鉴定或辅助鉴定痤疮丙酸杆菌的专用引物及其应用的制作方法

本发明涉及于生物技术领域，具体的说是一种鉴定或辅助鉴定痤疮丙酸杆菌的专用引物及其应用。

背景技术：

痤疮丙酸杆菌为一种嗜脂肪酸的放线菌，革兰氏阳性，广泛分布于人的皮肤表面，其在皮肤表面的分布范围因皮脂腺分泌旺盛程度不同而有所不同。

目前普遍认为痤疮丙酸杆菌是造成痤疮的主要致病菌。此外，在外科手术如心脏瓣膜手术及骨科器械手术中，术后并发痤疮丙酸杆菌感染的病例也并不鲜见。

人体皮肤表面微生物种类繁多，仅仅丙酸杆菌属就有三种，而单纯从培养和形态学观察上几乎难以对其进行区分。现在对痤疮丙酸杆菌的鉴定方法繁琐且周期长，需要先用特异培养基对样本进行培养，然后挑取单克隆进行16sPCR扩增并测序，才能最终完成鉴定。因此，痤疮丙酸杆菌的快速鉴定对该菌的种属鉴定及其引发感染的防治具有重要意义。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种鉴定或辅助鉴定痤疮丙酸杆菌的专用引物及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种鉴定或辅助鉴定痤疮丙酸杆菌的专用引物，引物为SEQ ID NO:1-6所示序列中特定两个序列组合的引物对。

所述引物对分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列(引物对12)；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列(引物对34)；或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列(引物对56)。

一种鉴定或辅助鉴定痤疮丙酸杆菌的专用引物在制备鉴定或辅助鉴定痤疮丙酸杆菌的试剂盒中的应用。

一种鉴定或辅助鉴定痤疮丙酸杆菌试剂盒，包括权利要求1所述专用引物。

一种检测来自样品中是否携带痤疮丙酸杆菌的方法：包括如下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用上述权利要求1所述引物对对进行PCR扩增；扩增产物满足下述至少一个条件，即待测样本中即含有痤疮丙酸杆菌基因组；

采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对时，得到在180bp和200bp之间的扩增产物；

采用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的引物对时，得到在120bp和140bp之间的扩增产物；

采用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列的引物对时，得到在180bp和200bp之间的扩增产物。

所述PCR扩增的反应程序具体可为：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃-65℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环。

本发明所具有的优点：

本发明提供的引物，可以用于鉴定待测样本是否含有痤疮丙酸杆菌，其图谱清晰，速度快，灵敏度高，可以从皮肤表面擦拭样品，细菌培养物，菌落单克隆等多种样本的DNA提取产物中检测痤疮丙酸杆菌。本发明对于痤疮丙酸杆菌的菌种快速鉴定及其造成感染的防治具有重要意义。

附图说明

图1为本发明引物特异性的PCR结果验证。M：marker(D15000+2000)；N：无模板对照；A：痤疮丙酸杆菌单克隆；B：贪婪丙酸杆菌单克隆；C：颗粒丙酸杆菌单克隆；D—F：不同来源的表皮葡萄球菌单克隆；G：金黄色葡萄球菌单克隆；H：人面部皮肤采样培养物；

图2为本发明实施例提供的对图1中各样品16sPCR验证。M：marker(D15000+2000)；N：无模板对照；A：痤疮丙酸杆菌单克隆；B：贪婪丙酸杆菌单克隆；C：颗粒丙酸杆菌单克隆；D—F：不同来源的表皮葡萄球菌单克隆；G：金黄色葡萄球菌单克隆；H：人面部皮肤采样培养物；

图3为本发明实施例提供的对图2中A—G样品16s测序结果，经过blast比对后，确认测序结果为：A：痤疮丙酸杆菌；B：贪婪丙酸杆菌；C：颗粒丙酸杆菌；D：表皮葡萄球菌；E：表皮葡萄球菌；F：表皮葡萄球菌；G：金黄色葡萄球菌。

图4—图7，为本发明实施例的qPCR检测引物灵敏度的实验结果图。

图4为本发明实施例提供的模板浓度梯度条件下的qPCR扩增曲线。

图5为本发明实施例提供的图4扩增曲线对应的qPCR产物熔解曲线。

图6为本发明实施例提供的低模板浓度下的qPCR扩增曲线。

图7为本发明实施例提供的qPCR产物的琼脂糖电泳图。

图8为本发明实施例提供的6例痤疮患者面部棉拭子取样的检测结果，其中M：marker(D15000+2000)；N：无模板对照；A：痤疮丙酸杆菌单克隆(经测序确认)；B—D：涂布培养样本；E—G：未涂布培养样本。

图9为本发明实施例提供的粉刺培养物检测结果，其中M：marker(500bp)；N：无模板对照；A：痤疮丙酸杆菌单克隆(经测序确认)；B：涂布扩培样本；C：凸起小菌落1；D：凸起小菌落2；E：扁平单菌落。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

待测样品：擦脸后的棉拭子或擦脸后的棉拭子上的后培养物

提取待测样品的DNA，可参考革兰氏阳性菌的提取方法。

具体，取6例痤疮病人(严重程度1-4级不等)面部擦拭样本，其中3例采用哥伦比亚血琼脂平板涂布培养，将培养物用PBS缓冲液从平板上洗下回收，并提取培养物总DNA。余下3例直接采用QIAamp DNA mini kit(QIAGEN)提取样品总DNA；待用。

PCR检测：

以上述获得的DNA分别作为模板，采用引物对12进行PCR扩增检测，PCR反应体系总体积20μL，包括：0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，1μL模板，10μL的2×PCRmix(2×PCR预混反应液)，去离子水；

反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环；

电泳结果如图8所示，其中M：marker(D15000+2000)；N：无模板对照；A：痤疮丙酸杆菌单克隆(经测序确认，作为阳性对照)；B—D：痤疮患者面部采样涂布培养样本；E—G：痤疮患者面部采样样本。

由图8可见，N泳道没有扩增产物，A—G泳道均有扩增产物，且产物长度在180—200bp之间，符合前述扩增产物长度范围。

依据前述判断标准，6例样本均可检出痤疮丙酸杆菌。

实施例2

待测样品：样本培养物检测痤疮丙酸杆菌及菌单克隆菌种鉴定

取1例面部有开放性粉刺(黑头)的棉签擦拭样本，涂布哥伦比亚血琼脂平板培养。挑取3个单菌落(其中2个为干燥凸起的小菌落，疑似痤疮丙酸杆菌，另1个为扁平半透明菌落)扩大培养，待用。

PCR检测：

以上述获得的DAN分别作为模板，采用引物对34(参见表1)进行PCR扩增检测，PCR反应体系总体积20μL，包括：0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，1μL模板，10μL的2×PCRmix(2×PCR预混反应液)，去离子水；

反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环；

电泳结果如图9所示，M：marker(500bp)；N：无模板对照；A：痤疮丙酸杆菌单克隆(经测序确认，作为阳性对照)；B：涂布扩培样本；C：凸起小菌落1；D：凸起小菌落2；E：扁平单菌落

由图9可见，N孔道没有扩增产物；A—D孔道均有扩增产物，且产物长度在120—140bp间，符合前述扩增产物长度范围；E孔道无扩增产物。

依据前述标准判断：棉签擦拭样品中含有痤疮丙酸杆菌；此样品中干燥凸起的小菌落1、2均为痤疮丙酸杆菌；此样品中扁平菌落非痤疮丙酸杆菌

实施例3

待测样品：以测序确认为痤疮丙酸杆菌的单克隆培养物的基因组DNA作为标准品，将其浓度分别稀释为10⁷个/μL；10⁶个/μL；10⁵个/μL；10⁴个/μL；10³个/μL；10²个/μL；10¹个/μL；待用。

qPCR检测：

以上述获得的不同浓度的DNA作为模板，在采用引物对56进行PCR扩增检测，PCR反应体系总体积20μL，包括：0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，1μL模板，10μL的2×qPCRmix(2×qPCR预混反应液)，去离子水；

反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，40个循环，每次循环结束后检测荧光(参见图4-7)；

由图4可见，10⁷为模板浓度10⁷个/μL的qPCR扩增曲线；10⁶为模板浓度10⁶个/μL的qPCR扩增曲线；10⁵为模板浓度10⁵个/μL的qPCR扩增曲线；10⁴为模板浓度10⁴个/μL的qPCR扩增曲线；10³为模板浓度10³个/μL的qPCR扩增曲线；10²为模板浓度10²个/μL的qPCR扩增曲线；10¹为模板浓度10¹个/μL的qPCR扩增曲线；N为无模板对照。可以看出，引物扩增状态可以反映出模板浓度梯度的变化。

由图5可见，10^-7—10^-1为模板浓度10⁷个/μL—10¹个/μL的qPCR产物熔解曲线，N为无模板对照的qPCR产物熔解曲线。由熔解曲线可知，各个模板浓度下，q PCR扩增产物均一；无模板对照未出现扩增产物，说明该引物具有较好的特异性。

由图6可见，N为无模板对照的qPCR扩增曲线，该反应重复3次；10¹为模板浓度为10¹个/μL时，qPCR的扩增曲线，该反应重复3次；10²为模板浓度为10²个/μL时，qPCR的扩增曲线，该反应重复3次。当模板浓度为10²个/μL时，可以稳定进行qPCR扩增，当模板浓度降至10¹个/μL，仍有一定概率扩出目的片段，说明当模板拷贝数达到100个时，该引物组能实现稳定的扩增检测。

由图7可见，N为无模板对照，10¹为模板浓度为10¹个/μL的qPCR扩增产物，10²为模板浓度为10²个/μL的qPCR扩增产物，10³为模板浓度为10³个/μL的qPCR扩增产物，10⁴为模板浓度为10⁴个/μL的qPCR扩增产物，10⁵为模板浓度为10⁵个/μL的qPCR扩增产物，10⁶为模板浓度为10⁶个/μL的qPCR扩增产物，10⁷为模板浓度为10⁷个/μL的qPCR扩增产物。所有扩增产物的长度均在180-200bp之间，符合前述的扩增产物长度范围。

依据前述判断标准可知：当痤疮丙酸杆菌DNA拷贝数处于10¹个—10⁷个的梯度变化中，本发明的引物组均可检出痤疮丙酸杆菌。当样本中痤疮丙酸杆菌的模板DNA拷贝数大于100个时，可被引物组稳定检出；当样本中痤疮丙酸杆菌的模板DNA拷贝数小于100个且大于10个时，可被引物组概率检出。

实施例4

待测样品：痤疮丙酸杆菌单克隆；贪婪丙酸杆菌单克隆；颗粒丙酸杆菌单克隆；3个不同来源的表皮葡萄球菌单克隆；金黄色葡萄球菌单克隆；人面部皮肤采样培养物；以上所有细菌单克隆样本均经过16s全长的PCR扩增，并用一代测序确认；以上所有样本提取总DNA后，待用。

PCR检测：

以上述获得的DNA分别作为模板，在采用引物对56(参见表1)进行PCR扩增检测(参见图1-3)，PCR反应体系总体积20μL，包括：0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，1μL模板，10μL的2×PCRmix(2×PCR预混反应液)，去离子水；

反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环；

电泳结果如图1所示，M：marker(D15000+2000)；N：无模板对照；A：痤疮丙酸杆菌单克隆；B：贪婪丙酸杆菌单克隆；C：颗粒丙酸杆菌单克隆；D—F：不同来源的表皮葡萄球菌单克隆；G：金黄色葡萄球菌单克隆；H：人面部皮肤采样培养物。

由图1可见，仅A泳道痤疮丙酸杆菌和H泳道人面部皮肤培养物可检出扩增产物，扩增产物长度为180—200bp之间，符合前述扩增产物长度范围。

图2为图1中所有样品的16s扩增验证，16s引物及扩增条件均由“生工生物工程(上海)股份有限公司”提供。

由图2可见，M：marker(D15000+2000)；N：无模板对照；A：痤疮丙酸杆菌单克隆；B：贪婪丙酸杆菌单克隆；C：颗粒丙酸杆菌单克隆；D—F：不同来源的表皮葡萄球菌单克隆；G：金黄色葡萄球菌单克隆；H：人面部皮肤采样培养物。根据电泳结果可知，图1中所有样本DNA提取均没有问题。

图3为图2中单克隆样本的一代测序峰图，经过blast比对后，确认测序结果为：A：痤疮丙酸杆菌；B：贪婪丙酸杆菌；C：颗粒丙酸杆菌；D：表皮葡萄球菌；E：表皮葡萄球菌；F：表皮葡萄球菌；G：金黄色葡萄球菌。

根据前述判断标准可知：A—H共8份样品中，仅有A痤疮丙酸杆菌和H人面部皮肤采样培养物符合前述判断标准，可被本发明引物组检出痤疮丙酸杆菌。该引物组可有效检出样品中的痤疮丙酸杆菌DNA，未发现假阳性情况。

表1