本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种柠檬酸蛋白铁的制备方法及其应用。
背景技术：
目前伴随着人民生活水平的提高，广大人民群众对身体健康日益重视。为了预防和控制缺铁性贫血，采取了多种途径，如膳食途径、食物强化等，也取得了很好的效果。然而对孕妇、儿童以及其他严重缺铁性贫血等病人，药物治疗就显得尤为必需。
早期治疗方法多以口服无机铁盐为治疗手段，最常见的为硫酸亚铁。无机金属铁盐被人体摄入后，在酸性胃液介质中易被电离成为金属阳离子，然后进入小肠被人体吸收利用。而小肠壁对带有正电荷的金属离子有一定的排斥作用，导致部分金属离子不仅不易被吸收，还会刺激胃肠，引起腹泻。不同金属元素之间的拮抗作用也会使吸收进入体内的金属元素利用率和沉积效率受到限制，导致其生物有效性降低。另有文献报道亚铁离子还能催化自由基，具有细胞毒性。
由于无机铁盐的种种弊端，人们开始寻找新的补铁药物。Saltman等研究人员通过一系列研究，提出了铁的吸收转运机制。他们认为在动物腔肠内，不论是三价还是二价的铁，都必须与内源或外源配位体结合形成络合物，再以此形式吸收并进一步转运。考虑到药品安全性，补铁药物的代谢产物最好是内源性物质。研究人员继而把目光投向了铁的螯合物。随后产生了大量的小分子有机铁配合物，但是时至至今，这类物质还是以保健食品或添加剂在使用，国内仍然未见物质为主药的真正意义上的药品。
70年代后期，国外开始研究开发大分子的补铁药物，至今，大分子的补铁药物研制成功并上市的并不多见，以多糖铁配合物和蛋白铁配合物为主。
因此，需要一种载铁量高，能克服胃肠道副反应，最好其代谢产物是内源性物质的大分子补铁药物。
技术实现要素：
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种柠檬酸蛋白铁制备方法及其应用，其目的在于通过柠檬酸蛋白的载铁反应制备得到载铁量高、代谢产物为内源性物质的柠檬酸蛋白铁产品，由此解决现有技术铁配合物载铁量低、存在胃肠道副反应的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种柠檬酸蛋白铁的制备方法，使得柠檬酸蛋白和铁离子发生络合反应，其反应式如下：
式中n为0或1。。
优选地，所述柠檬酸蛋白的制备方法为：加入柠檬酸酐和蛋白质，使柠檬酸酐与蛋白质分子上的伯氨基或仲氨基上的氢发生取代反应。
优选地，所述蛋白质为动物蛋白质、植物蛋白质或微生物蛋白质。
优选地，所述动物蛋白质为酪蛋白、乳蛋白和/或胶原蛋白中的一种或多种，所述动物蛋白质优选为酪蛋白。
优选地，所述植物蛋白质为大豆蛋白、胚芽蛋白、花生蛋白和/或螺旋藻蛋白中的一种或多种，所述植物蛋白质优选为大豆蛋白。
优选地，所述的柠檬酸蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)溶解柠檬酸蛋白
向柠檬酸蛋白中加入10～20倍重量的水，混合均匀，采用氢氧化钠溶 液调节pH至柠檬酸蛋白溶解完全，得柠檬酸蛋白溶液；
(2)载铁
向步骤(1)获得的柠檬酸蛋白溶液中逐滴加入质量百分比浓度为1％～4％的FeCl3溶液，所述柠檬酸蛋白和FeCl3的重量比为1:0.1～0.4，使用氢氧化钠溶液调节控制溶液pH 6～10，确保无沉淀析出，固液分离，上清液即为柠檬酸蛋白铁粗品溶液；
(3)纯化
用酸性溶液调节所述柠檬酸蛋白铁粗品溶液的pH至1.0～4.0，使柠檬酸蛋白铁完全沉淀，去离子水洗涤沉淀至柠檬酸蛋白铁中游离铁含量不超过0.01％，得柠檬酸蛋白铁湿品；
(4)干燥
将步骤(3)得到的柠檬酸蛋白铁湿品置于温度50～60℃下干燥至水分低于5％，得到柠檬酸蛋白铁产品。
优选地，所述步骤(2)中FeCl3的质量百分比浓度为2％～3％。
优选地，所述步骤(2)中柠檬酸蛋白与FeCl3的重量比为1:0.2～0.3。
优选地，所述步骤(3)中酸性溶液为盐酸。
按照本发明的另一个方面，提供了一种柠檬酸蛋白铁的应用，应用于制备治疗缺铁性贫血的药物。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。
(1)本发明的柠檬酸蛋白铁采用柠檬酸蛋白通过载铁反应制备而成。柠檬酸蛋白作为铁的配位体，其在人体内代谢产物为氨基酸和柠檬酸，均为人体内源性物质，安全无毒。
(2)柠檬酸蛋白铁作为大分子蛋白络合铁，它在pH小于4时呈沉淀状态，而在碱性条件下又重新变成可溶性物质，这样它在胃内不被胃蛋白酶消化，在进入肠道后，它重新溶解，被消化吸收。
(3)相较于现有技术，柠檬酸蛋白铁具有铁含量高，代谢产物为内源性物质，安全无毒的特点，应用于制备治疗缺铁性贫血的药物时可望具有良好的市场前景。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明的柠檬酸蛋白铁的制备方法，所述柠檬酸蛋白铁为柠檬酸蛋白和铁离子发生络合反应而生成，其反应式如下：
式中n为0或1。
其中柠檬酸蛋白的制备方法为：加入柠檬酸酐和蛋白质，使柠檬酸酐与蛋白质分子上的伯氨基或仲氨基上的氢发生取代反应。其中，所述蛋白质为动物蛋白质、植物蛋白质或微生物蛋白质。动物蛋白质为酪蛋白、乳蛋白和/或胶原蛋白中的一种或多种，优选为酪蛋白；植物蛋白质为大豆蛋白、胚芽蛋白、花生蛋白和/或螺旋藻蛋白中的一种或多种，优选为大豆蛋白。
本发明所述的柠檬酸蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)溶解柠檬酸蛋白
向柠檬酸蛋白中加入10～20倍重量的水，混合均匀，采用氢氧化钠溶液调节pH至柠檬酸蛋白溶解完全，得柠檬酸蛋白溶液；
(2)载铁
向步骤(1)获得的柠檬酸蛋白溶液中逐滴加入质量百分比为1％～4％的FeCl3溶液(4小时以上加完控制添加速度)，所述柠檬酸蛋白和FeCl3的重量比为1:0.1～0.4，使用氢氧化钠溶液调节控制溶液pH 6～10，确保无沉淀析出，FeCl3添加完毕后继续搅拌0.5h，离心分离，上清液即为柠檬酸蛋白铁粗品溶液；
所述步骤(2)中FeCl3的质量百分比浓度优选为2％～3％，柠檬酸蛋白与FeCl3的重量比优选为1:0.2～0.3，这样可以获得较高的载铁量，同时铁离子杂质含量较低。
(3)纯化
用酸性溶液调节所述柠檬酸蛋白铁粗品溶液的pH至1.0～4.0，使柠檬酸蛋白铁完全沉淀，去离子水洗涤沉淀至柠檬酸蛋白铁中游离铁含量不超过0.01％，得柠檬酸蛋白铁湿品；
(4)干燥
将步骤(3)得到的柠檬酸蛋白铁湿品置于温度50～60℃下干燥至水分低于5％，得到柠檬酸蛋白铁产品。
本发明制备得到的柠檬酸蛋白铁，载铁量可高达8％，可应用于制备治疗缺铁性贫血的药物，载铁量高，代谢产物为内源性物质，突破性地解决了现有技术治疗缺铁性贫血药物的载铁量低、存在胃肠道副反应的问题。
以下为实施例：
实施例1
1、溶解：在反应器中加入所述柠檬酸蛋白和15倍重量的水，搅拌均匀，采用氢氧化钠溶液调节pH至柠檬酸蛋白溶解完全，得柠檬酸蛋白溶液。
2、载铁：搅拌下按照柠檬酸蛋白与FeCl3重量比1:0.1缓缓向柠檬酸蛋白溶液加入质量百分比浓度为1％的FeCl3溶液(4小时以上加完控制添加速度)，并用使用氢氧化钠溶液调节控制溶液pH为6～10，确保无沉淀析出，FeCl3添加完毕后继续搅拌0.5h，离心，上清液即为柠檬酸蛋白铁粗品 溶液。
3、纯化：用2mol/L的盐酸调节柠檬酸蛋白铁粗品溶液pH至2.0～4.0，使柠檬酸蛋白铁完全沉淀，去离子水洗涤沉淀至柠檬酸蛋白铁中游离铁含量至0.002％，得柠檬酸蛋白铁湿品。
4、干燥：将得到的柠檬酸蛋白铁湿品置于温度50～60℃下干燥至水分5％，得到柠檬酸蛋白铁产品。经检测柠檬酸蛋白铁含铁量为4.8％。
实施例2
1、溶解：在反应器中加入所述柠檬酸蛋白和15倍重量的水，搅拌均匀，采用氢氧化钠溶液调节pH至柠檬酸蛋白溶解完全，得柠檬酸蛋白溶液。
2、载铁：搅拌下按照柠檬酸蛋白与FeCl3重量比1:0.2缓缓向柠檬酸蛋白溶液加入质量百分比浓度为2％的FeCl3溶液(4小时以上加完控制添加速度)，并用使用氢氧化钠溶液调节控制溶液pH为6～10，确保无沉淀析出，FeCl3添加完毕后继续搅拌0.5h，离心，上清液即为柠檬酸蛋白铁粗品溶液。
3、纯化：用2mol/L的盐酸调节柠檬酸蛋白铁粗品溶液pH至2.0～4.0，使柠檬酸蛋白铁完全沉淀，去离子水洗涤沉淀至柠檬酸蛋白铁中游离铁含量至0.003％，得柠檬酸蛋白铁湿品。
4、干燥：将得到的柠檬酸蛋白铁湿品置于温度50～60℃下干燥至水分4.5％，得到柠檬酸蛋白铁产品。经检测柠檬酸蛋白铁含铁量为6.8％。
实施例3
1、溶解：在反应器中加入所述柠檬酸蛋白和15倍重量的水，搅拌均匀，采用氢氧化钠溶液调节pH至柠檬酸蛋白溶解完全，得柠檬酸蛋白溶液。
2、载铁：搅拌下按照柠檬酸蛋白与FeCl3重量比1:0.4缓缓向柠檬酸蛋白溶液加入质量百分比浓度为3％的FeCl3溶液(4小时以上加完控制添加速度)，并用使用氢氧化钠溶液调节控制溶液pH为6～10，确保无沉淀析出，FeCl3添加完毕后继续搅拌0.5h，离心，上清液即为柠檬酸蛋白铁粗品 溶液。
3、纯化：用2mol/L的盐酸调节柠檬酸蛋白铁粗品溶液pH至2.0～4.0，使柠檬酸蛋白铁完全沉淀，去离子水洗涤沉淀至柠檬酸蛋白铁中游离铁含量至0.006％，得柠檬酸蛋白铁湿品。
4、干燥：将得到的柠檬酸蛋白铁湿品置于温度50～60℃下干燥至水分3.8％，得到柠檬酸蛋白铁产品。经检测柠檬酸蛋白铁含铁量为7.5％。
实施例4
1、溶解：在反应器中加入所述柠檬酸蛋白和15倍重量的水，搅拌均匀，采用氢氧化钠溶液调节pH至柠檬酸蛋白溶解完全，得柠檬酸蛋白溶液。
2、载铁：搅拌下按照柠檬酸蛋白与FeCl3重量比1:0.4缓缓向柠檬酸蛋白溶液加入质量百分比浓度为4％的FeCl3溶液(4小时以上加完控制添加速度)，并用使用氢氧化钠溶液调节控制溶液pH确保无沉淀析出，FeCl3添加完毕后继续搅拌0.5h，离心，上清液即为柠檬酸蛋白铁粗品溶液。
3、纯化：用2mol/L的盐酸调节柠檬酸蛋白铁粗品溶液pH至2.0～4.0，使柠檬酸蛋白铁完全沉淀，去离子水洗涤沉淀至柠檬酸蛋白铁中游离铁含量至0.008％，得柠檬酸蛋白铁湿品。
4、干燥：将得到的柠檬酸蛋白铁湿品置于温度50～60℃下干燥至水分4.5％，得到柠檬酸蛋白铁产品。经检测柠檬酸蛋白铁含铁量为7.9％。
实施例5
实验鼠要求：雄性，约四周大，体重小于7 0克，温度25±2℃，湿度50％，光照周期各12小时，供给水为去离子水。
饲料配方：基础饲料：采用AIN-76配方，碳水化合物全用玉米淀粉，矿物质不加铁，铁小于3ppm。
标准组饲料：基础饲料添加蛋白琥珀酸铁(菲利普)，配制成含有蛋白琥珀酸铁质量百分比浓度为0.12mg/kg、0.24mg/kg、0.36mg/kg、0.72mg/kg，四种不同浓度饲料。
试验饲料：基础饲料添加柠檬酸蛋白铁(本品)，配制成含有柠檬酸蛋白铁质量百分比浓度为0.12mg/kg、0.24mg/kg、0.36mg/kg、0.72mg/kg，四种不同浓度饲料。每一种样品需要一套含四种浓度度之试验饲料。
实验设计
(1)基础饲料组：7只鼠，全程基础饲料。
(2)标准对照组：四组，每组7只鼠，再生期饲喂标准饲料，每组一个浓度。
(3)实验组：四组，每组7只鼠，再生期饲喂试验饲料，每组一个浓度。
实验步骤：
耗铁期：全部喂饲基础饲料，每周记录体重，尾巴采血追踪血红素变化，直到降至6g/dL以下，大約需14至21天。
再生期：依体重分组，每组7只，一组饲喂基础饲料，四组饲喂标准饲料，四组饲喂实验饲料，每组一种铁浓度。一种样品需要四组鼠，饲喂试验饲料，每组一种铁浓度。定时记录饲料摄取量，10～14天采血测血红素。
分析项目及方法：
铁量分析：测试样品灰化，灰分用浓盐酸溶解，适当稀释后，以原子吸收光谱法配合铁标准溶液与铁标准检量线而定量。
血红素分析：取5ml HiCN到一试管，加入20ul老鼠静脉血，静置3～5分钟，测其血红素。
计算统计分析：
再生期铁摄取量以各组饲料铁浓度乘以饲料摄取重量而得。大鼠的血液体积以每克体重有0.067mL计，血红素的含铁量以0.335％计。代表铁利用之生物指标可采用再生后血红素浓度、再生期血红素浓度增加量或再生期血红素铁增加量，其计算原则如下：
血红素增加量(mmol/L)＝再生期之血红素浓度－耗铁期结束之血红素浓度。
血红素总铁量(μmolHb/rat)＝大鼠体重×0.067×血红素浓度×0.335％。
血红素铁增加量(μmolFe/rat)＝再生期之血红素总铁量－耗铁期结束之血红素总铁量。
结果评定：
试验饲料各组之铁利用指标均高于铁浓度相当之铁标准饲料组，而且标准对照组和实验组相对生物价大于100，因此柠檬酸蛋白铁单位量的补铁效果优于蛋白琥珀酸铁。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。