-7.5千卡/摩尔；异二聚体的ΔG>-7.5千卡/摩尔。由表1的实验结果可得知，正向引物hsa-miR-18a-5p-F与反向引物hsa-miR-18a-5p-R可成功地区分合成寡核苷酸hsa-miR-18a-5p及hsa-miR-18b-5p。[表1]模板Ct平均值合成寡核苷酸hsa-miR-18a-5p24.8合成寡核苷酸hsa-miR-18b-5p30.8利用第二设计方法设计的正向引物hsa-miR-18a-5p-F与反向引物hsa-miR-18a-5p-R分别对合成寡核苷酸hsa-miR-18a-5p与合成寡核苷酸hsa-miR-18b-5p进行qPCR反应，每一个qPCR反应皆有2,500个技术性重复(technicalrepeat)。将qPCR结果中的荧光强度与Ct值以逻辑斯回归模型(logisticregressionmodel)计算正向引物hsa-miR-18a-5p-F与反向引物hsa-miR-18a-5p-R的专一性，可以得到95.5％的准确度，表示可以成功区分合成寡核苷酸hsa-miR-18a-5p与合成寡核苷酸hsa-miR-18b-5p。第三设计方法以序列相似度极高的合成寡核苷酸hsa-miR-19a-3p及hsa-miR-19b-3p作为模板，并分别以由第二设计方法所设计出的正向引物hsa-miR-19a-3p-V1F与反向引物hsa-miR-19a-3p-V1R以及第三设计方法所设计出的正向引物hsa-miR-19a-3p-V2F与具有SEQIDNO:2的通用反向引物作为专一性引物对，进行miRNA检测方法，其中cDNA合成与qPCR的实验方法如上文第一设计方法的实验例中所述，故在此不予赘述。hsa-miR-19a-3p：5’-TGTGCAAATCTATGCAAAACTGA-3’(SEQIDNO:9)hsa-miR-19b-3p：5’-TGTGCAAATCCATGCAAAACTGA-3’(SEQIDNO:10)其中合成寡核苷酸hsa-miR-19a-3p及hsa-miR-19b-3p底线标示处为核苷酸差异位置。hsa-miR-19a-3p-V1F：5’-GTTGCACGCTGTGCAAATCT-3’(SEQIDNO:11)hsa-miR-19a-3p-V1R：5′-GCAATTCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGTTTTGCATA-3′(SEQIDNO:12)其中正向引物hsa-miR-19a-3p-F底线标示处为在第二调整步骤中所依序增加的具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，反向引物hsa-miR-19a-3p-R底线标示处为在第二调整步骤中所依序增加的具有SEQIDNO:2的核苷酸序列。正向引物与反向引物的性质测定数据：正向引物Tm＝56.9℃；反向引物Tm＝58℃；正向引物的自身二聚体的ΔG＝-10.33千卡/摩尔；反向引物的自身二聚体的ΔG＝-7.5千卡/摩尔；异二聚体的ΔG＝-10.94千卡/摩尔。hsa-miR-19a-3p-V2F：5’-CGTTCGACGCTGTGCAAATCTAT-3’(SEQIDNO:13)其中正向引物hsa-miR-19a-3p-V2F右侧底线标示处为增加3’端正向引物长度，使差异处维持在3’端最后4个核苷酸序列内，左侧底线标示处为在第二调整步骤中所依序增加的具有SEQIDNO:1的核苷酸序列。在第三设计方法中，因为无法避免二聚体问题，所以改用具有SEQIDNO:2的通用反向引物取代反向引物。正向引物与通用反向引物的性质测定数据：正向引物Tm＝57.8℃；通用反向引物Tm＝59.1℃；正向引物的自身二聚体的ΔG＝-7.05千卡/摩尔；通用反向引物的自身二聚体的ΔG＝-5.36千卡/摩尔；异二聚体的ΔG＝-6.53千卡/摩尔。由表2的实验结果可得知，由于以第二设计方法所设计出的正向引物hsa-miR-19a-3p-V1F与反向引物hsa-miR-19a-3p-V1R出现严重的二聚体问题(二聚体的△G小于-7.5千卡/摩尔)，导致无法进行qPCR反应。相较之下，第三设计方法所设计出的正向引物hsa-miR-19a-3p-V2F与具有SEQIDNO:2的通用反向引物可成功区分合成寡核苷酸hsa-miR-19a-3p及hsa-miR-19b-3p。[表2]利用第三设计方法设计的正向引物hsa-miR-19a-3p-V2F与具有SEQIDNO:2的通用反向引物分别对合成寡核苷酸hsa-miR-19a-3p与合成寡核苷酸hsa-miR-19b-3p进行qPCR反应，每一个qPCR反应皆有2,500个技术性重复(technicalrepeat)。将qPCR结果中的荧光强度与Ct值以逻辑斯回归模型(logisticregressionmodel)计算正向引物hsa-miR-19a-3p-V2F与具有SEQIDNO:2的通用反向引物的专一性，可以得到99.1％的准确度，表示可以成功区分合成寡核苷酸hsa-miR-19a-3p与合成寡核苷酸hsa-miR-19b-3p。综上所述，本发明提供一种核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物及引物设计方法，其中具有SEQIDNO:1的核苷酸序列能够较容易地使正向引物的Tm值达到所需的范围，且具有高度特异性，多种组合的SEQIDNO:1的核苷酸序列更能够进一步防止二聚体形成。其中的通用反转录引物具稳定性与专一性，且适用所有miRNA的分析，以单一通用反转录引物进行cDNA合成反应具有节省实验样品与时间、减少技术差异的优点。此外，本发明的引物设计方法针对miRNAfamily(序列相似度>90％)与non-family适用不同的引物设计方法(序列相似度<90％)，且防止二聚体形成的设计方式，使得所设计出的引物具有较佳的特异性及敏感度，能够成功扩增出专一性产物，并可成功区分序列相似度极高miRNA序列。此外，更兼具降低成本及方便使用的特性，且不需对引物进行额外修饰。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页1 2 3