一种长链非编码RNA及其应用的制作方法

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及消化道肿瘤的结直肠癌组织及细胞中的长链非编码RNA的表达及其用于制备治疗所述癌症的应用。

背景技术：

结直肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。诸多类型肿瘤中，结直肠癌的分子机理研究开展比较早，研究得相对比较清楚。自Vogelstein提出经典的结直肠癌的多步骤、多基因的发生发展模式以来，结直肠癌的分子病理学在不断发展，一系列与结直肠癌发生发展有关的基因被相继发现。近二十年来，随着我国居民生活方式和饮食结构的改变，结直肠癌的发病率和死亡率呈现上升的趋势，积极开展对结直肠癌相关分子的寻找，并进行功能研究，明确其在结直肠癌发生发展中的确切作用及其相关分子机制，对寻找结直肠癌的诊断、治疗、预后靶标有很重要的意义。

结直肠癌的发生发展是个多步骤的过程，其中从正常粘膜-腺瘤-癌变途径是最重要的发生模式，其中致癌基因和抑癌基因是目前研究的重点，平时两者处于平衡状态，但一旦基因突变导致这种平衡被打破就会进而促进肿瘤的形成。由于我们对多基因参与的肿瘤多步骤调控的过程认识有限，并且缺少有效的控制手段，因此探索肿瘤诊断与治疗新的分子来源就显得十分迫切。

人类基因组计划及其后续的DNA元件计划的研究结果表明，编码蛋白的基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为非编码的RNA，包括小片段的如microRNA以及长链的非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)。近年来的许多研究都表明示IncRNA参与了一系列重要的细胞调节过程。例如长链非编码RNA参与了调节目标基因的转录、遗传印记及细胞核内的运输等众多关键的调节控制的过程，和其它包括脱氧核糖核酸甲基化、遗传印记及染色质的重新构建等表观遗传形式一样，与疾病的关系持续成为关注的热点。

LncRNA是一类转录本长度超过200个核昔酸的非编码RNA，，Tsai于2011年发现长链非编码RNA有助于肿痛的早期诊断，预后的判断和可以作为分子鞭向治疗的目标基因，因此具有较好的临床应用价值。并且大量的报道证实长链非编码RNA与多种肿瘤的形成及发展有密切的关系，如肺癌、肝癌和乳腺癌等。中国科学院根据长链非编码RNA不同的特征对其进行了分类，例如根据基因组的定位和背景可分为基因内、基因间、正义以及反义；根据发挥功能的机制分为转录水平、转录后水平和翻译水平等；根据寻鞭机制又可分为信号原型、诱巧原型、指导原型、分子支架原型；根据对DNA序列的作用方式分为顺式作用和反式作用两种等。LncRNA主要通过表观遗传水平、遗传印记、转录激活、转录后调控及蛋白功能调节等不同的信号转导途径实现基因水平的调节控制。目前在非编码RNA研究中，miRNA已经取得重要的成果；因此长链非编码RNA可能也代表着另外一个重要的分子来源。目前并没有发现结直肠癌中相关的IncRNA及其作用的发现，本申请首先证实了结直肠癌中可以作为诊断标志物以及治疗靶点的IncRNA。

技术实现要素：

TUC338是由多聚胞喀B定结合蛋白2(poly(rC)bindingprotein2，PCBP：2)基因独立转录形成的转录片段，TUC338就是克隆该转录片段而来的。TUC338对肿瘤的增殖活性及细胞凋亡发挥着十分重要调控作用。

本发明提供一种在结直肠癌中高表达的可以作为诊断结直肠癌的标志物的TUC338，其具有如1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；2)包含一个或多个取代的与SEQ ID NO：1具有90％以上的同源性的核苷酸序列。

本发明提供一种干扰RNA序列，其可以降低细胞中TUC338的表达量，所示的细胞为结直肠癌细胞。所述的干扰RNA序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供一种干扰载体，所述的载体包含SEQ ID NO：2所示的干扰序列。

本发明提供一种检测TUC338表达的试剂，所述的试剂为引物，所述的引物对具有如SEQ ID NO：3-4所示的序列。

本发明提供一种诊断试剂盒，所述的试剂盒包含SEQ ID NO：2-3所述的引物对。

本发明还请求保护TUC338作为诊断结直肠癌诊断标志物的应用，所述的TUC338具有SEQ ID NO：1所示的序列。

本发明还请求保护一种抑制TUC338表达的试剂用于制备治疗结直肠癌药物的应用；所述的试剂为干扰RNA，优选的，所述的干扰RNA具有SEQ ID NO：4所示的序列。

说明书附图

图1结直肠癌肿瘤组织与癌旁组织中TUC388表达差异对比；

图2 RT-PCR检测干扰RNA片段对于细胞系TUC338表达差异的对比；

图3 MTT实验检测转染shRNA干扰TUC338后的细胞增殖率被抑制的情况；

图4侵袭实验结果证明，在转染shRNA后，明显抑制了细胞的侵袭活性；

图5转染shRNA后HT29的凋亡率显示。

具体实施方式

实施例1结直肠癌组织样本中TUC338表达量的检测

1)、选取科病理确诊为结肠癌或直肠癌患者并且采用手术，治疗的17例结直肠癌患者的新鲜癌组织及其对应的癌旁组织(切缘3cm以外)，所有患者术前均未行化疗、放疗等抗肿瘤治疗，排除其他系统性疾病，排除转移癌可能，各个重要器官功能在正常范围么内。

2)、引物的合成：在GenBank Blast查询，查找到目的基因TUC338mRNA的序列(SEQ ID NO：1)，应用Primer的express 2.0软件在CDS区上设计特异性引物探针，引物探针合成由(公司)合成，引物序列如下：

Forward(5′-3)：GCCCCACCCCTTCATTCTTA(SEQ ID NO：2)

Reverse(5′-3′)：CAGACACAATTTGAAACGAGCTG(SEQ ID NO：3)；

β-Actin序列：

Forward(5′-3)：ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGAT(SEQ ID NO：5)

Reverse(5′-3′)：CTTGCACATGCCGGAGCCGTT(SEQID NO：6)；

3)、总RNA的提取

a)将保存在-80℃冰箱中的结直肠癌及其对应的癌旁组织取出，然后马上研磨成撤末。按100-200∶1的比例加入BiooPure，常温放置五分钟。按照BiooPure体积的五分之一加入氯仿，离心，吸取上清。

b)将上一步液体，再次离也沉淀RNA后去除上清。

c)用泛醇清洗RNA，常媪下干燥10分钟，跟着取少许进行检测。

4)、总RNA定量和纯度检测：超微量分光光度计(QuawellQ5000)

a)先用DEPC水调零；

b)取1.0μl样品检测，每检测完一个样品后，纱布擦干，紧跟着再检测下一个样品；

c)根据检测结果取恰量RNA定量至1.0μg，备以后研究所用。

5)逆转录

a)体系配制(TaKaRa D6110A)

b)在PCR仪器上进行变性、退火反应：

65℃5min

冰上冷却；

c)配制逆转录反应液体系(20μl)：

d)在PCR仪上进行如下的反应：

30℃10min

42℃60min

95℃5min；处理后，冰上放置。

6)QPCR检测反应(TaKaRa DRR820A)

a)体系配制

混合均匀，离心，分装96孔板，各个样品各个基因进行三个重复。

b)QPCR反应条件设置

比较CT法分析数据，结果见图1所示。经过数据计算及统计，结直肠癌肿瘤组织中TUC388的表达升高4.31±2.13倍，且数据具有统计学意义(t＝5.137，p＜0.001)。

实施例2干扰RNA序列的设计及载体制备

1)根据TUC338序列信息设计干扰片段和阴性对照序列，其中干扰序列为：

siRNA-TUC338：

Sense Seq：5′-UACAGCACAGGCAGCGACTT-3′；(SEQ ID NO：2)

Antisense Seq：5′-GUCGCUGCCUGUGCUGUATT-3′；

Negative Control siRNA：

Sense Seq：5′-UUGUGCGAAGCUGAUGCUTT-3′；(SEQ ID NO：7)

AntiSense Seq 5′-AGCAUCAGCUUCGCACAATT-3′。

2)载体构建

化学合成上述的片段，退火后通过酶切连接入载体pLVX-shRNA1中，所述的方法包括：

a)寡核苷酸的退火

将合成好的脱氧核苷酸稀释至1μg/μL，正义链和反义链各取5μL退火形成双链，反应体系如下：

正义链 5μL

反义链 5μL

ddH₂O 15μL

反应温度为95℃，反应5min，然后将至室温。

b)载体的酶切

用BamH I和EcoR I双酶切shRNA表达载体反应体系如下：

反应条件为37℃，反应时间为1h。

酶切后的产物进行凝胶电泳，胶回收酶切后的载体片段；4℃保存备用。

c)寡核苷酸片段与载体的连接

将退火形成的脱氧核苷酸双链片段与双酶切后的空白载体，反应体系如下

反应条件为16℃，连接过夜。

d)转化感受态细胞并进行克隆验证

①将上述步骤获得的连接产物加到CaCl₂法制备的大肠杆菌感受态细胞中，冰浴40min；

②将上述的感受态与连接片段的混合物至于42℃水浴中热激90sec，然后取出至于冰浴中5min；

③将转化后的菌株涂布在含有抗生素LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜；

④挑取单菌落加入到含有700μL含有抗生素的LB液体培养基中，150rpm震荡培养过夜；

⑤提取质粒，双酶切验证；

⑥将酶切验证正确的克隆送公司测序验证连接序列是否正确；保留测序正确的克隆。

实施例3干扰RNA载体的干扰效果检验

HT29细胞作为受体细胞，转染前进行复苏，传代培养；设置实验组，即干扰组(Si)、阴性对照(NC)和空白对照组(Blank)。

1)细胞转染

a)转染前24h细胞改用不含有任何抗生素的培养基；

b)细胞汇合率达到70％；；

c)取20μL连接产物加入到400μL的无血清培养基中，加入5μL Lipo2000转染试剂，室温下混匀，静置20min；

d)每组设置三个重复孔，每孔加入上述步骤制得的转染试剂400μL，置于5％CO₂，37℃培养箱中培养7-8h，然后更换为正常的培养液。

e)转染后24-48小时，检测RNA表达水平。

2)荧光定量PCR检测

a)RNA提取；

b)RT-PCR检测，具体方法请参见实施例1.结果见表1和图2所示。

表1 RT-PCR验证干扰片段的效果

实验结果显示，发明人设计的TUC338的RNAi片段可以明显降低TUC338的转录量，而对照组并仅有少量的降低，说明本申请的RNAi片段构建成功。

实施例4TUC338表达量降低对于肿瘤细胞的影响

1)HT29细胞增殖实验——MTT检测

a)细胞接种：细胞消化计数，按照600个/ml的密度接种到96孔板；每孔加入200μL，置于5％CO₂，37℃培养箱中放置培养；

b)细胞转染：转染含有siRNA的载体shRNA，以及阴性对照NC，分别在24h、48h和72h后进行染色、检测；

c)染色：细胞培养24h后，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μL，基于置于5％CO₂，37℃培养箱中放置培养4h；

d)检测：去除培养板每孔中的培养液，每孔加入150μL的DMSO，水平震荡10min，酶标仪检测492nm处的吸光值，绘制生长曲线。结果见表2以及图3所示。

表2转染shRNA72h后对于细胞的增殖抑制率

实验结果显示，转染shRNA的细胞系细胞增殖速率被明显抑制，而对照组的抑制率则未有明显降低，可见在抑制TUC338的转录后，有效抑制了结直肠癌细胞的增殖，提示其具有一定的抑癌作用。

2)细胞侵袭实验——Transwell方法

a)细胞的培养以及转染同上；

b)在细胞转染24h后，胰酶消化成单个细胞悬液，技术，离心，收集细胞沉淀，无血清培养基重悬，调整细胞密度在1×10⁶；

c)实验前预先在Transwell小室的上室中涂布20μL的matrigel，使其在冰上风干，吸取多余的液体，然后每孔加入50μL的含10g/LBSA的无血清液，37℃，30min；

d)上室中添加200μL的细胞悬液，下室添加5％胎牛血清的1640培养基，500μL，置于37℃5％CO₂中培养24h；

e)弃去培养基，并擦去上室中的多余细胞；

f)酒精固定细胞，固定时间在30-40min；

g)用0.1％捷径紫染色，染色20min，蒸馏水清洗未着色的燃料；

h)镜检，并计算细胞的平均值以及抑制率。

经过镜检及计算得出，对照组中，HT29细胞系在转染shRNA后，侵袭的抑制率分别为31.43±15.67％，而实验组为161.47±24.56％，t值为2.654，p为0.002，具备统计学意义，而图4中也可以看出，在转染shRNA后，明显抑制了细胞的侵袭及迁移活性。

3)细胞凋亡和细胞周期的检测——流式细胞仪法

a)细胞培养以及转染同上；

b)转染48h后，收集细胞；

c)加入PBS缓冲液清洗细胞沉淀2此；

d)75％的冰乙醇重悬细胞，并在-20℃条件下固定超过12h；

e)PBS清洗细胞，离心收集细胞；

f)RNase处理，37℃水域20-30min；

g)PI染色，混匀；

h)避光室温孵育15min；

i)流式细胞仪上机检测。

每组重复3此，计算细胞的凋亡率得出，HT29细胞系在转染shRNA后，相比对照组以及空白组，其凋亡率有明显上升，分别是空白组4.87±0.23％，阴性对照组5.61±0.05％，实验组为11.20±0.04％，F值为5903.239，p＜0.001。具有一定的统计学意义，具体见图5所示。

上述实施例仅是记载了本领域中的常规方法，用于说明本申请的发明构思，其并不代表本申请的保护范围，本领域技术人员知晓上述操作方法中的替代手段，均涵盖在本申请的保护范围之中。