本发明涉及生物技术领域，尤其涉及植物生物技术领域，具体涉及利用组织培养法生产苹果花青苷的方法。
技术背景
花青苷是广泛存在于植物的花、果实中的天然水溶性色素，它属于类黄酮类化合物，是一种抗氧化剂。花青苷的有益作用有：软化血管、降血压、促进新陈代谢和预防心脑血管疾病，抗氧化活性、防止癌变、提高视觉功能等，是一种公认对健康有益的健康物质，而红肉苹果中含有丰富的花青苷。但是，目前我国在生产上推广的红肉苹果品种和栽培的面积都比较少，且受时间及原材料缺乏的限制，不能满足工厂化生产的要求，且花青苷含量较低，因此，探索一种规模化生产花青苷的方法，对功能性果品的选育以及天然抗氧化剂的开发应用具有重要意义。
本发明采用的原材料为新疆红肉苹果红勋1号与富士苹果杂交后获得的果肉鲜红的优系(2010-15)的新稍茎尖，其中母本新疆红肉苹果红勋1号的相关特性描述，发明人已经发表了文章：Morphological characteristic and pollination compatibility ofa new red flesh apple,HongxunNo.1.Research on Crops,2013,14(1):199-204，该红肉优系(2010-15)栽植在青岛农业大学的育种基地。
技术实现要素：
本发明的目的在于利用一种新的方法提取花青苷，解决目前红肉苹果品种及栽培受面积少、且受季节及原材料缺乏的限制、花青苷含量过低、不能满足工厂化生产的要求的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供如下解决方案：
一种红肉苹果组培苗生产花青苷的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)获取无菌材料：
选择新疆红肉苹果与富士苹果杂交后获得的果肉鲜红的优系(2010-15)红肉苹果的新稍茎尖为外植体，用1％吐温(或洗衣粉)水浸泡15min，再用自来水冲洗20min后，于超净工作台上，用75％的酒精浸泡消毒30s，无菌水冲洗1遍，再用0.1％氯化汞溶液浸泡消毒6-8min，期间不断晃动，使外植体各面均接触到消毒液，最后用无菌水清洗5遍；
(2)初代培养获得红肉苹果组培苗：
将外植体接种到诱导培养基上，所述诱导培养基以MS为基本培养基，添加1.0mg·L-1的6-BA(苄基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)，30g·L-1蔗糖，8g·L-1琼脂，3g·L-1活性炭，4g·L-1PVP，培养基pH值为5.8，经121℃高压蒸汽灭菌25min后，分装，待外植体生长成0.6-1.3cm的小芽时，进行继代增值培养；
(3)继代培养获得大量红肉苹果组培苗：
将小芽接种到继代培养基上进行增值培养，所述继代培养基成分为MS、1.0mg·L-16-BA、0.1mg·L-1IBA，约10-20天后，分化出2-3个丛生芽，25-35天后，丛生芽长至约2cm，平均4-5周继代一次，继代培养过程中温度控制在20-30℃；
(4)壮苗培养：
取继代培养长势良好的红肉苹果组培苗，接种至以MS为基本培养基，添加1.0mg·L-1的6-BA(苄基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)、30g·L-1果糖或山梨醇、8g·L-1琼脂的培养基上，放置在17℃恒温光照培养箱里进行壮苗培养；
(5)花青苷的提取和粗品的制备：
选取果糖或山梨醇处理的17℃恒温培养14天后的组培苗，剪碎后用液氮研磨成粉，将得到的粉末置于锥形瓶中，按固液比1:10加入丙酮溶液，将锥形瓶用封口膜封口，置于超声波清洗器中，控制温度在30℃，超声30min后置于黑暗中浸提10小时，得浸提液，将浸提液用连接真空抽气泵的布氏漏斗抽滤，将所得滤液倒入旋蒸瓶，在旋转蒸发仪上以20-30℃的温度旋蒸去除丙酮溶剂，然后避光静置，再经过抽滤，滤纸上的颗粒即为花青苷粗品。
本发明所达到的有益效果是：
(1)进行初代培养时，在MS培养基中附加活性炭和PVP，防止了褐化的发生，附加100mg·L-1的羧苄青霉素，可避免细菌性污染，使外植体污染率及褐化率为0，茎尖萌动率为100％；
(2)接种到继代培养基后，约10-20天后，分化出2-3个丛生芽，25-35天后，丛生芽长至约2cm，平均4-5周可继代一次，使栽培面积增多，解决原材料受限制的问题；
(3)经过果糖或山梨醇处理的组培苗在17℃恒温光照培养箱下培养14d后，其花青苷含量分别359.86U·g-1FW和349.41U·g-1FW，是室温下(25℃)常规蔗糖培养基上的花青苷含量(45.86U·g-1FW)的7.8和7.6倍，其中果糖处理的17℃条件下培养14d后组培苗花青苷含量分别是5年生结果树花后12周果皮(201.3U·g-1FW)、新叶(124.9U·g-1FW)、花后12周果肉(124.0U·g-1FW)和花(98.2U·g-1FW)的1.8、2.8、2.9、3.6倍，花青苷含量大大提高。
附图说明
图1为红肉苹果优系(2010-15)5年生树不同时期不同器官的花青苷含量。
具体实施方式
实施例：
一种红肉苹果组培苗生产花青苷的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)获取无菌材料：
选择新疆红肉苹果与富士苹果杂交后获得的果肉鲜红的优系(2010-15)红肉苹果的新稍茎尖为外植体，用1％吐温(或洗衣粉)水浸泡15min，再用自来水冲洗20min后，于超净工作台上，用75％的酒精浸泡消毒30s，无菌水冲洗1遍，再用0.1％氯化汞溶液浸泡消毒6-8min，期间不断晃动，使外植体各面均接触到消毒液，最后用无菌水清洗5遍；
(2)初代培养获得红肉苹果组培苗：
将外植体接种到诱导培养基上，所述诱导培养基以MS为基本培养基，添加1.0mg·L-1的6-BA(苄基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)，30g·L-1蔗糖，8g·L-1琼脂，3g·L-1活性炭，4g·L-1PVP，培养基pH值为5.8，经121℃高压蒸汽灭菌25min后，分装，待外植体生长成0.6-1.3cm的小芽时，进行继代增值培养；
(3)继代培养获得大量红肉苹果组培苗：·
将小芽接种到继代培养基上进行增值培养，所述继代培养基成分为MS、1.0mg·L-16-BA、0.1mg·L-1IBA，约10-20天后，分化出2-3个丛生芽，25-35天后，丛生芽长至约2cm，平均4-5周继代一次，继代培养过程中温度控制在20-30℃；
(4)壮苗培养：
取继代培养长势良好的红肉苹果组培苗，接种至以MS为基本培养基，添加1.0mg·L-1的6-BA(苄基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)、30g·L-1果糖或山梨醇、8g·L-1琼脂的培养基上，放置在17℃恒温光照培养箱里进行壮苗培养；
(5)花青苷的提取和粗品的制备：
选取果糖或山梨醇处理的17℃恒温培养14天后的组培苗，剪碎后用液氮研磨成粉，将得到的粉末置于锥形瓶中，按固液比1:10加入丙酮溶液，将锥形瓶用封口膜封口，置于超声波清洗器中，控制温度在30℃，超声30min后置于黑暗中浸提10小时，得浸提液，将浸提液用连接真空抽气泵的布氏漏斗抽滤，将所得滤液倒入旋蒸瓶，在旋转蒸发仪上以20-30℃的温度旋蒸去除丙酮溶剂，然后避光静置，再经过抽滤，滤纸上的颗粒即为花青苷粗品。
上述花青苷的提取和粗品的制备中选择的丙酮溶剂易挥发，可以通过旋转蒸发去除，将剪碎后的组培苗用液氮研磨成细粉并用超声30分钟的方法提取，可最大程度地将组培苗中的花青苷浸提出来，真空冷冻干燥冻干花青苷粗品，避免了红肉苹果花青苷由于温度和空气中的氧接触而降解。
需要说明的是为了大规模工厂化生产花青苷，提高组培苗花青苷含量，发明人在壮苗培养的MS培养基上分别添加了不同种类的糖进行试验，糖种类共设8种，即：山梨醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖，在不同的处理温度下，恒温培养14天后的组培苗，其花青苷含量分别为(甘露糖是组培苗枯萎致死，故不能测其花青苷含量)：
需要说明的是发明人为了比较经过糖和温度处理的组培苗花青苷含量与5年生大树的果实、叶片及花的花青苷含量的差别，测定了红肉苹果优系(2010-15)5年生树不同时期不同器官的花青苷含量，请参见附图1：其中，果糖处理的17℃条件下培养14d后组培苗花青苷含量分别是5年生结果树花后12周果皮(201.3U·g-1FW)、新叶(124.9U·g-1FW)、花后12周果肉(124.0U·g-1FW)和花(98.2U·g-1FW)的1.8、2.8、2.9、3.6倍。
需要说明的是：花青苷含量的测定按照Liu et al(2009)进行，将采集的叶片、花、果皮、果肉切碎后放入10ml1％Hcl/甲醇溶液在4℃冰箱中浸提24h，用分光光度计测定提取液在553nm和600nm处吸光值，以每克样品的提取液的光密度变化值53nm-A600nm＝0.01作为一个花青苷单位，以U·g-1FW表示。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限定本发明，凡在依据本发明的技术实质所作的简单的任何修改、等同替换、修饰等，均应包括在本发明的保护范围之内。