本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种高活性微囊藻休眠体藻泥的制备方法。
背景技术：
微囊藻水华频繁暴发得益于微囊藻细胞在受到外界环境胁迫时能形成营养休眠体，以渡过生长环境恶劣时期，当环境条件适宜时微囊藻休眠体启动复苏，再次种群暴发，形成水华，即微囊藻水华发生初期的藻细胞或种源主要来源于底泥表层“越冬”的微囊藻休眠体群。长期以来，许多水环境科学工作者一直围绕微囊藻休眠体复苏的机理开展研究，以期能找到从源头控制微囊藻暴发水华的方法。因而，微囊藻休眠体是研究微囊藻复苏的一种必备实验材料。目前，试验研究过程中微囊藻休眠体的来源主要有二种途径：一是直接从暴发过微囊藻水华的水域底泥中筛选，这种从底泥中筛选实验所需的休眠体需要的底泥量很大，工作量也大，且许多都是失去活性的休眠体，成活率和复苏率低，复苏实验过程中很多休眠体无法复苏，影响实验数据的准确性和实验结果。二是在实验室对微囊藻进行简单的生境胁迫，如化学试剂胁迫、低温或暗光培养等人工迫使水体中微囊藻形成休眠体，但这种方法目前没有统一的技术制备标准，绝大多数都是制备成纯微囊藻休眠体藻泥，且微囊藻休眠体的成活率和复苏率也较低。为此，本发明以提高微囊藻休眠体成活率和复苏率角度为出发点，就“一种高活性微囊藻休眠体藻泥的制备”方法进行了发明研究。
技术实现要素：
本发明的目的是为满足水环境科学工作者因研究微囊藻休眠体复苏的机理而对微囊藻休眠体的需求，提供一种高活性微囊藻休眠体藻泥的制备方法。
制备本发明的高活性微囊藻休眠体藻泥包括如下步骤：
步骤一：将浓度为：1×107 ～9×107个/ ml微囊藻细胞的原液转接到经灭菌的BG11培养液中其体积比为：微囊藻原液：BG11培养液=1:20，再置于温度（T）25℃、光照强度50uEm-2s-1的人工气候箱内扩大培养至指数生长期，并记录指数生长期藻细胞浓度。
本步骤中，所述的微囊藻细胞的原液可以是铜绿微囊藻、水华微囊藻、惠氏微囊藻或鱼害微囊藻等。
步骤二：取精制石英粉用400目、孔径d=0.038mm的分样筛进行筛滤，取孔径d≤0.038mm的石英粉用蒸馏水洗涤3次后进行灭菌，冷却待用。
本步骤中，所述灭菌环境为1kg/cm2,121℃，20min。
步骤三：将灭菌石英粉与指数生长期藻液按体积比1:4移入到经灭菌的植物组织培养瓶中，再将植物组织培养瓶置于温度（T）4～6℃、光照强度0～5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h条件下静置培养45d。
本步骤中，所述培养瓶盖带透气滤菌膜。
步骤四：将步骤三培养45d的植物组织培养瓶中上清液移去，留底层混合物，再用导流棒沿培养瓶内壁缓慢加入浓度稀释1000倍的BG11培养液至500 ml刻度处，再次置于温度（T）4～6℃，光照强度0～5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h条件下静置培养15 d。
步骤五：将步骤四培养15d的植物组织培养瓶中上清液移去，底层混合物即为含高活性微囊藻休眠体的藻泥。
制得含高活性微囊藻休眠体的藻泥后，测定并记录此时藻泥体积及微囊藻休眠体浓度后保存，其保存的条件是：长期置于温度（T）4～6℃，光照强度0～5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h条件下保存，且用稀释1000倍的BG11培养液保持藻泥湿润，复苏试验时可根据需要取适当体积的藻泥。
本发明的休眠体成活率与复苏率实验及对比分析：
1、实验材料与方法
（1）休眠体成活率的测定
取存放3、6、9、12、15、18、21、24个月的微囊藻休眠体藻泥各1ml于25 ml试管中，用8ml pecoll悬浮试剂使活性微囊藻休眠体悬浮，然后加1 ml 5%无菌Lugol's试液进行固定再稀释后用血球计数板镜检计数，将折算出的藻泥微囊藻休眠体浓度与制备时的藻泥微囊藻休眠体浓度进行对比（值），得出不同存放期微囊藻休眠体的成活率。
（2）休眠体复苏率的测定
取存放3、6、9、12、15、18、21、24个月的微囊藻休眠体藻泥各1ml于120 ml三角瓶中，各加100ml BG11培养液，置于温度（T）25℃、光照强度50uEm-2s-1的人工气候箱内复苏培养7 d，每培养1d用血球计数板测定一次培养液中复苏的藻细胞（休眠体）数量，然后弃去100 ml BG11培养液，再加入新BG11培养液100 ml，将7 d测得的总微囊藻休眠体数与复苏前藻泥微囊藻休眠体数进行比值，得到不同存放期微囊藻休眠体的复苏率。
对照组：微囊藻休眠体制备过程中不加石英粉，即纯微囊藻休眠体藻泥，检测方法相同。
2、实验结果：
休眠体成活率与复苏率实验及对比如上表，从上表中可以看出，石英粉与休眠体混合制备的藻泥休眠体成活率显著高于纯微囊藻休眠体藻泥，石英粉与休眠体混合制备的藻泥休眠体成活率在保存条件下保存24个月其成活率仍高达98%以上，复苏率高达97%，而相应的对照组纯休眠体藻泥的休眠体成活率只有67%，复苏率为66%。因此，利用石英粉与休眠体混合制备的藻泥来进行微囊藻休眠体复苏实验，不仅能提高实验数据的准确性和实验结果的可靠性，而且石英粉价格低，灭菌后可以重复使用，降低了科学研究的实验成本。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例一：制备本发明的高活性微囊藻休眠体藻泥包括如下步骤：
步骤一：将浓度为5×107个/ ml水华微囊藻细胞的原液转接到经灭菌的BG11培养液中，再置于温度（T）25℃、光照强度50uEm-2s-1的人工气候箱内扩大培养至指数生长期，并记录指数生长期藻细胞浓度，其中所述微囊藻原液与BG11培养液的体积比为1:20，所述BG11培养液的配方由中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库提供。
步骤二：取精制石英粉用400目、孔径d=0.038mm的分样筛进行筛滤，取孔径d≤0.038mm的石英粉用蒸馏水洗涤3次后进行1kg/cm2,121℃20min灭菌，冷却待用。
步骤三：将灭菌石英粉100 ml与指数生长期藻液400ml移入到550 ml经灭菌的植物组织培养瓶中，再将植物组织培养瓶置于温度（T）5℃、光照强度3uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h条件下培养45d，所述培养瓶的瓶盖带有透气滤菌膜。
步骤四：将步骤三培养45d的植物组织培养瓶中上清液移去，留底层混合物，再用导流棒沿培养瓶内壁缓慢加入稀释1000倍的BG11培养液至500 ml刻度处，再次置于温度（T）5℃，光照强度3 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h条件下培养15 d。
步骤五：将步骤四培养15d的植物组织培养瓶中上清液移去，底层混合物即为含高活性微囊藻休眠体的藻泥。
实施例二：制备本发明的高活性微囊藻休眠体藻泥包括如下步骤：
步骤一：浓度为8×107个/ ml铜绿微囊藻细胞的原液转接到经灭菌的BG11培养液中，再置于温度（T）25℃、光照强度50uEm-2s-1的人工气候箱内扩大培养至指数生长期，并记录指数生长期藻细胞浓度，其中所述微囊藻原液与BG11培养液的体积比为1:20。
步骤二：取精制石英粉用400目、孔径d=0.038mm的分样筛进行筛滤，取孔径d≤0.038mm的石英粉用蒸馏水洗涤3次后进行1kg/cm2,121℃20min灭菌，冷却待用。
步骤三：将灭菌石英粉100 ml与指数生长期藻液400ml移入到550 ml经灭菌的植物组织培养瓶中，再将植物组织培养瓶置于温度（T）6℃、光照强度5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h条件下培养45d，所述培养瓶的瓶盖带有透气滤菌膜。
步骤四：将步骤三培养45d的植物组织培养瓶中上清液移去，留底层混合物，再用导流棒沿培养瓶内壁缓慢加入稀释1000倍的BG11培养液至500 ml刻度处，再次置于温度（T）6℃，光照强度5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h条件下培养15 d。
步骤五：将步骤四培养15d的植物组织培养瓶中上清液移去，底层混合物即为含高活性微囊藻休眠体的藻泥。
实施例三：制备本发明的高活性微囊藻休眠体藻泥包括如下步骤：
步骤一：浓度为3×107个/ ml鱼害微囊藻细胞的原液转接到经灭菌的BG11培养液中，再置于温度（T）25℃、光照强度50uEm-2s-1的人工气候箱内扩大培养至指数生长期，并记录指数生长期藻细胞浓度，其中所述微囊藻原液与BG11培养液的体积比为1:20，所述BG11培养液的配方由中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库提供。
步骤二：取精制石英粉用400目、孔径d=0.038mm的分样筛进行筛滤，取孔径d≤0.038mm的石英粉用蒸馏水洗涤3次后进行1kg/cm2,121℃20min灭菌，冷却待用。
步骤三：将灭菌石英粉100 ml与指数生长期藻液400ml移入到550 ml经灭菌的植物组织培养瓶中，再将植物组织培养瓶置于温度（T）4℃、光照强度1uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h条件下培养45d，所述培养瓶的瓶盖带有透气滤菌膜。
步骤四：将步骤三培养45d的植物组织培养瓶中上清液移去，留底层混合物，再用导流棒沿培养瓶内壁缓慢加入稀释1000倍的BG11培养液至500 ml刻度处，再次置于温度（T）4℃，光照强度1uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h条件下培养15 d。
步骤五：将步骤四培养15d的植物组织培养瓶中上清液移去，底层混合物即为含高活性微囊藻休眠体的藻泥。
制得含高活性微囊藻休眠体的藻泥后，测定并记录此时藻泥体积及微囊藻休眠体浓度并保存，其保存的条件是：长期置于温度（T）4～6℃，光照强度0～5 uEm-2s-1且光暗周期比14h：10h条件下保存，且须用稀释1000倍的BG11培养液保持藻泥湿润，复苏试验时可根据需要取适当体积的藻泥。
特别说明的是，本说明书中提到的BG11培养液的配方由中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库提供。