一种利用具有硝化功能的细菌净化海水养殖废水的方法与流程

本发明涉及养殖废水治理领域，具体的说是一种利用已制得的耐盐具有硝化功能的细菌净化海水养殖废水的方法。该方法用于去除养殖废水氨氮和总氮含量，为海水养殖废水无机氮污染的生物修复提供理论支持，适应于沿海养殖行业的推广使用。

背景技术：

海水养殖已有多年的发展历史，近年来我国海产品的需求量日益增多，海上捕捞量已经不足以满足市场的需求，因此海水养殖业迅猛发展，并趋于由粗养向精养过度。污染的问题也随着产生，近海水域环境严重恶化，从而导致了近岸海域生态系统失衡，严重影响了水产养殖生态安全，制约海水养殖业的可持续发展。海水养殖废水污染主要来源于残剩饲料、养殖体排泄物、各类化学药品等，主要污染元素为氮、磷和有机物。海水养殖废水具有两个明显的特点，即潜在污染物的含量低、水量大，废水分布分散。水产养殖过程中，水体的氨、硝酸盐、亚硝酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化情况频繁出现。氨态氮和亚硝酸盐氮等毒性较高会对水生动物造成严重影响。

目前，海水养殖修复技术主要包括三类：物理修复、化学修复和生物修复。常见物理修复有底泥疏浚、换水、曝气、筛网、泼撒沸石灰等方法，但这类方法常需要较高的投资和运转费用，并且处理效果不彻底；化学修复主要是运用水质改良剂、水质消毒剂和杀藻剂等改善养殖环境。但化学修复剂容易产生有害的次生产物，使得水生态系统健康状况更加恶化，水产品品质退化；生物修复是指生物尤其是微生物催化降解

环境污染物，减少或消除环境污染的受控或自发过程。有研究表明，由微生物引起的硝化作用是水中氮素释放的重要机制之一。硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养细菌，是生物硝化中起主要作用的微生物，污水中硝化细菌的含量与硝化速度成正比关系。因此硝化细菌具有良好的净化水质的效果，可用于海水养殖生物修复过程。

本发明引用下述参考文献，所有文献内容在此全部引入并作参考：

[1]刘海洋,戴志军.中国近海污染现状分析及对策[J].环境保护科学,2001,27(4):6-8.

[2]李纯厚,王学锋,王晓伟,林琳.中国海水养殖环境质量及其生态修复技术研究进展[J].农业环境科学学报,2006,25:310-315.

[3]刘卫东，苏浩，邓立康.微生物在水产养殖中的应用[J].水产科学,2001,20(2):28-31.

[4]赵玉洁,谢风行,周可.微生态制剂在水产养殖中的应用[J].可持续发展,2007,1:27-29.

[5]李正魁,濮培民,胡维平,等.固定化细菌技术及其在物理生态工程中的应用—固定化氨循环细菌对水生生态系统的修复[J].江苏农业学报,2001,17(4):248-252.

[6]崔袁园.低温硝化细菌的筛选及应用研究[D].哈尔滨工业大学,2006:6-8.

[7]Madsen E L.Metermining in situ biodegradation:facts and challenges[J].Evrion Sci Technol,1991,25(10):1663-1672.

所述具有硝化功能的细菌属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，命名为nitrification-HN07菌株，于2016年6月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO.60043。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种耐盐具有硝化功能的细菌处理海水养殖废水的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用具有硝化功能的细菌净化海水养殖废水的方法，其包括下述步骤：

1)接种该细菌；

2)恒温培养。

优选地，所述接种该细菌步骤为：将已有编号为7号的细菌菌株培养液接种于500mL养殖废水中，接种量为5mL。另取一份养殖废水加入5mL无菌水作为对照。121℃下灭菌20min。

优选地，所述恒温培养步骤为：将已灭菌的培养液置于恒温振荡器培养，条件为120r/min，30℃。

优选地，所述方法包括下述步骤：在无菌条件下，测定样品氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮含量，取样时间为接种后6h，12h，24h，36h，48h；所述测定样品氨氮、亚硝氮、硝氮含量采用的方法分别为：海洋监测规范第4部分：海水分析GB 17378.4-2007(36.2)次溴酸盐氧化法；水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法GB/T 7493-1987；海洋调查规范第4部分：海水化学要素调查GB/T 12763.4-2007(11.1)锌镉还原法。

优选地，一种耐盐具有硝化功能的细菌处理海水养殖废水的方法：

1)将已有编号为7号的细菌菌株培养液接种于500mL养殖废水中，接种量为5mL。另取一瓶养殖废水加入5mL无菌水作为对照。121℃下灭菌20min；

2)将上述已灭菌的培养液置于恒温振荡器培养，条件为120r/min，30℃；

3)取样均在无菌条件下，测定样品氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮含量，取样时间为接种后6h，12h，24h，36h，48h。

4)所述已有编号为7号的细菌菌株筛选自海南石斑鱼高位养殖池池底沉积物，所述养殖废水采自该石斑鱼高位养殖池。

所述测定样品氨氮、亚硝氮、硝氮含量采用的方法分别为：海洋监测规范第4部分：海水分析GB 17378.4-2007(36.2)次溴酸盐氧化法；水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法GB/T 7493-1987；海洋调查规范第4部分：海水化学要素调查GB/T 12763.4-2007(11.1)锌镉还原法。

本发明所具有的优点：

1、本发明利用耐盐具有硝化功能的细菌修复海水养殖废水无机氮污染，具有简便、无二次污染、修复效果好等特点。

2、本发明利用的耐盐具有硝化功能的细菌筛选自海南石斑鱼高位养殖池池底沉积物，即利用海水养殖系统自产沉污泥对海水养殖系统的排放废水进行净化，成本低廉，操作简单可行。且在较短时间内(6h)实现废水氨氮和总氮的有效去除，对于沿海养殖行业废水治理有较好的应用前景。

附图说明

图1为该细菌处理下废水氨氮去除率情况；

图2为该细菌处理下废水总氮含量变化情况；

图3为该细菌处理下废水硝酸盐氮变化情况；

图4为该细菌处理下废水亚硝酸盐变化情况。

实施例

下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：该细菌的制备

样品采集自海南某石斑鱼高位养殖池池底(具体位置为：海南省文昌市会文镇冯家村正盛养殖场)。

使用的主要仪器和设备有：

电子天平(CP124C)，奥豪斯(上海)仪器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9140A)，上海飞越实验仪器有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50KBS)，上海申安医疗器械厂；

水浴恒温振荡器(HZS-H),常州普天仪器制造有限公司；

生物洁净工作台(BCM-1000A)，苏州安泰空气技术有限公司；

电热恒温水槽(HH-W600)，上海浦东物理光学仪器厂；

光学显微镜，motic麦克奥迪实业集团有限公司；

伯乐梯度PCR仪-S1000，Bio-Rad；

Dragon 5mL、1mL、200uL、200uL、5uL移液枪。

实验过程：

1)富集培养：称取两份40g沉积物样品，在无菌操作台上接种于事先已灭菌，内装有玻璃珠的200mL亚硝化细菌培养基和硝化细菌培养基的三角瓶中，置于水浴恒温振荡器内以26℃、160r/min下恒温振荡培养2天，目的是打散菌胶团，使细菌成单细胞状态分散于水中。于无菌操作台上分别将培养液接种至新的培养基，接种量为5％。重复此操作3次，共培养8天，待用；

所述培养基为：

亚硝化细菌培养基成分为：每升培养基由NH₄Cl₄ 0.4g，K₂HPO₄·3H₂O 8.0g，KH₂PO₄1.5g，CH₃COONa 4.4g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，微量元素溶液1mL，pH为7.0-7.3。其中，微量元素：ZnSO₄ 2.2g，CaCl₂·2H₂O 5.5g，FeSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O 1.61g，MnCl₂·4H₂O 5.0g，Na₂MoO₄·4H₂O 1.1g，Na₂EDTA 63.7g，去离子水1000mL组成。pH7.0，于121℃下灭菌20min备用。

硝化细菌培养基成分为：每升培养基由NaNO₂ 1.0g，NaCO₃ 1.0g，CaCO₃ 1.0g，K₂HPO₄·3H₂O 8.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，微量元素溶液1mL，pH为7.0-7.3。其中，微量元素：ZnSO₄ 2.2g，CaCl₂·2H₂O 5.5g，FeSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O 1.61g，MnCl₂·4H₂O 5.0g，Na₂MoO₄·4H₂O 1.1g，Na₂EDTA 63.7g，去离子水1000mL组成。pH7.0，于121℃下灭菌20min备用。

2)分离纯化：取上述已富集的细菌培养液分别划线至亚硝化细菌培养基和硝化细菌固体培养基。首先用接种环挑取细菌培养液，然后在事先制好的平板上划线(注意不要划破琼脂表面)。划线时要在所划的范围内尽量划满，然后将接种环灼烧，再转动一定的角度连接已划线的区域再划另一区，最后划满整个平皿，于30℃下恒温生化培养箱中培养，3-4d后挑取单菌落划线至新的平板，重复操作5次，分离出长势较好的单菌落；

3)菌种保存：分别配制亚硝化细菌和硝化细菌固体斜面培养基，首先将已配好的液体培养基分装入20mL试管中，每支试管装入1/3容量的培养基。分装完毕后，需要用棉塞堵住瓶口，堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。塞好棉塞后灭菌备用。分别将上述长势较好的10株亚硝化细菌和硝化细菌单菌落划线至斜面培养基，首先用接种环挑取细菌培养液，然后将接种环伸进斜面培养基试管，在培养基上轻轻划线，接种菌体于其上。划线时要由底部起划较密的平行线，一直划到顶部，以充分利用斜面面积。于30℃下恒温生化培养箱中培养3d后，放置4℃冰箱保存；

4)菌种鉴定：将上述获得的纯菌落进行亚硝化酸细菌和硝化细菌鉴定，选出好氧硝化性能优异的菌株。再对此细菌进行16S rDNA鉴定，即筛选出好氧硝化细菌菌株。

亚硝化细菌鉴定：取上述10株亚硝化细菌单菌落接种于亚硝化细菌培养基，另取一份亚硝化细菌培养基接种无菌水作为对照。于26℃恒温振荡器中培养48h。取上述10株菌株培养液以及对照液于白瓷比色板上，加格里斯试剂甲液和乙液各一滴，若有亚硝酸存在则呈红色，实验结果表明，7号菌株培养液均呈现红色，而其他菌株及对照并没有显色。因此，7号菌株有氨氧化作用，即硝化活性，即7号菌株为具有亚硝化功能的细菌。

硝化细菌鉴定：取上述10株硝化细菌单菌落接种于硝化细菌培养基，另取一份硝化细菌培养基接种1.0mL无菌水作为对照。于26℃恒温振荡器中培养48h。分别取上述硝化细菌培养液10mL于试管中，首先为了去除培养液中的NO^-，在培养液中加入醋酸5-8滴使之酸化，再加入数粒对氨基苯磺酸，当停止放气时，再加入一粒对氨基苯磺酸，此过程中NO^-转化为氮气逸出。分别取此培养液以及对照液于白瓷比色板上，逐滴加入加格里斯试剂，如不呈现红色，证明亚硝酸已完全消失。再加二苯胺试剂2-4滴，如呈现蓝色说明有硝化细菌的存在。实验结果表明，均未出现蓝色，证明不存在将亚硝酸氧化成硝酸的菌株，即不存在硝化细菌。

16S rDNA鉴定：其特征在于PCR扩增程序，该程序是94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。根据NCBI及参考文献设计引物如下：

上游引物F：(5'-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3')；

下游引物R：(5'-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3')。

将编号为7号的细菌的PCR产物送至华大基因做测序，所测的序列长度在1000bp左右，经NCBI的BLAST对比为硝化细菌，其序列如下：

7号细菌序列

GCGGCACATAGAACAGCATCGGCAGCGTGCGGAACTCCGGATGCAACGGCAGCGCGATGCCCCATTTCTTCACGAACTGG

AAAACCGGGAGACTTCTGCGCAGCCTCGATCTTCGCATCTGGAATCCCGTTCGCCCTCGCGGCGGCGATGATCTCCGGAT

CAAACGGATCCTTGATGATGTTGCGCTGAGCCATCACCAGCTGGTCTGCGGCGACTTCGCGGTCTCCTCGATCGCATCCG

CATCGTAAAGCACGAGGCCGATATACCGGATGCGTCCGACGCAGGAGTGGAAGCACGCCGGCGGCTGGCCGCTCTCCAGA

CGCGGATAGCACAGGATGCACTTCTCGGCCTTGCCGGTCGACCAGTTGAAGTAGGTCTTCTTGTAGGGGCAGCCGGAAAC

GCACATGCGCCAGGCGCGGCAGCGTTCCTGGCTCACCAGCACAACGCCGTCCTCACCGCGCTTGTAGAGCGCGCCCTGCG

GACACGCCGCAACGCATCCCGGATTGAGGCAATGGTTGCAGATGCGCGGCAGATAGAAAAACACCGTGCTGTTGATCTCG

TTGATCTGGCGCATCTCCTCGTCGGAAGCGCCGTCGAAGTTCGGGTCGTTGTTGGCGTAAACCTGCGAACCGCCGAGGTC

GTCGTCCCAGTTCGGACCCGCCTCGATCGTGTCCATGTACTTGCCGGTCACCATCGAGATCGCCCGCGCAGTCGGCTGCT

CGTCGGCCAGCGGCGCATTGATCAGGTTCTGGTAGTCGTAGGTCCAGGGCTCGAAATAATCGTCGAGCGTCGGCAGATAG

GGGTTGTAGAAAATGTTCGTCAGCGTGCCCCACTTGCCCTGCAGCCGCAGCCGCAGGCTCTTCTGCCGCTGACCGTCAAC

CACCCAGCCGCCACGATACTTGGTCTGGTCTTCCCAACGTGTCGGGTAACCCGTACCCGGCTTGGTCTCCACGTTGTTCC

AGTACATGTACTCGGTGCCCTTGCGATCGGTCCAGATGTTCTTGCACGCGATGCTGCAGGTGTGGCAACCGAT

所述硝化细菌属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，命名为nitrification-HN07菌株，于2016年6月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO.60043。其如序列编号所示。

实施例2：废水处理

废水样品采集在海南某石斑鱼高位养殖池(具体位置为：海南省文昌市会文镇冯家村正盛养殖场)。

使用的主要仪器和设备有：

电子天平(CP124C)，奥豪斯(上海)仪器有限公司；

V-1200型可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；

JPSJ-605型溶解氧仪(台式)，上海仪电科学仪器股份有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9140A)，上海飞越实验仪器有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50KBS)，上海申安医疗器械厂；

生物洁净工作台(BCM-1000A)，苏州安泰空气技术有限公司；

电热恒温水槽(HH-W600)，上海浦东物理光学仪器厂；

光学显微镜，motic麦克奥迪实业集团有限公司

Dragon 5mL、1mL、200uL移液枪。

实验过程：

1)将已有编号为7号的细菌菌株培养液接种于500mL养殖废水中，接种量均为10mL。另取一瓶养殖废水加入5mL无菌水作为对照。121℃下灭菌20min；

2)将上述已灭菌的培养液置于恒温振荡器培养，条件为120r/min，30℃；

3)取样均在无菌条件下，测定样品溶解氧、氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮含量，取样时间为接种后6h，12h，24h，36h，48h。

测定样品氨氮、亚硝氮、硝氮含量采用的方法分别为：海洋监测规范第4部分：海水分析GB 17378.4-2007(36.2)次溴酸盐氧化法；水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法GB/T 7493-1987；海洋调查规范第4部分：海水化学要素调查GB/T 12763.4-2007(11.1)锌镉还原法。

废水水质如下表：

实验结果如下：

7号菌在48h内氨氮去除率均为正，在6h最高，氨氮去除率为48％如图1。

废水总氮含量为1.996mg/L，7号菌株处理的废水总氮呈现减少趋势，其处理的废水总氮含量在5个取样点均低于初始值，如图2。

废水硝氮含量为0.927mg/L，7号菌株处理的废水硝氮含量在6h、12h高于初始值，而到了24、36、48h其值低于初始值，如图3。

废水亚硝氮含量为0.341mg/L，7号菌株处理的废水亚硝氮含量与初始值相差不大，如图4。其变化可忽略。

由以上实验结果可知，7号硝化细菌有较好的去除海水养殖废水中氨氮的作用，其氨氮去除率最大为48％，出现时间为6h。而其总氮并未增加反而减少，7号硝化细菌在第6h总氮含量相比废水有所下降。处理过程中，废水亚硝氮含量基本不变，硝氮先升高后降低，推测升高是由于氨氮转化为硝氮，而降低则可能存在反硝化作用，使得硝氮以氮气形式逸出。可见7号硝化细菌能有效去除海水养殖废水中无机氮含量，有效修复海水养殖废水无机氮污染。