西洋参中人参皂苷的快速检测方法与流程

本发明涉及一种西洋参中人参皂苷的快速检测方法。

背景技术：

西洋参主根呈圆形或纺锤形，表面浅黄色或黄白色，色泽油光，皮纹细腻，质地饱满而结实，断切面干净，呈现较清晰的菊花纹理，参片甘苦味浓，透喉，全体无毛。根肉质，纺锤形，有时呈分歧状。根茎短。茎圆柱形，长约25cm，有纵条纹，或略具棱。掌状5出复叶，通常3～4枚，轮生于茎端；叶柄长5～7cm；小叶片膜质，广卵形至倒卵形，长4～9cm，宽2.5～5cm，先端突尖，边缘具粗锯齿，基部楔形，最下两小叶最小；小叶柄长约1.5cm，最下二小叶柄较短或近于无柄。总花梗由茎端叶柄中央抽出，较叶柄稍长或近于等长；伞形花序，花多数，花梗细短，基部有卵形小苞片1枚；萼绿色，钟状，先端5齿裂，裂片钝头，萼筒基部有三角形小苞片1枚；花瓣5，绿白色，矩圆形；雄蕊5，花丝基部稍宽，花药卵形至矩圆形；雌蕊1，子房下位，2室，花柱2，上部分离呈叉状，下部合生；花盘肉质环状。西洋参中的皂甙可以有效增强中枢神经，达到静心凝神、消除疲劳、增强记忆力等作用，可适用于失眠、烦躁、记忆力衰退及老年痴呆等症状。

总之，西洋参中的人参皂苷具有很好的疗效，但是目前市场上品质参差不齐，通过外观形状等进行鉴别难度较大，而且较多山区的西洋参产量较多，导致一些品质差的或者仿造的西洋参以次充好的情况，所以说开发一种西洋参中人参皂苷的快速检测方法具有重要的意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的、方便、快速、准确地检测西洋参中人参皂苷的检测方法。

本发明提供了SEQ ID N0.1所示的种核苷酸序列。

本发明还提供了检测SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的试剂在制备人参皂苷检测试剂中的用途。

所述检测SEQ ID N0.1所述核甘酸序列的试剂包括扩增SEQ ID N0.1所示核普酸序列的试剂。

所述西洋参是干燥的西洋参根部和秦岭山区所产的西洋参。

所述扩增的试剂包括SEQ ID N0.2-3所示的引物对。

本发明一种西洋参的检测方法，包括如下步骤:

a)DNA提取：提取待检样本中的DNA；

b)检测：用前述的试剂检测待检样本即可。

本发明SEQ ID N0.1所示核苷酸序列为人参皂苷特异性序列，通过检测这些序列可以有效区分西洋参与西洋参伪品，鉴定待检样本是否为西洋参，保证用药安全，本发明方法操作简便，具有良好的应用前景。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，都是本发明保护的内容。

附图说明

图1.西洋参中人参皂苷的改良RAPD扩增。引物SBS-Al的RAPD扩增。箭头为Al-0的RPAD片段，用于胶回收和克隆。

图2阳性克隆的PCR鉴定。亮色所指通道的阳性克隆用于Sanger测序。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。

具体实施方式

实施例1RAPD技术扩增当归特异SCAR标记

一、采用CTAB法提取人参皂苷的DNA

取西洋参0.2g置于1.5ml EP管中，加入液氮约半分钟后用研钵棒碾碎成细粉，立即加入500u1的CTAB提取缓冲液,80℃水浴保温2小时后，加入等体积的氯仿-乙醇(10:l)抽提，轻颠倒混匀，1离心分离吸取上清液，取上清加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；离心分离后小心倾倒掉上清液，沉淀物用无水乙醇清洗一次后室温干燥待用。将样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，用分光光度计测定浓度，稀释至浓度l0ng/u1，-20℃保存备用。

二、RAPD技术PCR扩增

以步骤一提取的核苷酸作为模板，用RAPD引物SBA-Al和SBS-A2进行扩增，PCR扩增采用10u1反应体系包括:lul的引物(3.0umol/L),1.5u1(15ng)模板DNA,5u1的PCR Taq Mastermi和2.5u1的灭菌双蒸水。充分混匀后，离心分离15s，置于PCR仪，PCR反应条件是:95℃1分30秒，94℃40秒，36℃60秒，72℃1分30秒，50个循环，最后72℃5分钟，然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，曝光显色。

序列号：

(1)制备1.5％的琼脂糖凝胶，将PCR产物按顺序全部点样到凝胶孔内，同时点样一个DNA分子大小标记；

(2)电泳常选择电压110V，电泳时间30min即可。

三、RAPD扩增条带的分离

1.片段回收：1.5％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下剪切图正品当归品种的特异片段Al-0，用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收RAPD扩增的DNA片段。

2.克隆：接着利用pGEM-T载体(Promega Corporation)和回收RAPD扩增的DNA片段在T4-DNA连接酶作用下连接(6℃连接6小时)。连接后加入30u1活化的DH5细菌，冰浴30分钟，接着42℃激活45秒，然后冰浴2分钟，再加入300u1无氨节青霉素的LB培养基500转每分钟摇动30分钟，然后将液体均匀涂抹在含氨节青霉素的固体LB培养基表面，25℃培养24小时(固体培养基配制方法:12.5克LB粉，7.5克琼脂粉和500毫升水高温灭菌后，在50℃时加入500u 1的氨节青霉(100mg/ml)，使用前在固体培养基表面涂抹40u1的20mg/ml的X-GAL(5-澳-4-氯-3-吲哚-B-D一半乳糖苷)和20u1的24mg/ml的工PTG(异丙基硫代半乳糖普))进行筛选，筛选白色菌落进行菌落PCR鉴定。

3.阳性克隆鉴定：每个皿挑选多个白色菌落，分别加入到300u 1含氨节青霉素的LB液体培养基中，300转每分钟摇3小时，取0.2-0.5u1培养基进行菌落PCR反应。10u1体积的反应体系是:PCR Taq Mastermix 5u1,DNA 0.5u1，通用引物(SP6+T7)1u1(2.5umol/L),水3.5u1。PCR反应条件是:95℃1分30秒，94℃40秒，36℃60秒，72℃1分30秒，50个循环，最后72℃5分钟，然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，曝光显色。

4.结果：改良RAPD扩增见图1。阳性克隆的PCR扩增和电泳鉴定结果如图2。

四、测序分析

测序：挑选阳性克隆，进行Saner测序。测序的核普酸序列如下(SEQ ID N0.1所示):

CACTCTCCCTTTATCCTCTCTACCTCTACTAATAAACAATCTCCAACACAACTAAAATATCAACACCTCACTATAATAAAAGGGTCAATAGAAATTAGAAATTAGGGTTTTGATTTTAAAAAACCCCCAAATTAAAGCTTACCAATTTCAGACTCTCCCTACTAAATACTTAT'ACTCTACTACCCTATTCCTTCTCACTACTAACACCCAAATTAAACTCTTACCAATTTCTCTACACCTACTCAAACTCTACTACTACCTCTCTACTCACTACTCTTCTTTTCTCTTAATCTCTTCTCTTCTACTTAGACTAACTCTACCTCTACTCTTCTACTTACTAACACTACTCTTGAGTGGTGGTGGTGGTG。