一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法与流程

文档序号:11838197阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法,其特征在于:首先,利用酵母将N15无机盐转化成生物蛋白,当酵母培养代数达到6代以上,其提取蛋白98%以上都是N15的蛋白,然后再将酵母中提取高纯度N15蛋白转化成N15酵母蛋白胨,利用N15蛋白胨取代常规的N14蛋白胨,用于培养多种生物,为生物蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记;其包括以下步骤:

1)使用只含N15的无机培养基对酵母菌进行培养;

2)酵母细胞的裂解;

3)N15酵母蛋白的粗提;

4)N15生物培养基的配制,即是将步骤3)中粗提后产生的N15蛋白胨作为培养基的基本原料,取代常规的N14蛋白胨用于培养,再加入不含N的无机盐物质,制成最终的N15生物培养基。

2.根据权利要求1所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法,其特征在于:在步骤1)中,酵母将培养基中的N15无机盐转化成生物蛋白,当酵母培养代数达到6代以上,其提取蛋白98%以上都是N15的蛋白,而实际操作中根据最终配制的生物培养基选择不同的酵母菌和只含N15的无机培养基配方。

3.根据权利要求1所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法,其特征在于:在步骤2)中,酵母细胞的裂解具体是采用玻璃珠破碎法或液氮研磨法。

4.根据权利要求1所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法,其特征在于:在步骤3)中,N15酵母蛋白的粗提即是提取步骤2)中裂解的酵母细胞中的蛋白,蛋白质中氨基酸的N元素均为N15,而N15酵母蛋白的粗提具体是采用蛋白质半水解法或酵母自溶法。

5.根据权利要求1所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法,其特征在于:在步骤4)中,依据情况配制N15细菌培养基、N15真菌培养基、N15植物培养基或N15藻类培养基,最终制备的培养基中N元素全部来源于步骤3)中粗提后蛋白胨的N15,利用N15蛋白胨取代常规的N14蛋白胨用于培养生物,为生物蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记,而无机盐和培养基的具体制作条件要根据不同生物的生长特征而定。

6.根据权利要求3所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法,其特征在于:

采用玻璃珠破碎法时,步骤如下:

1)挑取酵母菌单菌落在液体YPD培养基中,放入摇床27-33℃,190-210rpm培养1-3天;

2)按1%-3%的接种量取发酵液,6000-8000rpm,4-6min离心,取上清,0.6%-0.10%Nacl溶液洗涤俩次,接种于基础盐培养基中,27-33℃,190-210rpm,摇5-7天;

3)将发酵好的发酵液离心7000-9000rpm,9-11min,去上清,蒸馏水洗涤俩次,加入1-3mL的裂解缓冲液,然后加入等体积的灭过菌的酸化玻璃珠,漩涡震荡1-3min,冰浴1-3min,18-26次;

4)2700-3000rpm,9-11min离心,分为两个部分:上清液和沉淀物,沉淀物放入研钵,加入酸化后的石英砂或玻璃珠及液氮研磨,研磨后加入4.5-7.5mol/L的Hcl溶液,混匀,300-700rpm离心,去除石英砂及玻璃珠;上清液加入具塞试管中,加入等体积的HCl,约为4.5-7.5mol/L的HCl溶液;

采用液氮研磨法时,步骤如下:

1)挑取酵母菌单菌落在液体YPD培养基中,放入摇床27-33℃,190-210rpm培养1-3天;

2)按1%-3%的接种量取发酵液,6000-8000rpm,4-6min离心,取上清,0.6%-1.0%Nacl溶液洗涤两次,接种于N15基础盐培养基中,27-33℃,150-250rpm,摇床培养4-8天;

3)3500-5000rpm,离心25-35min,用0.3%-0.7%的Na2CO3溶液对酵母菌洗涤两次脱嗅;

4)破壁:离心收菌体,称湿重,用TGE buffer悬浮菌体,重量(g):buffer体积(毫升)=1:1—1:2;用注射器将菌液加入液氮中,控制加入速度,使得菌液进入液氮中后形成小颗粒,将菌体液氮颗粒转入高速打碎器,约2-3万转/分破碎1分钟,菌体颗粒应该成粉末状;倒出粉末,水浴融化后,再用注射器加入液氮中,重复上述步骤,重复3次;高速离心收上清,上清中含目标蛋白。

7.根据权利要求4所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法,其特征在于:

采用蛋白质半水解法时,步骤如下:

1)把5-7mol/L的Hcl溶液装入具塞玻璃管后,加入液氮,试管中的空气,密封后放入约110℃的烘箱,酸解8-10个小时;

2)酸解后取出,用氢氧化钠溶液调pH;

3)放入80-90℃的烘箱干燥,1-2h烘干,获取N15蛋白胨,其物质分子量大概在600-300Da的肽段;

采用酵母自溶法时,步骤如下:

1)自溶:加0.5%-1.5%Nacl溶液搅拌,配制成质量分数为10%-15%的酵母悬液,调节pH5.5-6.5,温度40-55℃,调节时间24-28h;

2)灭酶活,温度80-90℃,0.5-1h;

3)离心,3500-5000rpm,25-35min,去沉淀;

4)真空浓缩,真空度0.09-0.093MPa,温度50-60℃。

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