一种寡雄腐霉原生质体的制备和再生方法与复合酶解液与流程

本发明涉及一种微生物原生质体制备和再生方法，具体的说是一种关于生防真菌寡雄腐霉原生质体的制备和再生方法。本发明还涉及一种用于制备寡雄腐霉原生质体的复合酶解液。

技术背景

寡雄腐霉属于卵菌门腐霉科腐霉属，是一种土壤习居型腐生菌，其能够在多种重要的农作物根围定殖，对植物和动物都没有毒性，对环境安全。寡雄腐霉的菌丝可以寄生于病原菌体内，干扰寄主的代谢活动，消耗细胞内的养分，造成病菌死亡，同时，还能合成色胺，色氨酸，吲哚乙酸等生长活性物质，促进植物生理代谢，养分吸收和生长发育。寡雄腐霉不仅对多数致病真菌有很强的寄生或拮抗作用，并且能诱导农作物产生系统抗性，是一种非常有应用价值的生防真菌。对其进行更进一步的研究利用，特别是从分子水平对其进行功能基因、遗传性状改造等研究势在必行。

原生质体是指完整细胞剥除细胞壁结构后所形成的裸露细胞，为球状单细胞，易于摄取外源大分子、细胞器及细菌和病毒，是真菌遗传转化和功能研究的重要工具。制备原生质体可为该类真菌进行分子标记，以及目的基因标记与克隆提供基础实验材料。

真菌具有复杂的细胞壁成分，不同菌种，甚至同一菌种不同菌株的细胞壁成分也有差异，其原生质体制备和再生需要的条件也不一样。有效去除细胞壁的同时还要维持原生质体渗透压平衡，选择适宜的渗透压稳定剂是原生质体成活的保障。高效稳定的再生条件是原生质体恢复生长的唯一途径，现有报道中采用的再生方式几乎都是固体培养再生，可是寡雄腐霉原生质体无法在固体再生培养基中恢复生长，这就需要摸索适宜寡雄腐霉原生质体再生的方法。目前国内外鲜见关于寡雄腐霉原生质体制备方法的报道，要想对这种非常有应用价值的生防真菌寡雄腐霉从分子水平进行进一步研究利用，就需要摸索出一套适用于寡雄腐霉原生质体制备及再生的方法用于后期研究应用。

不同菌株的细胞壁成分差异显著，因而在制备原生质体时用于去除细胞壁的复合酶解液也是千差万别的，目前尚未有寡雄腐霉专用复合酶解液，其余菌株所使用的复合酶解液不能去除寡雄腐霉的细胞壁，因而无法完成寡雄腐霉原生质体的制备。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述问题，提供一种寡雄腐霉原生质体制备及再生的方法，经该方法得到的原生质体可用于从分子水平上进行寡雄腐霉基因功能、基因改造等相关基因遗传转化的研究应用，本发明的第二目的是提供一种寡雄腐霉专用的高效复合酶解液体系，用于酶解寡雄腐霉菌丝孢子混合体。

本发明的内容，一是提供一种优化简便的制备寡雄腐霉原生质体的方法，具体步骤如下：

（1）菌丝体制备：将寡雄腐霉菌丝接种在PDA平板培养基上，26℃，培养3～5d，将平板上的菌丝孢子混合体全部刮下来，用渗透压稳定剂洗涤，离心收集寡雄腐霉菌丝孢子混合体；

（2）原生质体制备：向收集到的寡雄腐霉菌丝孢子混合体中，加入复合酶解液，充分溶解进行酶解，获得寡雄腐霉原生质体；

（3）原生质体纯化：上述获得的寡雄腐霉原生质体与菌丝孢子的混合物，过滤除去未被酶解的菌丝与孢子体；离心收集纯化后的寡雄腐霉原生质体。

作为优选，所述渗透压稳定剂为：0.6～0.8 mol/L甘露醇溶液，25 mmol/L CaCl₂和10 mmol/L Tris-HCl， pH值为7.5。

作为优选，离心收集寡雄腐霉菌丝孢子混合体的条件为：5500rpm，室温离心10min。

作为优选，复合酶解液体系为：针对每1g寡雄腐霉菌丝孢子混合体，复合酶解液的配方为， 0～6mL 1% lysing enzyme，0～6mL 1% cellulase和50～200 U lyticase，且lysing enzyme与cellulase的含量不能同时为0。

作为优选的，复合酶解液酶解寡雄腐霉菌丝孢子混合体的酶解条件为：30℃，80rmp,酶解2～3h。

作为优选的，离心收集纯化寡雄腐霉原生质体的条件为：5500rpm，室温离心10min。

本发明的内容二是提供一种有效的寡雄腐霉原生质体的再生培养途径，具体步骤如下：用前述的渗透压稳定剂洗涤重悬寡雄腐霉原生质体，并将原生质体浓度稀释到10⁸个/mL；将纯化稀释后的寡雄腐霉原生质体在液体再生培养基中26℃，80rpm，液体振荡培养2～4d。

作为优选，液体再生培养基为添加了0.6～0.8 mol/L甘露醇溶液，25 mmol/L CaCl₂和10 mmol/L Tris-HCl的PDB液体培养基，pH值为7.5。

本发明的内容三是提供一种专用高效复合酶解液体系用于酶解寡雄腐霉菌丝孢子混合体，具体的复合酶解液体系为：针对每1g寡雄腐霉菌丝孢子混合体，复合酶解液的配方为， 0～6mL 1% lysing enzyme，0～6mL 1% cellulase和50～200 U lyticase，且lysing enzyme与cellulase的含量不能同时为0。

本发明的有益效果是：（1）本发明提供的原生质体制备方法保证了寡雄腐霉菌体有效破壁且破壁数量多，选用的渗透压稳定剂可以高效的保护原生质体的完好性，优化的纯化条件可以完全地将原生质体沉于管底，原生质体浓度可达10⁹个/mL，并且可以很好地保持原生质体的完好性。（2）本发明所选用的寡雄腐霉原生质体在添加的了渗透压稳定剂的PDB液体培养基中液体振荡培养的再生途径，可以高效地使寡雄腐霉原生质体再生成寡雄腐霉成熟球形菌体，再生率高达到1.25%，稳定性好，并且可以很容易的挑取单克隆菌体。（3）本发明所建立的复合酶解液体系，可以高效的使寡雄腐霉菌壁破裂释放出原生质体，得到的原生质体品质好、数量多，能够满足相关研究要求。

本发明确定了高效简便的寡雄腐霉原生质体的制备和再生方法，为寡雄腐霉在分子生物学领域的进一步应用开发提供了基础。本发明提供的高效复合酶解液体系可以作为专用复合酶进行开发推广，市场前景广阔。

附图说明

图1是实施实例中获得的寡雄腐霉原生质体；

图2 是实施实例中寡雄腐霉原生质体活性检测；

图3 是实施实例中寡雄腐霉原生质体再生结果。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明。以下实施实例有助于此领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

以下实验所用活性酶来自：lysing enzyme（Sigma），cellulase（Yakult），lyticase（Tiangen）。

以下实验中使用的培养基配方如下：

PDA：马铃薯200 g/L，切块煮烂，用纱布过滤掉马铃薯残渣，加入葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，用水定容至1L。高压灭菌待用；

PDB：马铃薯200 g/L，切块煮烂，用纱布过滤掉马铃薯残渣，加入葡萄糖20g/L，用水定容至1L。高压灭菌待用。

实施例一 寡雄腐霉原生质体制备及再生。

将寡雄腐霉菌丝圆盘接种在PDA平板培养基上，26℃，培养4d，在超净工作台中，将4个平板上的菌丝孢子混合体用无菌接种环全部刮下来（约1g），置于离心管中；用5mL渗透压稳定溶液（0.8M甘露醇，25mM CaCl₂，10mM Tris-HCl pH7.5）洗涤菌丝孢子混合体，5500rpm，离心10min，重复洗涤离心3次，收集寡雄腐霉菌丝孢子混合体；向上一步收集到的寡雄腐霉菌丝孢子混合体中加入复合酶解液（4mL 1%lysing enzyme + 4mL1%cellulase+ 200U lyticase），充分溶解进行酶解，30℃，80rmp,酶解2h，获得寡雄腐霉原生质体；上述获得的寡雄腐霉原生质体与菌丝孢子残渣混合物，通过4层无菌擦镜纸过滤，除去未被酶解的菌丝与孢子体；将滤液于5500rpm，室温离心10min，收集纯化后的寡雄腐霉原生质体。

向上述获得的寡雄腐霉原生质体中加入2mL渗透压稳定溶液洗涤，5500rpm，室温离心10min，用渗透压稳定溶液重悬原生质体，使浓度达到10⁸个/mL，以备后用；将此原生质体加入到20mL 再生液体培养基中（PDB，0.8M甘露醇，25mM CaCl₂，10mM Tris-HCl），26℃，80rpm，振荡培养2d，可再生出寡雄腐霉球形菌体（直径2～6mm）。将此球形菌体接种在PDA固体平板上，26℃，可生长为寡雄腐霉菌丝体，生长3d菌体可铺满平板。

本实施实例中获得的寡雄腐霉原生质体浓度可达10⁹个/mL，原生质体再生率为1.25 %。通过本实例获得的寡雄腐霉原生质体数量多、品质好，能够满足后续的遗传转化，基因改良等研究需要。

实施例二 复合酶解液成分测定实验。

按照实施例一中所述方法，lysing enzyme，cellulase ，lyticase不同配比对寡雄腐霉菌丝孢子混合体进行酶解，收集原生质体，测定原生质体浓度，并进行原生质体再生实验，测定原生质体再生率，根据实验结果确定最佳复合酶解液成分，实验结果如下表所示。

通过实验可见，单独使用lysing enzyme、cellulase或lyticase其中的一种酶（如⑴～⑶），或者在没有lyticase的参与下（如⑷）对寡雄腐霉菌丝体进行酶裂解，均无法使寡雄腐霉释放出原生质体。当1g菌丝体中加入的lyticase的活性超过200U时（如⑿），会破坏原生质体的活性使再生率降低。本发明所确定的得到寡雄腐霉原生质体所需的复合酶解液体系为（1g菌丝体）：0～6mL 1% lysing enzyme，0～6mL 1% cellulase和50～200 U lyticas，且lysing enzyme与cellulase的含量不能同时为0。

实施例三 复合酶解液酶解时间测定实验。

采用实施例二中确定的复合酶解液，即4mL 1%lysing enzyme + 4mL1%cellulase+ 200U lyticase，分别酶解寡雄腐霉菌丝孢子混合体1h、1.5h、 2h、2.5h、3h、4h、5h和 过夜，其余方法同实施例一，观察原生质体制备情况。

实验结果显示，酶解1h、1.5h后，未被酶解的菌体较多，释放出的原生质体较少；酶解4h、5h后得到的原生质体有酶解过度破裂现象，后期再生情况不好；过夜酶解后，原生质体全部被酶解为碎片残渣；酶解2-3h，可获得数量较多、活性较高的寡雄腐霉原生质体。

实施例四 渗透压稳定剂成分测定实验。

按照实施例一中所述方法，采用不同种、不同浓度的渗透压稳定剂进行寡雄腐霉原生质体制备和再生，测定原生质体再生率，根据实验结果确定最佳渗透压稳定剂成分，实验结果如下表所示。

由实验结果可见，选用⑴～⑷组渗透压稳定剂可再生成功，其中以⑵组最好，故制备寡雄腐霉原生质体的渗透稳定剂优选为0.6～0.8 mol/L甘露醇溶液，25 mmol/L CaCl₂和10 mmol/L Tris-HCl。

实施例五 寡雄腐霉原生质体再生途径测定实验。

实验方法同实施例一，所有再生培养基中均添加0.8M甘露醇，25mM CaCl₂和10mM Tris-HCl），仅培养方式采用⑴ 固体涂板；⑵ 固体包埋；⑶ 固液双层；⑷ 液体振荡培养。

实验结果表明，⑴～⑶组再生方式均无法再生成功，采用⑷组作为寡雄腐霉原生质体再生方式，可以很好维持原生质体渗透压，提供原生质体再生的有利条件，继而再生为寡雄腐霉成熟菌体。在液体再生培养基中寡雄腐霉原生质体再生为单个的球形菌体，方便基因转化后的单克隆转化子挑选，简化筛选流程。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实例方式，本领域技术人员可在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。