本发明属于中药制备技术领域，具体涉及一种灯盏花乙素苷元衍生物及其制备方法、制剂与应用。
背景技术：
心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是中老年人健康的常见病，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。目前，我国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人，我国每年死于心脑血管疾病近300万人，占我国每年总死亡病因的51%。心脑血管疾病已成为人类死亡病因最高的头号杀手，也是人们健康的“无声凶煞”。心脑血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高，并发症多” ，即“四高一多”的特点。即使应用目前最先进、完善的治疗手段，仍可有50%以上的脑血管意外幸存者生活不能完全自理，而幸存下来的患者75%不同程度丧失劳动力，40%重残，由此导致的家庭、医疗和经济负担已成为不可小觑的社会问题。因此研制更多疗效显著、安全的心脑血管疾病治疗药物是极为迫切的事情。
在中国血栓性疾病已经成为了各种疾病中最主要至残和致死的的病因之一。这些疾病包括：急性冠脉综合征：包括不稳定心绞痛和心肌梗死，心脏猝死，外周动脉阻塞，缺血性中风，深静脉血栓(DVT)，肺动脉栓塞等。尽管目前对以上血栓性疾病的治疗手段和药物上有了长足的进步，但由于这些药物均存在不同程度的缺陷，如抗血栓作用不强或因完全阻断了机体的抗凝机制而触发内出血现象。因此临床上可以选择的治疗手段和药物仍然十分有限，急需更有效而且安全性更高的抗血栓新药来替代现有的治疗方法，以满足目前日益增长的临床需求。
分子病理学研究显示体内血栓的形成过程主要有血小板聚集激活和血液凝固反应激活两大机制参与。两个机制各有不同的调节环节。阿司匹林和雷比格雷是强烈的血小板聚集抑制剂，在临床上常用于血栓防治。而肝素钠，磺达肝素和法华林则属于抗凝剂，作用于血液凝集通路，在临床上也广泛使用于各种血栓性疾病的预防与治疗。但上述两大常规抗血栓药物的一个主要副作用就是部分患者使用之后引发内出血。
血液凝固即液体状态血液变成固体凝胶或凝块的过程。其主要机制为凝血酶将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性铰链状纤维蛋白丝，这是复杂的凝血级联反应中的最后一步。凝血酶主要通过两条激活通路形成：1、内源性通路：引发于因子十二(XIIa)的活化；2、外源性通路：引发于分布在血管内壁细胞表面的组织因子与因子七的结合。凝血因子Xa是一种丝氨酸蛋白酶, 位于血液凝集级联的上游, 处在连接内源性和外源性激活途径共同通路的中心位置, 它既能阻断内源性凝血亦能抑制外源性凝血的发生，是当今抗血栓药物研究的的最新靶点。研究表明在凝集通路中一个分子的Xa可以激活并产生出数百个分子的凝血酶，因此抗Xa活性是一种比抑制凝血酶更有效的阻止纤维蛋白形成的手段。已有大量的体内、体外实验证据表明Xa抑制对阻止纤维蛋白的形成比抑制凝血酶的作用要强，而且持续时间要长得多。此外Xa特异性抑制剂对凝血酶无抑制作用，因而不会影响到已经形成的凝血酶的活性，从而减少了患者使用后潜在的内出血风险。因此针对Xa抑制剂的研究已经成为当代抗血栓新药研究公认的潮流。例如2008年上市的利伐沙班、2011年上市的依杜沙斑以及2012年上市的阿哌沙班。其他新的Xa因子抑制剂如 letaxaban， darexaban，eribaxaban LY517717等相继进入了不同阶段的试验。
灯盏花乙素苷元，又叫野黄芩苷元，金黄紫碱（Scutellarein,CAS:529-53-3,分子式C15H10O6,分子量：286.24），其结构式如下：
灯盏花乙素苷元具有较强的生物活性。由于灯盏花乙素苷元水溶性和脂溶性都十分差，难透过生物膜，故吸收较差，生物利用度极低，另外，灯盏花乙素苷元分子中含有4个酚羟基，易氧化变性。因此，药物设计家纷纷合成大量的新化合物，以期在药理作用不变的情况下，增强新化合物的水溶性或脂溶性，降低氧化性从而提高药物稳定性，最终发现药理活性更强、更稳定的药物。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种灯盏花乙素苷元衍生物；第二目的在于提供所述灯盏花乙素苷元衍生的制备方法；第三目的在于提供所述灯盏花乙素苷元衍生物的制剂；第四目的在于提供所述灯盏花乙素苷元衍生物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的灯盏花乙素苷元衍生物具有下述结构：
其中，R为具有生物活性的化合物残基。
本发明的第二目的是这样实现的，是以原料4-氟苯硼酸、3-氟苯硼酸、4-苯基苯硼酸、4-三氟基苯硼酸或4-硼酸吡啶与原料氯代三甲氧基色原酮发生偶联反应得到目标物灯盏花乙素苷元衍生物。
该反应的反应式为：
。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的灯盏花乙素苷元衍生物中加入药学上接受的辅料制备成片剂、胶囊剂、注射液或冻干粉针剂。
本发明的第四目的是这样实现的，所述的灯盏花乙素苷元衍生物在制备深静脉血栓、肺血栓栓塞、心脑血管疾病、中风和血液凝集疾病药物中的应用。
本发明所述灯盏花乙素苷元衍生物具有明显的抗凝血作用，可用于作为潜在的先导化合物，在制备治疗深静脉血栓和肺血栓栓塞、心脑血管疾病、中风和其他与血液凝集相关的疾病的药物中运用。本发明所述的灯盏花苷元衍生物的制备方法简单易行，重现性好，环境污染小，可用于所述的灯盏花苷元衍生物的大量制备。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的灯盏花乙素苷元衍生物具有下述结构：
其中，R为具有生物活性的化合物残基。
R为、、、或。
本发明所述的灯盏花乙素苷元衍生物的制备方法，是以原料4-氟苯硼酸、3-氟苯硼酸、4-苯基苯硼酸、4-三氟基苯硼酸或4-硼酸吡啶与原料氯代三甲氧基色原酮发生偶联反应得到目标物灯盏花乙素苷元衍生物。
所述的制备方法是以原料4-氟苯硼酸、3-氟苯硼酸、4-苯基苯硼酸、4-三氟基苯硼酸或4-硼酸吡啶在钯催化剂和有机溶剂存在下，与氯代三甲氧基色原酮发生偶联反应得到目标物灯盏花乙素苷元衍生物。
该反应的反应式为：
催化剂是指能提高化学反应速率，而本身结构不发生永久性改变的物质。
所述的钯催化剂为三苯基磷钯。
有机溶剂是指溶剂中包含碳原子的能溶解不溶于水的物质的一类有机化合物，包括链烷烃、烯烃、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烃、氢化烃、萜烯烃、卤代烃、杂环化物、含氮化合物及含硫化合物等多类物质，在常温常压下呈液态，具有较大的挥发性，在溶解过程中，溶质与溶剂的性质均无改变。
所述的有机溶剂为链烷烃、烯烃、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烃、氢化烃、萜烯烃、卤代烃、杂环化合物、含氮化合物或含硫化合物。
所述的有机溶剂为二氧六环、叔丁基甲基醚或四氢呋喃。
本发明所述的灯盏花乙素苷元衍生物的制剂为所述的灯盏花乙素苷元衍生物中加入药学上接受的辅料制备成片剂、胶囊剂、注射液或冻干粉针剂。
本发明所述的灯盏花乙素苷元衍生物的应用为所述的灯盏花乙素苷元衍生物在制备深静脉血栓、肺血栓栓塞、心脑血管疾病、中风和血液凝集疾病药物中的应用。
纤维蛋白原在凝血酶的作用下可以转变为纤维蛋白，凝血酶时间（thrombin time，TT）是反映凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白的时间，常用于检测药物对于外源性凝血系统的影响。在一个具体实施方案中，本发明参照Markwardt的凝血酶滴定方法考察本发明所述化合物对凝血酶时间的影响。结果显示不加药物时，纤维蛋白原与凝血酶作用，约25s发生凝固，加入肝素（Heparin，0.725mg/mL)后，纤维蛋白原与凝血酶作用约40.5s发生凝固。而本发明所述灯盏花乙素苷元衍生物在各浓度（0.725 mg/mL，1.25 mg/mL和2.5mg/mL）均可显著延长纤维蛋白原的凝结时间（p<0.05）。表明本发明所述灯盏花乙素苷元衍生物对于外源性凝血系统的影响显著，具有明显的抗凝血作用。
在本发明的另一具体实施例中，建立凝血因子十（FXa）抑制剂活性检测的反应体系，根据凝血因子十（FXa）水解底物的荧光基团产生荧光，来检测化合物对凝血因子十（FXa）的抑制活性。结果显示KPC-4000001号化合物（灯盏花乙素苷元衍生物）的IC50值为0.14uM，KPC-4000002号化合物（灯盏花乙素苷元衍生物）的IC50值为0.21uM，KPC-4000003号化合物（灯盏花乙素苷元衍生物）的IC50值为0.15uM，KPC-4000004号化合物（灯盏花乙素苷元衍生物）的IC50值为0.19uM，KPC-4000005号化合物（灯盏花乙素苷元衍生物）的IC50值为0.36uM，利伐沙班的IC50值为0.23nM。表明本发明所述化合物（灯盏花乙素苷元衍生物）对凝血因子十（FXa）具有明显的抑制作用。
综上所述，本发明所述的灯盏花乙素苷元衍生物具有明显的抗凝血的作用，可用于作为潜在的先导化合物，在制备治疗深静脉血栓和肺血栓栓塞、心脑血管疾病、中风和其他与血液凝集相关的疾病的药物中运用。
本发明所述的化合物（灯盏花乙素苷元衍生物）可以和常规的辅料组合制成治疗深静脉血栓和肺血栓栓塞、心脑血管疾病、中风和其他与血液凝集相关的疾病的药物，包括口服液、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、胶囊剂和滴丸剂等。
本发明还提供了一种药物制剂，包括治疗有效量的本发明所述化合物（灯盏花乙素苷元衍生物）和药学上可接受的辅料。本领域技术人员可将所述化合物（灯盏花乙素苷元衍生物）直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成常用制剂如片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。其中，填充剂如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解剂如琼脂，碳酸钙，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，低取代羟丙基纤维素；润滑剂如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂硫酸钠；粘合剂如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯胶。
本发明所述的化合物（灯盏花乙素苷元衍生物）是全新结构的化合物，具有明显的抗凝血作用，可用于作为潜在的先导化合物，在制备治疗深静脉血栓和肺血栓栓塞、心脑血管疾病、中风和其他与血液凝集相关的疾病的药物中运用。本发明所述的灯盏花乙素苷元衍生物的制备方法简单易行，重现性好，环境污染小，可用于灯盏花乙素苷元衍生物的大量制备。
下面以具体实施案例对本发明作进一步说明：
实施例1 KPC-4000001的制备
在一反应瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物8(186.0 mg, 1.33 mmol),碳酸钠(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)钯(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六环(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置换氮气。反应在100 ℃下进行5小时，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)显示反应完全，将反应液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有机层，用10 mL饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干得到粗产品用柱层析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)纯化，得到白色固体200 mg，收率：55%。1H NMR : 7.87 (dd, J = 5.3, 8.8 Hz, 2 H), 7.19 (t, J = 8.6 Hz, 2 H), (400MHz , CDCl3) 6.80 (s, 1 H), 6.62 (s, 1 H), 3.98 (s, 3 H), 3.97 (s, 3 H), 3.91 (s, 3 H)
实施例2 KPC-4000002的制备
在一反应瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物9(186.0 mg, 1.33 mmol),碳酸钠(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)钯(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六环(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置换氮气。反应在100 ℃下进行5小时，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)显示反应完全，将反应液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有机层，用10 mL饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干得到粗产品用柱层析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)纯化，得到白色固体280 mg，收率：76%。1H NMR : 7.65 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.62 - 7.57 (m, 1 H), 7.48 (dt, (400MHz , CDCl3) J =5.9, 8.0 Hz, 1 H), 7.22 (dt, J = 2.4, 8.2 Hz, 1 H), 6.82 (s, 1 H), 6.67 (s, 1 H), 3.99 (s, 6 H), 3.92 (s, 3 H).
实施例3 KPC-4000003的制备
在一反应瓶中加入化合物7(250.0 mg, 0.93 mmol), 化合物10(210.5 mg, 1.11 mmol),碳酸钠(195.8 mg, 1.85 mmol),四(三苯基膦)钯(53.4 mg, 0.046mmol),1,4-二氧六环(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置换氮气。反应在100 ℃下进行5小时，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)显示反应完全，将反应液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有机层，用10 mL饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干得到粗产品用柱层析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)纯化，得到白色固体210 mg，收率：60%。1H NMR (400MHz , CDCl3)：7.99 (d, J = 8.3 Hz, 2 H), 7.76 (d, J = 8.3 Hz, 2 H), 6.83 (s, 1 H), 6.71 (s, 1 H), 3.99 (s, 3 H), 3.99 (s, 3 H), 3.92(s, 3 H)
实施例4 KPC-4000004的制备
在一反应瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物11(198.3 mg, 1.33 mmol),碳酸钠(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)钯(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六环(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置换氮气。反应在100 ℃下进行5小时，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)显示反应完全，将反应液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有机层，用10 mL饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干得到粗产品用柱层析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)纯化，得到白色固体266 mg，收率：62%。1H NMR : 7.96 (d, J = 8.3 Hz, 2 H), 7.74 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.65 (400MHz , CDCl3) (d, J = 7.7 Hz, 2 H), 7.53 - 7.46 (m, 2 H), 7.44 - 7.36 (m,1 H), 6.85 (s, 1 H), 6.73 (s, 1 H), 4.01 (s, 3 H), 4.00 (s, 3 H), 3.93 (s, 3 H)
实施例5 KPC-4000005的制备
在一反应瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物12(163.5 mg, 1.33 mmol),碳酸钠(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)钯(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六环(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置换氮气。反应在100 ℃下进行5小时，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)显示反应完全，将反应液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有机层，用10 mL饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干得到粗产品用柱层析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)纯化，得到白色固体52 mg，收率：15%。1H NMR :8.84 - 8.75 (m, 2 H), 7.77 - 7.70 (m, 2 H), 6.83 (s, 1 H), (400MHz , CDCl3) 6.77 (s, 1 H), 4.00 (s, 3 H), 3.99 (s, 3 H), 3.93 (s, 3 H)
上述实施例1～5制得的化合物见表1：
表1 实施例1-5制得的化合物
实施例6 本发明所述化合物对凝血酶时间的影响
凝血酶时间是反映凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白的实验，本发明所述化合物对凝血酶时间影响的测定参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行。具体方法为于酶标板小孔中加入200μL，0.5%人纤维蛋白原，再加入1μL样品液，充分混匀。用微量进样器吸取5μL凝血酶溶液（100U/mL）迅速混匀并计时，记录纤维蛋白原发生凝固的时间，结果见表2：
表2 对凝血酶时间（TT）的影响
注：所有结果均为3次试验结果的平均值
由表2结果可见，不加药物时，纤维蛋白原与凝血酶作用，约25s发生凝固，加入肝素（Heparin，0.725mg/mL)后，纤维蛋白原与凝血酶作用约40.5s发生凝固。而本发明所述化合物在各浓度（0.725 mg/mL，1.25 mg/mL和2.5mg/mL）均可显著延长纤维蛋白原的凝结时间（p<0.05）。
实施例7 本发明所述化合物对凝血因子十（FXa）的影响
实验试剂：成套pH校准缓冲剂，上海市爱建试剂厂出品，批号920515；Tris-base，Purity≥99.9%，Amresco产品，Exp2012/12；浓HCl，云南汕滇药业有限公司，批号20090420；NaOH，云南汕滇药业有限公司，批号20091001；二甲基亚砜（DMSO）：天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20110816；KH2PO4 ，汕头市达豪精细化学品有限公司，批号20090304；K2PO4.3H2O，天津市风帆化学试剂科技有限公司，批号0100722；KOH，云南杨林工业开发区汕滇药业股份有限公司，批号20110223； Xa因子Factor X Activated，Sigma，F9302－50UG；FXa荧光底物，hyphen biomed公司合成；利伐沙班原料；纯化水，现取现用，存放不超过3d。
实验设备：HS-25型pH计，上海雷磁科学仪器厂；超声波清洗器，SK8200H，上海科导超声仪器有限公司；SYNERGY HT酶标仪，BioTek；0.5～10单道微量移液器，Finnpipette；0.5～10ul单道微量电子移液器， 10～100ul单道微量移液器，10～300单道微量电子移液器，50～1000单道微量电子移液Eppendorf。
供试品按以下方法配制：
KPC-4000001号化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀释，对应的体系终浓度为10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000002号化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀释，对应的体系终浓度为10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000003号化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀释，对应的体系终浓度为10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000004号化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀释，对应的体系终浓度为10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000005号化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀释，对应的体系终浓度为10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
利伐沙班用DMSO配制成1uM，之后3倍稀释，对应的体系终浓度为10nM、3.33nM、1.11nM、0.37nM、0.12nM、0.041nM、0.0137nM、0.0045nM。
取上述配制好的供试品1ul加入至100ul反应体系中（PH7.8，去离子水、0.2mM的荧光底物、1M的Tris-HCl加1.6M的NaCl缓冲液），室温孵育10min，再加入0.25mg/L的FXa，调节酶标仪激发光为342nM，发射光440nM，反应5min（时间间隔为60s），测定荧光强度，以利伐沙班作为阳性对照，不加FXa的作为阴性对照，计算抑制率。用抑制率对供试品浓度的对数做图，得到KPC-4000001号化合物的IC50值为0.14uM，KPC-4000002号化合物的IC50值为0.21uM，KPC-4000003号化合物的IC50值为0.15uM，KPC-4000004号化合物的IC50值为0.19uM，KPC-4000005号化合物的IC50值为0.36uM，利伐沙班的IC50值为0.23nM。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。