一种锰过氧化物酶MNP‑1及其基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种锰过氧化物酶MNP-1及其基因和应用。

背景技术：

随着染料生产与印染工业的发展，其生产的废水已成为当前最主要的水体污染源之一。在染料的生产和使用中约有10％-15％的染料被释放到环境中，由于染料结构复杂、稳定性强，难以被有效降解，造成了严重的环境污染问题。因此亟待寻找高效环保的染料降解或处理染料废水的方法。

目前染料废水处理方法包括物理法、化学法和生物法。尽管物理化学法处理染料废水研究趋于成熟且广泛应用于实际当中，但是这些处理方法仍然存在许多不足之处，如成本高、效率低、二次污染和适用范围窄等。相对而言，生物降解法具备经济、安全、高效和无二次污染的特性，其应用前景广阔。

到目前为止，最能有效破坏合成染料的微生物是白腐真菌。大量研究证明，白腐真菌胞外木质素降解酶系不仅能去除复杂的高分子木质素聚合物，还能够高效降解异生物质污染物，因此木质素降解酶系的生物催化作用在环保领域具有巨大的潜在应用价值。其中，锰过氧化物酶是一种依赖于过氧化氢的亚铁血红素糖蛋白，是一种常见的木质素降解过氧化物酶，广泛存在于白腐菌中。

锰过氧化物酶的降解机制如下，以二价锰离子为电子供体，在过氧化氢和二羧酸螯合剂存在的条件下，氧化二价锰离子成具有高度活性的三价锰离子，三价的锰离子与二羧酸螯合剂形成稳定的高氧化还原电势的复合物，进而氧化降解木质素或异生物质污染物。此外，由于三价锰离子-有机酸复合物作用底物的广泛性，锰过氧化物酶能被应用于生物修复、生物能源、纺织、造纸和食品工业等多个领域。

目前为止，仅从白腐真菌中分离得到的几十种锰过氧化物酶、且产量较低严重阻碍了大规模应用。因此，如何大量获取锰过氧化物酶，开发基因工程菌，具有十分重要的工业价值。

本发明从乳白耙菌(Irpex lacteus)菌株中得到一个新的锰过氧化物酶基因，通过异源表达、蛋白复性和分离纯化得到锰过氧化物酶，研究其最适pH、温度和底物特异性，并将其应用于不同结构类型的染料脱色中，为进一步将其应用于更多的工业领域提供可靠的理论依据。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能高效应用的锰过氧化物酶。

本发明的再一目的是提供编码上述锰过氧化物酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述锰过氧化物酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述锰过氧化物酶的应用。

本发明从乳白耙菌(Irpex lacteus)中分离得到一种新的锰过氧化物酶MNP-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MAFKTILAFVALATAALAAPSSRVTCSPGRVVSNGACCKWFDVLDDIQENLFDGGVCGEEVHESLRLTFHDAIGFSLSAEREGKFGGGGADGSIMAFAEIETNFHANNGVDEIVEAQRPFAIKHKVSFGDFIQFAGAVGVSNCLGGPRLEFMAGRSNISRAAPDLTVPEPSDSVDKILARMGDAGFSSSEVVDLLISHTVAAQDHVDPTIPGTPFDSTPSEFDPQFFVETLLKGTLFPGNGSNVGELQSPLRGEFRLQSDALLARDPRTACEWQSFVNNQRLMVTKFEAVMSKLAVLGHNPRDLVDCSEVIPVPPRAKTNVAVLPAGKTRADVQAACAATPFPTLQTAPGPATSIVPV

其中，该酶基因编码358个氨基酸，N端18个氨基酸为其信号肽序列“MAFKTILAFVALATAALA”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的锰过氧化物酶MNP-1的理论分子量为36.1kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

APSSRVTCSPGRVVSNGACCKWFDVLDDIQENLFDGGVCGEEVHESLRLTFHDAIGFSLSAEREGKFGGGGADGSIMAFAEIETNFHANNGVDEIVEAQRPFAIKHKVSFGDFIQFAGAVGVSNCLGGPRLEFMAGRSNISRAAPDLTVPEPSDSVDKILARMGDAGFSSSEVVDLLISHTVAAQDHVDPTIPGTPFDSTPSEFDPQFFVETLLKGTLFPGNGSNVGELQSPLRGEFRLQSDALLARDPRTACEWQSFVNNQRLMVTKFEAVMSKLAVLGHNPRDLVDCSEVIPVPPRAKTNVAVLPAGKTRADVQAACAATPFPTLQTAPGPATSIVPV

本发明提供了编码上述锰过氧化物酶MNP-1。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

atggctttcaagactatccttgccttcgttgctctcgccacagctgctcttgcggcaccctcttctagagtgacatgcagtccgggacgtgttgttagcaacggagctgtaagcaattctcgacaccgtcctaccaattataacgtctaatggccgtcgtactagtgctgcaagtggttcgacgttctcgacgacatccaggagaacctgtatgtccttcccgttgctcagtgaaccttgtcgccgctgattccatcacaggtttgacggcggtgtatgtggcgaagaagttcacgaggtaagtaacgattacagcaggtagttgatgcatactaacagttgctctttgcagtcgcttcgtgtaagtgactctcagaatgaacgtggtgaacgcatattgacatgtgccttccattgccaagctcactttccacgacgcgtaagtgtctgttgtcactattcttgcttcttgtgctgatcctgtctgtatagtattggctttagtctctctgctgagcgcgagggcaagtttgggttcgtacttcaacttcacaatgtccctttttgatgattcacatccgcctatagtggtggaggagctgatggctctatcatggcattcgccgagattgagaccaacttccgtgcgtaaacctgggcctttgttgagtgcttatattaaactctgaagcagatgcaaacaatggtgtcgacgaaattgtcgaggcggtatgtctcttcatgtgtccatttttcgagtcacctcactgatccatcatgtatagcaacgcccattcgctatcaagcacaaagtctccttcggcgacttcatccaatttgcaggggcagtcggtgtgtcgaattgccttggtggcccccgtctcgagttcatggctggtcgttccaacatctctcgcgctgctcccgacctcactgttcctgagccctctgactcagttgacaagatcttggcccgcatgggcgatgctggcttttcctcttcggaagttgtggaccttctcatttcccacaccgttgcagctcaagaccacgttgatcccaccatccccgtgagccactctggtaatcaggcatattattgagcaatactcatcacgacatctacagggaacaccttttgactccaccccctccgaattcgatcctcagttcttcgtagaggtaagctttgaccacgtcatcgtcaagcgaagcgacttaagggtctttttacagactctcttgaagggcactctgttccctggtaacggttccaatgtcggcgaacttcagtccccccttagaggagagttccgtcttcaatccgacgctctccttgctcgtgaccccaggaccgcctgtgaatggcaatctttcgttagtgagtatcctcttcactttcatgtcgagactctataattgatgcacccgcctgtcagacaaccaacgtctcatggtcaccaagttcgaggccgtcatgtccaagcttgctgtcctcggccacaacccgcgtgatctcgtcgactgctcggaagtcatccccgtgcctccacgtgccaagaccaatgtcgcagttctccccgctggcaagactcgcgctgatgtccaggctgcttgcgctgctacacccttcccaaccctccagaccgcccctggccccgccacctccatcgttcctgtgtaa

本发明通过PCR的方法分离克隆了锰过氧化物酶基因MNP-1，DNA全序列分析结果表明，锰过氧化物酶MNP-1基因组MNP-1全长1684bp，编码基因序列全长1077bp。其中，信号肽的碱基序列为：

ATGGCTTTCAAGACTATCCTTGCCTTCGTTGCTCTCGCCACAGCTGCTCTTGCG(SEQ ID NO.6)。

成熟的锰过氧化物酶MNP-1的cDNA(去信号肽)序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5

gcaccctcttctagagtgacatgcagtccgggacgtgttgttagcaacggagcttgctgcaagtggttcgacgttctcgacgacatccaggagaacctgtttgacggcggtgtatgtggcgaagaagttcacgagtcgcttcgtctcactttccacgacgctattggctttagtctctctgctgagcgcgagggcaagtttggtggtggaggagctgatggctctatcatggcattcgccgagattgagaccaacttccatgcaaacaatggtgtcgacgaaattgtcgaggcgcaacgcccattcgctatcaagcacaaagtctccttcggcgacttcatccaatttgcaggggcagtcggtgtgtcgaattgccttggtggcccccgtctcgagttcatggctggtcgttccaacatctctcgcgctgctcccgacctcactgttcctgagccctctgactcagttgacaagatcttggcccgcatgggcgatgctggcttttcctcttcggaagttgtggaccttctcatttcccacaccgttgcagctcaagaccacgttgatcccaccatccccggaacaccttttgactccaccccctccgaattcgatcctcagttcttcgtagagactctcttgaagggcactctgttccctggtaacggttccaatgtcggcgaacttcagtccccccttagaggagagttccgtcttcaatccgacgctctccttgctcgtgaccccaggaccgcctgtgaatggcaatctttcgttaacaaccaacgtctcatggtcaccaagttcgaggccgtcatgtccaagcttgctgtcctcggccacaacccgcgtgatctcgtcgactgctcggaagtcatccccgtgcctccacgtgccaagaccaatgtcgcagttctccccgctggcaagactcgcgctgatgtccaggctgcttgcgctgctacacccttcccaaccctccagaccgcccctggccccgccacctccatcgttcctgtgtaa

成熟蛋白理论分子量为36.1kDa，MNP-1是一种新的锰过氧化物酶。

本发明还提供了包含上述锰过氧化物酶基因MNP-1的重组载体，优选为pET28a-MNP-1。将本发明的锰过氧化物酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的锰过氧化物酶基因插入到质粒pPET28a上的BamHI和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pET28a-MNP-1。

本发明还提供了包含上述锰过氧化物酶基因MNP-1的重组菌株，优选为重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/MNP-1。

本发明还提供了一种制备锰过氧化物酶MNP-1的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组锰过氧化物酶表达；以及

3)复性并纯化所表达的锰过氧化物酶MNP-1。

其中，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞DE3，得到重组菌株DE3/MNP-1。

本发明还提供了上述锰过氧化物酶MNP-1的应用。

附图说明

图1重组锰过氧化物酶的最适pH。

图2重组锰过氧化物酶的pH稳定性。

图3重组锰过氧化物酶的最适温度。

图4重组锰过氧化物酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从(Irpex lacteus)中分离得到一种新的锰过氧化物酶MNP-1。大肠杆菌表达载体pET-28a(+)及菌株BL21(DE3)分别购自于Invitrogen公司和北京全式金生物技术有限公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Invitrogen公司。2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、2,6-二甲氧基苯酚(DMP)、愈创木酚(Guaiacol)、黎芦醇(Veratryl alcohol)、Remazol Brilliant Violet 5R(RBV5R),Reactive Black 5(RB5),Remazol Brilliant Blue R(RBBR),Methyl Green(MG)和Indigo Carmine(IC)购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)Irpex lacteus产酶培养基：20g/L葡萄糖,2.5g/L酵母提取物,1g/L KH₂PO₄,0.05g/L Na₂HPO₄·12H₂O,0.5g/L MgSO₄·7H₂O,0.01g/L CaCl₂,0.01g/L FeSO₄·7H₂O,0.001g/L MnSO₄·H₂O,0.001g/L ZnSO₄·7H₂O,0.002g/L CuSO₄。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1乳白耙菌Irpex lactus锰过氧化物酶编码基因MNP-1的克隆

提取乳白耙菌Irpex lactus总RNA：

收集液体培养5天的菌丝体，在滤纸上压干，液氮中彻底研磨成粉末；将800μl Trizol试剂加入到100mg菌丝中，吹打混匀，室温放置5min；加入200μl氯仿，剧烈振摇15s，室温放置3min，于4℃，12000rpm离心15min；吸取上清，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min，于4℃，12000rpm离心10min；弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤1次，沉淀在空气中干燥5min；加入适量RNase-Free去离子水溶解RNA，NanoDrop微量核酸蛋白测定仪上测定RNA浓度。在1％琼脂糖凝胶或1.5％甲醛变性琼脂糖中电泳鉴定其完整性。

根据锰过氧化物酶基因编码序列设计合成了特异性引物P1，P2

P1:5'-CGCGGATCCGCACCCTCTTCTAGAGTGACATGCAGT-3'；

P2:5'-TAAAGCGGCCGCTTACACAGGAACGATGGAGGTGGCG-3'。

以Irpex lacteus总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环后72℃保温10min。得到一约1100bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送睿博生物技术有限公司测序。拼接后MNP-1锰过氧化物酶基因全长1077bp，编码358个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为36.1kDa。

实施例2重组锰过氧化物酶的制备

将表达载体pET-28a(+)进行双酶切(BamHI和NotI)，同时将编码锰过氧化物酶的基因MNP-1双酶切(BamHI和Not I)，切出编码成熟锰过氧化物酶的基因片段与表达载体pET-28a(+)连接，获得含有Irpex lacteus锰过氧化物酶基因MNP-1的重组质粒pET28a-MNP-1并转化大肠杆菌DE3，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/MNP-1。

以同样方法构建包含信号肽序列的重组表达载体，并转化大肠杆菌菌株。

取含有重组质粒的DE3菌株，接种于40mL LB培养液中，37℃250rpm振荡培养12h后，按2％比例转接于300mL LB培养基中，37℃250rpm振荡培养4h(OD₆₀₀达到0.8)，加入终浓度1mM的诱导剂IPTG诱导4h后，离心收集菌体。采取溶菌酶法裂解菌体，8M尿素溶解包涵体蛋白，配制如下复性体系pH 9.5 50mM Tris-HCl buffer,0.5M urea,0.5mM GSSG,0.1mM DTT,10μM hemin,5mM CaCl₂,0.1mg/ml蛋白溶液，于15℃静置复性10小时；复性的锰过氧化物酶经过分离纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。

实施例3重组锰过氧化物酶的活性分析

ABTS法(吸光系数36000M^-1cm^-1)：具体方法如下：在pH4.5，25℃条件下，200μl的反应体系包括20μl适当稀释的酶液、20μl 10mM ABTS、50μl 4mM硫酸锰、50μl 0.4mM过氧化氢启动反应，在420nm处测吸光值，每20s记录一个数据，读数3min。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟氧化1μmol ABTS所需要的酶量。

实施例4重组锰过氧化物酶MNP-1的性质测定

1、重组锰过氧化物酶MNP-1的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例2纯化的重组锰过氧化物酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。在不同pH的0.2mol/L丙二酸-丙二酸钠缓冲液中25℃下进行锰过氧化物糖酶活力测定。结果(图1)表明，重组MNP-1的最适pH为4.0，在pH3.5～4.5有50％以上的相对酶活性。锰过氧化物酶于上述各种不同pH的缓冲液中30℃处理60min，再在pH4.0缓冲液体系中25℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明锰过氧化物酶在pH4.0-6.5之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在60％左右，这说明此酶在酸性偏中性范围内具有较好的pH稳定性。

2、锰过氧化物酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

锰过氧化物酶的最适温度的测定为在丙二酸-丙二酸钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为锰过氧化物糖酶在不同温度下处理不同时间，再在25℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为60℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，在大肠杆菌中表达的锰过氧化物酶MNP-1由于缺少糖基化修饰而降低了蛋白质热稳定性。

3、锰过氧化物酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的ABTS为底物，在丙二酸-丙二酸钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系中，25℃下测定酶活性，计算出其K_m值。经测定，以ABTS为底物时的K_m值为45μM。

4、重组锰过氧化物酶的底物特异性

该酶除可作用于ABTS外，对DMP和Guaiacol也有一定的氧化作用，其对DMP和Guaiacol的氧化能力相对于ABTS分别为93.5％和3.7％。该酶主要依靠氧化二价锰离子，进而螯合三价锰离子的有机酸实现对不同结构类型底物的氧化。

5、重组锰过氧化物酶对不同结构类型的染料降解

分别按50mg/L偶氮染料RBV5R和RB5、蒽醌染料RBBR、靛蓝染料IC、三苯甲烷染料MG、0.2mol/L丙二酸-丙二酸钠缓冲液(pH 5.0)、1mM硫酸锰、0.1mM过氧化氢、0.25U/ml锰过氧化物酶制成染料降解体系，于30℃静置下进行染料脱色处理，并用酶标仪在不同染料的特征波长测定各种染料不同时间的吸光值，计算染料的脱色率(％)。染料脱色率的计算公式如下：染料脱色率(％)＝[(Ai-At)/Ai]*100，其中Ai为染料降解体系溶液的起始吸光值，At为不同时长染料降解体系溶液的吸光值。除双偶氮染料RB5外，单偶氮染料RBV5R、蒽醌染料RBBR、靛蓝染料IC和三苯甲烷染料MG 5h内降解率均达到90％以上。