本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种重组α-L-鼠李糖苷酶的粗提液直接在微通道反应器中催化定向水解黄酮苷的方法和应用。
背景技术：
黄酮类化合物是植物多酚的一个亚群，是植物重要的一类次级代谢产物，广泛存在于水果、蔬菜、豆类及茶叶等许多食源性植物中。然而，天然黄酮类化合物大部分以黄酮苷的形式存在。由于黄酮苷类脂溶性较差，限制了其生物活性的发挥，且部分黄酮苷类丧失其苷元的特性。因此，可通过定向水解柚皮苷、芦丁、槲皮苷、橘皮苷等黄酮苷而释放出鼠李糖以发挥其特定的生物学功能。如：可用于降低芸香科水果果汁的苦味，能够水解葡萄中的键合态芳香物质而释放芳香物质，可用于改进传统的鼠李糖生产工艺等(Process Biochemistry.2010,45(8):1226-1235)。
根据以往的研究报道，定向水解黄酮苷的常用方法为酸解法(Food Ferment Ind,2014，20:236-238)和酶解法(CN1685053A)。酸解法一般工艺较为复杂、试剂难以去除且容易污染环境，而酶解法由于条件温和、选择性高而备受推崇。在酶解黄酮苷的过程中，最常用的催化剂是α-L-鼠李糖苷酶，不同来源的α-L-鼠李糖苷酶水解位点各不相同，分别可以催化水解α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6及α1连接的不同糖苷键，因此它能够广泛运用于黄酮苷的水解(Process Biochemistry,2010,45(8):1226-1235；中国酿造,2010(10):11-15)。目前，α-L-鼠李糖苷酶的应用主要分为游离酶、固定化酶和全细胞催化剂等形式。如Visser等使用阴离子交换色谱法分离纯化来源于黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶(FEMS Microbiology Letters,1997.157(2):279-283),Yadav等使用超滤、阳离子交换柱层析法分离纯化来源于青霉菌的α-L-鼠李糖苷酶(Process Biochemistry,2013.48(9):1348-1354)，总体上这些分离纯化过程成本高、难度大，导致酶制剂产品的市场价格极其昂贵，商业化程度不高；固定化的α-L-鼠李糖苷酶常常由于受到固定位点的限制，使其催化效率下降(J Appl Polym Sci,1999,72(10):1367)；而全细胞催化剂通常会发生絮凝使其传质受阻而降低其催化效率。本课题组前期研究发现，与常规反应器相比，在微通道反应器中水解黄酮苷，可以使催化定向水解的时间由原来的6h降低到40min，同时能有效提高产物得率(J.Serb.Chem.Soc.2015,80(7):853–866)，但α-L-鼠李糖苷酶在微反应器中由于蛋白聚集而表现为容易堵塞，限制了其实际应用。因此，如果能寻找合适的方法，不仅使得重组α-L-鼠李糖苷酶容易获得，还可以避免游离酶在微反应器中的富集和堵塞，对于酶催化定向水解黄酮苷将具有广阔的市场前景。
因此，本发明一种直接利用重组α-L-鼠李糖苷酶粗提液在微通道反应器中催化定向水解黄酮苷的方法。本发明将超声破碎的方法提取重组大肠杆菌中α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液，直接与黄酮苷在微通道反应器中充分接触，添加适当的表面活性剂建立共溶剂反应体系，以防止α-L-鼠李糖苷酶在微通道内的富集引起的堵塞。这不仅省掉了酶和产物的分离纯化步骤，使得操作简单方便，同时便于酶的回收利用。更重要的是，该方法能够有效提高催化效率，获得具有生理活性的单一产物，无副产物生成，显著降低生产成本。
技术实现要素：
解决的技术问题：本发明主要克服现有技术中存在的α-L-鼠李糖苷酶分离纯化成本高及其在微反应器中容易聚集和堵塞等技术难题，提供一种直接利用重组α-L-鼠李糖苷酶粗提液在微通道反应器中定向水解黄酮苷，并按照比例添加适当的表面活性剂建立共溶剂反应体系的方法。还涉及α-L-鼠李糖苷酶基因rhaA和rhaB及包含该基因的载体和菌株，本发明将表达的α-L-鼠李糖苷酶粗提液直接用于在微反应器中将芦丁专一的水解生成具有生理活性的异槲皮苷，其转化产物纯度高，易分离，无副产物，同时解决了α-L-鼠李糖苷酶在微通道内富集导致的堵塞问题。
技术方案：重组α-L-鼠李糖苷酶粗提液用于微通道反应器中催化定向水解黄酮苷的方法，步骤为将表达的RhaA和RhaB型α-L-鼠李糖苷酶超声提取粗酶液直接用于微通道反应器内水解黄酮苷，并在微反应器中加入表面活性剂建立共溶剂体系，以大大提高催化效率。
分别构建rhaA型和rhaB型的表达α-L-鼠李糖苷酶的重组工程菌；所述的工程菌的质粒载体为pET21a；所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)；所述的重组工程菌的培养方法为：接种到50μg/mL氨苄青霉素钠盐的LB液体培养基中生长到指数期，然后经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达；所述的IPTG浓度为200～800μM；所述的生长温度为22～37℃；所述的诱导温度为17～25℃；所述的诱导时间为12～20h。
由所述重组工程菌制备α-L-鼠李糖苷酶的方法为超声破碎法，所述的超声缓冲液分别为：pH7.0PBS，pH8.01.0M Tris-HCl和pH8.01×LEW buffer：含有50mM NaH2PO4和300mM NaCl，所述的超声波功率为0.2～1.0kW，所述的超声时间为6～36min，然后12000rpm离心30min，收集上清为粗酶液。
所述黄酮苷溶解于缓冲液中，所述的缓冲液为pH4.5的NaOAc、pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、pH5.5～6.5的MES缓冲液和pH6.5～7.5的PBS缓冲液；表面活性剂浓度为2wt.％～15wt.％；底物浓度为0.02～0.2g/L；反应温度为30～70℃；流速为1～20μL/min。
所述的表面活性剂分别为阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或离子液体；所述的离子液体分别为[Bmim]Tf2N,[Nmim]HSO4,[Emim]BF4,[Emim]OTF,[Emim]PF6,[Bmim]BF4,[Bmim]PF6,[Hmim]HSO4,[Omim]BF4,[BMPY]C4F9SO3,[Toma]Tf2N,[Toma]TF3,[Toma]PF6,[ChCl]Urea,[TCMAC]或[Hmim]Cl。
所述黄酮苷为芦丁或柚皮苷。
有益效果：本发明首先构建表达α-L-鼠李糖苷酶的rhaA和rhaB型基因文库；所述的表达质粒分别将rhaA和rhaB型基因插入初始载体pET21a中，构建了表达载体pET21a-rhaA和pET21a-rhaB，并将它导入E.coli BL21(DE3)中，获得E.coli BL21(DE3)-pET21a-rhaA和E.coli BL21(DE3)-pET21a-rhaB。上述菌株经诱导培养后，RhaA和RhaB蛋白成功地在E.coli中表达，然后采用超声破碎方法制备的α-L-鼠李糖苷酶酶活为24.23U/mg。提取的粗酶液直接与底物芦丁在微通道反应器中充分接触，按照比例适当添加表面活性剂建立共溶剂体系，将芦丁转化为单一产物异槲皮苷，产物得率高达99.5±4.8％，将反应时间由原来的10h减少到10min，大大提高了催化效率。采用重组α-L-鼠李糖苷酶既具有可靠的生物安全性，又能够提高α-L-鼠李糖苷酶的催化效率，同时获得具有生理活性的单一产物，无副产物产生。此外，表面活性剂的添加有效解决了酶在微反应器内富集所导致的堵塞问题。
附图说明
图1为本发明重组E.coli BL21(DE3)-pET21a-rha流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明提供一种带有α-L-鼠李糖苷酶的重组菌株，从所述重组菌株中获得α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，所述α-L-鼠李糖苷酶在微反应器中催化水解芦丁生成异槲皮苷的反应体系。
本发明所述的α-L-鼠李糖苷酶基因为rhaA和rhaB型；所述的表达质粒将rhaA和rhaB基因插入初始载体pET21a中，构建了表达载体pET21a-rhaA和pET21a-rhaB，并将它导入E.coli BL21(DE3)中，获得含有表达载体pET21a-rhaA或pET21a-rhaB的大肠杆菌BL21(DE3)-pET21a-rhaA或BL21(DE3)-pET21a-rhaB。上述菌株经诱导培养后，RhaA和RhaB蛋白成功的在大肠杆菌中表达，然后采用超声破碎的方法制备RhaA和RhaB，使粗酶液直接与底物芦丁在微通道反应器中充分接触将其转化为单一产物异槲皮苷，并按照比例添加适当的表面活性剂建立共溶剂体系以解决酶在微通道内富集所导致的堵塞问题。
实施例1构建表达α-L-鼠李糖苷酶重组E.coli BL21(DE3)-pET21a-rhaA
将已获得的目的基因rhaA用BamHI和EcoRI进行双酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段pET21a进行连接，将连接产物转染至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并均匀涂布于带有氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆接种到带有氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中培养至OD600值为0.6～0.8，进行菌液提取质粒和PCR验证。挑取经上述验证正确的单菌落，接种于含有氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中(3～5mL)，37℃振荡培养生长至指数期；然后按照2％的接菌量转接到含有氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中(100～500mL)，22～37℃振荡培养至OD600达到0.6～0.8时，然后添加200～800μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)与17～25℃诱导表达12～20h。
实施例2构建表达α-L-鼠李糖苷酶重组E.coli BL21(DE3)-pET21a-rhaB
将已获得的目的基因rhaB用SalI和HindIII进行双酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段pET21a进行连接，将连接产物转染至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并均匀涂布于带有氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆接种到带有氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中培养至OD600值为0.6～0.8，进行菌液提取质粒和PCR验证。挑取经上述验证正确的单菌落，接种于含有氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中(3～5mL)，37℃振荡培养生长至指数期；然后按照2％的接菌量转接到含有氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中(100～500mL)，22～37℃振荡培养至OD600达到0.6～0.8时，然后添加200～800μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)与17～25℃诱导表达12～20h。
实施例3重组α-L-鼠李糖苷酶的制备
将上述诱导表达结束的菌液(1L)在4℃下8000rpm离心5min，收集菌体；用pH7.2～7.4PBS缓冲液清洗菌体两次；然后分别用不同超声缓冲液重悬菌体进行超声。超声缓冲液为：1.0M Tris-HCl(pH8.0，30mL)，超声波功率为0.2kW，超声时间为6min。超声结束后12000rpm离心30min，收集上清即为α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液，测得酶活为15.88U/mg。
实施例4重组α-L-鼠李糖苷酶的制备
将上述诱导表达结束的菌液(1L)在4℃下8000rpm离心5min，收集菌体；用pH7.2～7.4PBS缓冲液清洗菌体两次；然后分别用不同超声缓冲液重悬菌体进行超声。超声缓冲液为：1×LEW buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl(pH8.0，30mL))，超声波功率为1.0kW，超声时间为36min。超声结束后12000rpm离心30min，收集上清即为α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液，测得酶活为23.57U/mg。
实施例5重组α-L-鼠李糖苷酶的制备
将上述诱导表达结束的菌液(1L)在4℃下8000rpm离心5min，收集菌体；用pH7.2～7.4PBS缓冲液清洗菌体两次；然后分别用不同超声缓冲液重悬菌体进行超声。超声缓冲液为：PBS(pH7.0，30mL)，超声波功率为0.6kW，超声时间为12min。超声结束后12000rpm离心30min，收集上清即为α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液，测得酶活为24.23U/mg。与对照相比，酶活提高了1.3倍。
实施例6重组α-L-鼠李糖苷酶在微反应器中催化定向水解芦丁
以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝5的0.02g/L的芦丁母液。量取上述实施例5制备的粗酶液和0.02g/L芦丁液以等体积分别从两个通道泵入微反应器内，同时在粗酶液中添加4％的吐温80，在30℃条件下充分接触，流速为1μL/min。反应结束后经HPLC检测，产物异槲皮苷的得率为59.2±3.4％。
实施例7重组α-L-鼠李糖苷酶在微反应器中催化定向水解芦丁
以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝5的0.2g/L的芦丁母液。量取上述实施例5制备的粗酶液和0.2g/L芦丁液以等体积分别从两个通道泵入微反应器内，同时在粗酶液中添加4％的十二烷基硫酸钠，在70℃条件下充分接触，流速为20μL/min。反应结束后经HPLC检测，产物异槲皮苷的得率为7.7±0.9％。
实施例8重组α-L-鼠李糖苷酶在微反应器中催化定向水解芦丁
以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝5的0.02g/L的芦丁母液。量取上述实施例5制备的粗酶液和0.02g/L芦丁液以等体积分别从两个通道泵入微反应器内，同时在粗酶液中添加2％的离子液体[Toma]Tf2N，在35℃条件下充分接触，流速为2μL/min。反应结束后经HPLC检测，产物异槲皮苷的得率为99.5±4.8％。与常规反应相比，反应时间由原来的10h降低到10min，大大提高了时空产率。
实施例9重组α-L-鼠李糖苷酶在微反应器中催化定向水解柚皮苷
以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝5的0.02g/L的柚皮苷母液。量取上述实施例5制备的粗酶液和0.02g/L柚皮苷液以等体积分别从两个通道泵入微反应器内，同时在粗酶液中添加15％的离子液体[Toma]Tf2N，在35℃条件下充分接触，流速为2μL/min。反应结束后经HPLC检测，产物普鲁宁的得率为91.9±5.2％。与常规反应相比，反应时间由原来的10h降低到10min，大大提高了时空产率。