一种牡丹花中提取野漆树苷的方法及应用与流程

本发明涉及植物提取技术领域，尤其涉及一种牡丹花中提取野漆树苷的方法及应用。

背景技术：

色斑是一种由于皮肤黑色素增加而形成的常见于面部的皮肤疾病，色斑一般呈褐色或黑色。通常色斑形成的原因为遗传因素、内分泌失调、环境污染及紫外线照射等，形成原因比较复杂，但最终的原因均是黑色素的沉积。色斑在形成的过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化为黑色素，随着酪氨酸的不断转化，黑色素的含量逐渐增加并沉积在皮肤表面，最终形成色斑，因此，酪氨酸酶是色斑形成的主要限速酶。酪氨酸的转化速度与酪氨酸酶的活力有关，体内的酪氨酸酶活力越高时，酪氨酸的转化速度越快，黑色素越容易形成，因而，酪氨酸酶活力的大小决定色斑形成的快慢。酪氨酸酶抑制剂能够抑制酪氨酸的转化，因而在化妆品领域内，寻找酪氨酸酶抑制剂是各大化妆品公司重点关注的领域。

随着人们对安全性能要求的提高，具有一定功效的、高安全性的化妆品逐渐受到人们的青睐，因此，从天然物质中寻找具有美白功效的、高安全性的酪氨酸酶抑制剂更是当今世界化妆品工业在淡化色斑领域内的潮流。

野漆树苷(apigenin-7-O-neohesperidoside，即芹菜素-7-O-新橙皮苷)是一种黄酮类成分，具有显著的生物活性，并且具有抗氧化、抗炎、抗菌、保肝及抗肿瘤的作用。野漆树苷主要存在于化橘红、山香圆及凤尾草等植物中，据文献报道，牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)中也含有野漆树苷。牡丹则是原产于我国的一种名贵花卉，具有较高的观赏价值和药用价值。牡丹花由其所具有的观赏价值能够在花期时带来一定的经济效益，但花期过后大量的牡丹花枯萎、衰败，仅有牡丹花的根部作为中药材而带来一定的经济效益。当然也有将牡丹花做成食品类的副业，但由于深加工技术落后，仅有少量的牡丹花被利用，因此，为提高牡丹花的利用率，越来越多的人研究牡丹花的成分及应用。研究最多的则是利用牡丹籽中的牡丹籽精油研制护肤品，然而，大量的牡丹花却被浪费掉，大大降低了牡丹花的利用率，且从牡丹花中提取野漆树苷的方法更是未见报道。

技术实现要素：

本发明提供一种牡丹花中提取野漆树苷的方法及应用，从而实现从牡丹花中提取野漆树苷，本发明提供的方法生产成本低，提取效率高，且对环境无严重污染，适用于大范围的推广与应用。

一种牡丹花中提取野漆树苷的方法，所述方法包括：

摘取牡丹花瓣，洗净、沥干；

将沥干后的所述牡丹花瓣加入到浓度为75％的乙醇溶液中捣烂成浆，得到牡丹花浆液，其中，所述牡丹花瓣与所述乙醇的质量/体积比为1g：2-4ml；

将所述牡丹花浆液加入到浓度为75％的乙醇溶液中加热回流，得到回流液，其中，所述牡丹花浆液与所述乙醇的体积比为1:4-6；

将所述回流液过滤得到牡丹花提取液；

将所述牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发，得到固体物质和乙醇，所述乙醇回收待用；

向所述固体物质中加入蒸馏水，50-70℃下加热溶解，得到混合物，其中，所述固体物质与所述蒸馏水的体积比为1:2-5；

向所述混合物中加入乙酸乙酯进行萃取，收集水相萃取物，其中，所述混合物与所述乙酸乙酯的体积比为1:1-1.5；

将所述水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物；

将所述浓缩物用蒸馏水进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色；

所述下柱液洗脱至无色后，用浓度为40％的乙醇溶液再次对所述浓缩物进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，收集此步骤中的洗脱液，备用；

所述洗脱液合并后浓缩，浓缩后的产物冷却、抽滤结晶，并用无水乙醇洗涤得到结晶化合物；

所述结晶化合物真空低温干燥得到野漆树苷。

优选地，所述加热回流的条件为：加热温度为50-70℃，回流次数为2-3次，每次回流时间为2-4h。

优选地，所述大孔树脂为Amberlite XAD7HP树脂。

优选地，所述洗脱液合并后浓缩为所述洗脱液合并后浓缩至无醇味。

优选地，所述牡丹花瓣为太平红牡丹或丹凤白牡丹的花瓣。

一种野漆树苷的应用，所述野漆树苷按照牡丹花中提取野漆树苷的方法制备，所述野漆树苷用于制备抑制酪氨酸酶活性的药物或化妆品。

一种野漆树苷的应用，所述野漆树苷按照牡丹花中提取野漆树苷的方法制备，所述野漆树苷用于制备防止褐变的食品添加剂。

本发明的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

本发明提供了一种牡丹花中提取野漆树苷的方法，该方法包括：摘取牡丹花瓣，洗净、沥干；将沥干后的所述牡丹花瓣加入到浓度为75％的乙醇溶液中捣烂成浆，得到牡丹花浆液，其中，所述牡丹花瓣与所述乙醇的质量/体积比为1g：2-4ml；将所述牡丹花浆液加入到浓度为75％的乙醇溶液中加热回流，得到回流液，其中，所述牡丹花浆液与所述乙醇的体积比为1:4-6；将所述回流液过滤得到牡丹花提取液；将所述牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发，得到固体物质和乙醇，所述乙醇回收待用；向所述固体物质中加入蒸馏水，50-70℃下加热溶解，得到混合物，其中，所述固体物质与所述蒸馏水的体积比为1:2-5；向所述混合物中加入乙酸乙酯进行萃取，收集水相萃取物，其中，所述混合物与所述乙酸乙酯的体积比为1:1-1.5；将所述水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物；将所述浓缩物用蒸馏水进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色；所述下柱液洗脱至无色后，用浓度为40％的乙醇溶液再次对所述浓缩物进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，收集此步骤中的洗脱液，备用；所述洗脱液合并后浓缩，浓缩后的产物冷却、抽滤结晶，并用无水乙醇洗涤得到结晶化合物；所述结晶化合物真空低温干燥得到野漆树苷。使用本发明提供的牡丹花中提取野漆树苷的方法能够得到纯度较高且提取率较高的野漆树苷，且纯度可达95％以上，提取率可达2.1％以上。在野漆树苷提取的过程中，所使用的药品均为常见药品，生产成本低；同时，乙醇和层析柱中的大孔树脂均可重复使用，不污染环境，进一步降低生产成本，适用于大范围的推广与应用。通过本发明提供的方法所得到的野漆树苷具有比熊果苷更强的活性，能够应用于抑制酪氨酸酶活性的药物或化妆品的制备，也还能够应用于防止褐变的食品添加剂的制备。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的牡丹花中提取野漆树苷的方法流程示意图；

图2为本发明实施例提供的牡丹花中提取的野漆树苷的¹H-NMR(¹Hydrogen-Nuclear magnetic resonance，即氢-核磁共振)图。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。

请参考附图1，附图1示出了本发明实施例提供的牡丹花中提取野漆树苷的方法流程示意图，以下具体实施例的描述均以附图1为基础。

实施例1

S101：摘取盛开后期新鲜的牡丹花瓣，洗净、沥干；

S102：将沥干后的牡丹花瓣加入到浓度为75％的乙醇溶液中室温下捣烂成浆，得到牡丹花浆液，其中，牡丹花瓣与乙醇的质量/体积比为1g：2ml；

S103：将牡丹花浆液加入到浓度为75％的乙醇溶液中加热回流，加热温度为50℃，回流次数为2次，每次回流时间为2h，得到回流液，其中，牡丹花浆液与乙醇的体积比为1:4；

S104：将回流液过滤得到牡丹花提取液；

S105：将牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发旋干乙醇，得到固体物质和乙醇，乙醇回收待用；

S106：向固体物质中加入蒸馏水，50℃下加热溶解，得到混合物，其中，固体物质与蒸馏水的体积比为1:2；

S107：向混合物中加入乙酸乙酯进行萃取，收集水相萃取物，其中，混合物与乙酸乙酯的体积比为1:1；

S108：将水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物；

S109：将浓缩物用蒸馏水进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色；

S110：下柱液洗脱至无色后，用浓度为40％的乙醇溶液再次对浓缩物进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，收集此步骤中的洗脱液，备用；

S111：洗脱液合并后浓缩，浓缩后的产物冷却、抽滤结晶，并用无水乙醇洗涤得到结晶化合物；

S112：结晶化合物真空低温干燥得到野漆树苷。

实施例2

S201：摘取盛开后期新鲜的太平红牡丹花瓣，洗净、沥干；

S202：将沥干后的牡丹花瓣加入到浓度为75％的乙醇溶液中室温下捣烂成浆，得到牡丹花浆液，其中，牡丹花瓣与乙醇的质量/体积比为1g：4ml；

S203：将牡丹花浆液加入到浓度为75％的乙醇溶液中加热回流，加热温度为70℃，回流次数为3次，每次回流时间为4h，得到回流液，其中，牡丹花浆液与乙醇的体积比为1:6；

S204：将回流液过滤得到牡丹花提取液；

S205：将牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发旋干乙醇，得到固体物质和乙醇，乙醇回收待用；

S206：向固体物质中加入蒸馏水，70℃下加热溶解，得到混合物，其中，固体物质与所述蒸馏水的体积比为1:5；

S207：向混合物中加入乙酸乙酯进行萃取，收集水相萃取物，其中，混合物与乙酸乙酯的体积比为1:1.5；

S208：将水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物；

S209：将浓缩物用蒸馏水进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色；

S210：下柱液洗脱至无色后，用浓度为40％的乙醇溶液再次对浓缩物进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，收集此步骤中的洗脱液，备用；

S211：洗脱液合并后浓缩，浓缩后的产物冷却、抽滤结晶，并用无水乙醇洗涤得到结晶化合物；

S212：结晶化合物真空低温干燥得到野漆树苷。

实施例3

S301：摘取盛开后期新鲜的丹凤白牡丹花瓣，洗净、沥干；

S302：将沥干后的牡丹花瓣加入到浓度为75％的乙醇溶液中室温下捣烂成浆，得到牡丹花浆液，其中，牡丹花瓣与乙醇的质量/体积比为1g：3ml；

S303：将牡丹花浆液加入到浓度为75％的乙醇溶液中加热回流，加热温度为60℃，回流次数为3次，每次回流时间为3h，得到回流液，其中，牡丹花浆液与乙醇的体积比为1:5；

S304：将回流液过滤得到牡丹花提取液；

S305：将牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发旋干乙醇，得到固体物质和乙醇，乙醇回收待用；

S306：向固体物质中加入蒸馏水，60℃下加热溶解，得到混合物，其中，固体物质与蒸馏水的体积比为1:4；

S307：向混合物中加入乙酸乙酯进行萃取，收集水相萃取物，其中，混合物与乙酸乙酯的体积比为1:1；

S308：将水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物；

S309：将浓缩物用蒸馏水进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色；

S310：下柱液洗脱至无色后，用浓度为40％的乙醇溶液再次对浓缩物进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，收集此步骤中的洗脱液，备用；

S311：洗脱液合并后浓缩，浓缩后的产物冷却、抽滤结晶，并用无水乙醇洗涤得到结晶化合物；

S312：结晶化合物真空低温干燥得到野漆树苷。

本发明实施例还对由实施例2所提取的野漆树苷进行了¹H-NMR测试，测试结果请参考附图2。对比附图2及现有野漆树苷的NMR图能够得知，本发明实施例提供的方法所提取的物质与野漆树苷相对应，由此表明本发明实施例提供的方法所提取的物质为野漆树苷。

为探究通过本发明实施例提供的从牡丹花中提取野漆树苷的方法所提取的野漆树苷能够抑制酪氨酸酶的活性，本发明实施例提供了野漆树苷与熊果苷对酪氨酸酶活性抑制的评价方法，具体的评价方法为：

将野漆树苷溶解在DMSO(Dimethyl sulfoxide，即二甲基亚砜)中，然后加入摩尔浓度为1/15M、pH值为6.8的PBS(phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液)配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，其中，DMSO与PBS的体积比为1：9。取40μL浓度为0.5mg/mL的上述溶液加入到96孔板中，并加入20μL摩尔浓度为1/15M、pH值为6.8的PBS、40μL浓度为200U/mL的酪氨酸酶和100μL浓度为5mM的底物L-DOPA(Levodopa，L-多巴)形成体外酪氨酸酶活性检测液。由熊果苷配制成的酪氨酸酶活性检测液的配制方法、浓度、各组分添加量均与体外酪氨酸酶活性检测液的相同。

将体外酪氨酸酶活性检测液和由熊果苷配制成的酪氨酸酶活性检测液在37℃的条件下孵育20min，孵育结束后在波长为490nm光下分别测定体外酪氨酸酶活性检测液和由熊果苷配制成的酪氨酸酶活性检测液的吸光度，并计算酪氨酸酶活性的抑制率，计算公式为：

I＝[1-(C-D)/(A-B)]×100％，其中，I为抑制率；A为没有抑制剂(即无野漆树苷或无熊果苷)存在时的吸光度值；B为仅有L-DOPA时的吸光度值；C为酪氨酸酶与L-DOPA在抑制剂(野漆树苷或熊果苷)存在时的吸光度值；D为没有酪氨酸酶存在时的吸光度值。

通过上述公式计算得知，0.5mg/mL的野漆树苷对酪氨酸酶的抑制率为23.5±2.4％，0.5mg/mL的熊果苷对酪氨酸酶的抑制率为16.1±2.1％，由此能够说明，在浓度为0.5mg/mL的条件下，野漆树苷对酪氨酸酶活性的抑制明显大于熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制。

由于熊果苷能够抑制体内酪氨酸酶的活性，因而能够阻止黑色素的生成，进而减少皮肤色素沉积，达到祛除色斑和雀斑的作用，而本发明实施例提供的牡丹花中提取野漆树苷的方法所制备的野漆树苷具有比熊果苷更显著的抑制酪氨酸酶活性的特点，因此，本发明实施例所制备的野漆树苷同样具有阻止黑色素生成、减少皮肤色素沉积的功效。进一步，本发明实施例所制备的野漆树苷能够用于制备抑制酪氨酸酶活性的药物和化妆品，用以达到去除色斑、美白的功效。同时，对于由于产生黑色素而发生褐变的食品，本发明实施例提供的野漆树苷能够用于制备食品添加剂，以便于防止食品发生褐变。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。