本发明涉及一种提高刺葡萄细胞培养物花青素含量的方法。
背景技术：
刺葡萄是葡萄科葡萄属东亚种群的一个野生种。刺葡萄果实紫黑色，营养极为丰富，含有具保健功能的黄酮类化合物(主要是花青素和原花青素)、白黎芦醇、齐墩果酸、鞣质、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和维生素C等天然活性成分。研究表明，刺葡萄果实中富含的花青素和原花青素有很强的清除自由基的能力，具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、保护心血管等方面的功能，尤其是原花青素，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。目前，天然的原花青素还主要来源于松树皮和葡萄籽，随着市场需求的不断扩大，原有的从葡萄、松树皮或其他替代植物中来源的生物活性物质已不能满足需要，必须寻求更多更可靠的材料来源。植物细胞培养是生物技术领域的一个重要分支，具有不受季节影响、生长周期短、产物均一可控、活性物质成分高等优点。因此，解决药用植物资源匮乏和药效成分低的药用植物的有效途径是采用规模化植物细胞培养，以满足需求。要开展刺葡萄细胞培养进行天然产物的生产，亟待解决刺葡萄优良细胞系的筛选、高含量花青素细胞培养物培养技术体系建立等诸多问题。本研究在已建立的刺葡萄松散型细胞系的基础上，通过培养基中细胞分裂素(如KT)浓度的优化，以期大幅度提高刺葡萄细胞中花青素的含量，从而为刺葡萄细胞规模化培养生产天然花青素提供技术支撑。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题，在于提供一种提高刺葡萄细胞培养物花青素含量的方法，不仅能够快速获得大量刺葡萄细胞培养物，且所获得的刺葡萄细胞培养物具有高含量花青素，从而为刺葡萄细胞规模化培养生产天然花青 素奠定了良好的基础。
本发明是这样实现的：
一种提高刺葡萄细胞培养物花青素含量的方法，包括以下步骤：
(1)细胞系的选择与预培养：选取长期继代培养过程中稳定显示紫红色的刺葡萄细胞系，挑取细胞团表层略带部分里层的细胞作为接种的材料；为了使细胞旺盛生长并趋于同步化，需对细胞进行预培养，将前代继代培养20天的细胞，按上述取材方式，挑取细胞团表层略带部分里层的细胞作为接种的材料，将细胞团接种到未添加6-糠氨基嘌呤的培养基中培养20天，作为高含量花青素细胞接种的起始材料；
(2)高含量花青素细胞培养：按(1)步骤所述的取材方式，将(1)步骤中培养所获得的细胞，挑取细胞团表层略带部分里层的细胞作为接种的材料，接种到高含量花青素诱导的培养基中培养，并于温度25±1℃下，先在弱光或黑暗下培养3天，后在光照强度为2500lx的LED灯，每天光照12h的条件下继续培养32天，期间共培养35天，即可获得高花青素含量的刺葡萄细胞培养物。
进一步地，所述(1)步骤中未添加6-糠氨基嘌呤的培养基包括的组分如下：MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L。
进一步地，所述(2)步骤中高含量花青素诱导的培养基包括下述成分：MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、6-糠氨基嘌呤0.05mg/L、蔗糖30g/L和琼脂粉6g/L；其中，各成分的浓度均以高含量花青素诱导的培养基总溶液的体积为基准。
本发明具有如下优点：
本发明不仅能够快速获得大量刺葡萄细胞培养物，且所获得的刺葡萄细胞培养物具有高含量花青素，从而为刺葡萄细胞规模化培养生产天然花青素奠定了良好的基础。
【具体实施方式】
本发明所涉及的一种提高刺葡萄细胞培养物花青素含量的方法，包括以下步骤：
(1)细胞系的选择与预培养：选取长期继代培养过程中稳定显示紫红色的刺葡萄细胞系，挑取细胞团表层略带部分里层的细胞作为接种的材料。为了使细胞旺盛生长并趋于同步化，需对细胞进行预培养，将前代继代培养20天的细胞，按上述取材方式，将细胞接种到未添加6-糠氨基嘌呤(KT)的培养基中培养20天，作为高含量花青素细胞接种的起始材料。
(2)高含量花青素细胞培养：按(1)步骤所述的取材方式，将(1)步骤中培养所获得的材料，将细胞接种到高含量花青素诱导的培养基中培养，并于温度25±1℃，先在弱光或黑暗下培养3天，后在光照强度为2500lx的LED灯，每天光照12h的条件下继续培养32天，期间共培养35天，即可获得高花青素含量的刺葡萄细胞培养物；
所述(1)步骤中未添加KT的培养基包括的组分如下：MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.0mg/L。
所述(2)步骤中高含量花青素诱导的培养基包括下述成分：MS培养基、2,4-D1.0mg/L、KT 0.05mg/L、蔗糖30g/L和琼脂粉6g/L；其中，各成分的浓度均以高含量花青素诱导的培养基总溶液的体积为基准。
所述MS培养基具体包括以下各成分：硝酸铵(NH4NO3)1650mg/L、硝酸钾(KNO3)1900mg/L、氯化钙(CaCl2·2H2O)440mg/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)370mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L、硫酸锰(MnSO4·H2O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.02mg/L、硼酸(H3BO3)6.2、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L、碘化钾(KI)0.83mg/L、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)28.7mg/L、乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B1 0.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L。
实施例1
(1)刺葡萄细胞系的选择与预培养
选取长期继代培养过程中稳定显示紫红色的刺葡萄细胞系，挑取细胞团表层略带部分里层的细胞作为接种的材料。为了使细胞旺盛生长并趋于同步 化，需对细胞进行预培养，具体做法为：将前代继代培养20天的细胞，按上述取材方式，挑取细胞团表层略带部分里层的细胞作为接种的材料，将细胞接种到未添加KT的T0培养基(MS+2,4-D 1.0mg/L)中培养20天，作为高含量花青素细胞接种的起始材料。
(2)高含量花青素刺葡萄细胞的培养
a、培养基
设计6种浓度梯度KT的培养基配方，用于高含量花青素刺葡萄细胞培养的研究，具体配方如下：
T1：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.05mg/L
T2：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.1mg/L
T4：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.5mg/L
T3：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 1.0mg/L
T5：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 1.5mg/L
T6：MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 2.0mg/L
以上培养基均加入蔗糖30g/L、琼脂粉6g/L，pH调整为5.8左右。
b、不同培养天数和不同培养基对刺葡萄细胞花青素含量的影响
将预培养后的细胞，挑取合适大小的细胞团(表层略带部分里层的细胞)作为接种的材料，接种到T1～T6的培养基中培养，并以T0培养基为对照。培养25d后和35d后分别取样，测定细胞培养物中花青素的含量，测定的结果见表1。从培养天数变化来看，随培养天数从25d到35d的增加，花青素含量极显著的升高。从不同培养基来看，培养25d时，在KT浓度为0～2.0mg/L范围内，随KT浓度的增加，刺葡萄细胞中花青素含量呈先增加后降低再增加的趋势，增加和降低的幅度较小，最高出现在T6培养基，为18.52μg·g-1(FW)，其次是T2培养基，为18.18μg·g-1(FW)，第三是T1培养基，为15.44μg·g-1FW)，含量最低是T0培养基，为8.92μg·g-1(FW)，除T4培养基外，其它培养基中培养的刺葡萄细胞中花青素含量均极显著于对照的T0培养基；培养35d时，在KT浓度为0～2.0mg/L范围内，随KT浓度的增加，花青素含量也呈先急剧增加后迅速降低再增加的趋势，花青素含量最 高出现在T1培养基，为66.95μg·g-1(FW)，并极显著高于其它培养基中培养的刺葡萄细胞花青素含量，其次是T6培养基，为50.60μg·g-1(FW)，第三是T2培养基，为39.54μg·g-1(FW)，最低是T3培养基，为22.22μg·g-1(FW)。从分析的结果可以看出，当刺葡萄细胞在T1培养基中培养35d时，最有利于其花青素含量的合成，花青素含量高达66.95μg·g-1(FW)，是对照T0培养基中刺葡萄细胞花青素含量的2.44倍，因此，将刺葡萄细胞培养在MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.05mg/L培养基中，可极大的提高其花青素含量。
表1不同培养基中刺葡萄细胞花青素含量变化情况
注：表中同列数据后无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。
c、不同培养天数和不同培养基对刺葡萄细胞原花青素含量的影响
本发明进一步考察了所筛选出来培养基对刺葡萄细胞中原花青素含量的影响。分别取25d和35d的刺葡萄细胞培养物，测定细胞培养物中原花青素的含量，测定的结果见表2。从培养天数变化来看，随培养天数从25d到35d的增加，原花青素含量极显著的升高。从不同培养基来看，KT浓度为0～2.0mg/L范围内，培养25d时，原花青素含量随KT浓度的升高呈现先增加后降低的趋势，但增加和降低的幅度很小，各培养基中培养的刺葡萄细胞原花青素含量除T1和T2与对照的T0培养基差异显著外，其余的差异都不显著，原花青素含量最高是T2培养基，为1433.65μg·g-1(FW)，其次是T1培养基，为1406.48μg·g-1(FW)，含量最低是T0培养基，为1100.33μg·g-1 (FW)；培养35d时，在KT浓度为0～2.0mg/L范围内，随KT浓度的增加，刺葡萄细胞中原花青素含量呈先急剧升高后迅速下降再缓慢升高的趋势，原花青素含量最高时对应的培养基是T1，为3947.50μg·g-1(FW)，其次是T6培养基，为2789.65μg·g-1(FW)，原花青素含量最低是T4培养基，为1836.24μg·g-1(FW)。从数据分析可以看出，T1培养基中培养35d的刺葡萄细胞，其原花青素含量极显著高于其它几个培养基，原花青素含量高达3947.50μg·g-1(FW)，是对照T0培养基2353.52μg·g-1(FW))的1.68倍，因此，将刺葡萄细胞培养在MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.05mg/L培养基中，也可极大的提高其原花青素含量。
表2不同培养基中刺葡萄细胞原花青素含量变化情况
综上所述，通过添加KT可以有效的调控刺葡萄细胞中花青素的合成，其中以MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.05mg/L培养基中培养的刺葡萄细胞中花青素和原花青素的含量最高，分别比对照提高了2.44倍和1.68倍。
本发明方法不仅能够快速获得大量刺葡萄细胞培养物，且所获得的刺葡萄细胞培养物具有高含量花青素，从而为刺葡萄细胞规模化培养生产天然花青素奠定了良好的基础。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。