本发明属于柠檬酸生产技术领域，具体地，涉及一种生物发酵法制备柠檬酸的方法。
背景技术：
柠檬酸是一种重要的有机酸，又名枸橼酸，无色晶体，常含一分子结晶水，无臭，有很强的酸味，易溶于水。其钙盐在冷水中比热水中易溶解，此性质常用来鉴定和分离柠檬酸。结晶时控制适宜的温度可获得无水柠檬酸。柠檬酸在工业，食品业，化妆业等具有极多的用途。广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。
目前我国柠檬酸发酵绝大多数采用间歇发酵的方法，发酵采用每罐按照一定的比例投入发酵培养基，并接入一定的柠檬酸菌种进行发酵培养，通过一次装液和菌种接种发酵至终点，当发酵残糖降低至一定程度后即判断为发酵终点。但是采用现有技术的这种发酵方法，随着发酵的进行，尽管柠檬酸酸度逐渐提高，残糖逐渐降低，但是，当发酵残糖降低到一定程度时，柠檬酸发酵菌种的代谢能力下降，致使发酵培养周期延长，且设备的利用率较低。
改进发酵培养基是缩短柠檬酸发酵周期的一个途径，开发成本低廉，而且产酸量高的培养基，最大限度地降低企业成本是我们研究的方向。
基于上述技术问题，发展先进的酶法和化学法的水解新技术，制备高产率的碳源与可利用性氮源极有可能取得突破性进展。
高粱秸秆作为农业废弃物，一般简单粉碎处理或者燃烧处理，既不能充分利用，也容易造成环境污染。高粱秸秆较高的营养成分，经青贮、黄贮、氨化及糖化等处理后，可提高利用率，效益将争更可观。需要对高粱秸秆进行充分利用，使其具有良好的生态效益和经济效益。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种生物发酵法制备柠檬酸的方法。
本发明提供的一种生物发酵法制备柠檬酸的方法，本发明缩短了柠檬酸发酵周期，产酸量高，同时利用高粱秸秆作为发酵基质，成本低廉。
根据本发明提供的一种生物发酵法制备柠檬酸的方法，包括如下步骤：
步骤（1）取发酵培养基原料：按照重量百分比取各原料备用，其中：高粱秸秆水解液8-12%，果糖1-4%，玉米浆提取物1-3%，贝壳粉0.02%，硫酸钠0.02%，磷酸二氢钾0.01%；
步骤（2）制备发酵培养基：将高粱秸秆水解液，果糖，玉米浆提取物，贝壳粉，硫酸钠以及磷酸二氢钾按照比例混合，搅拌均匀，然后在温度80-100℃、维持时间15-20分钟进行灭菌处理，再降温至30℃，制得发酵培养基；
步骤（3）发酵制备柠檬酸：发酵菌种按照7％的接种量接入发酵培养基中，发酵42小时，得到柠檬酸发酵液。
所述发酵分连续的多阶段进行，包括第一发酵阶段和第二发酵阶段，
在第一发酵阶段中，向发酵罐中流加柠檬酸发酵培养基流加发酵菌种种子液；
提高调整培养基和种子液的流加速率，进入第二发酵阶段，当发酵液中柠檬酸的酸度为大于150g/l，且残果糖含量为1-4g/l时，停止发酵。
优选地，所述第一发酵阶段发酵完成时，发酵液中的柠檬酸的酸度为50-100g/l，还果糖浓度为40-70g/l。
优选地，所述提高调整培养基和种子液的流加速率为0.6kg/小时。
优选地，所述在第一发酵阶段和第二发酵阶段之间补充发酵培养基。
优选地，所述高粱秸秆水解液制备方法为：将高粱秸秆粉碎，过150-200目筛，然后添加两倍重量的浓度为10-12的氨水，220rpm搅拌水解7-9小时，最后添加盐酸，调节溶液的ph为6.9-7.0，即可。
优选地，所述贝壳粉的细度为100-120目。
优选地，所述玉米浆提取物的制备方法为：将玉米粉碎，高温消毒，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡1.5小时，随后添加占玉米1%重量份的α-淀粉酶，升温至60℃，水解45min，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即可。
优选地，所述玉米为鲜玉米。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
（1）本发明缩短了柠檬酸发酵周期，产酸量高，同时利用高粱秸秆作为发酵基质，成本低廉，开创了一条利用废弃生物水解的碳氮源生产柠檬酸的创新技术，大大降低了成本，提高了企业利润；
（2）本发明对高粱秸秆废弃物进行了粉碎和水解处理，使得氮、磷、钾、钙、镁以及纤维素多糖等得到有效利用；玉米含有大量的淀粉，脂肪，糖以及维生素等，但是菌株利用率较低，通过处理后，提高了各养分的浸出率，菌株利用率大大提高；
（3）本发明在发酵过程中的第一发酵阶段将发酵培养基和培养成熟的发酵菌种的种子液连续流加到发酵罐中，从而达到连续发酵的目的，降低发酵周期；在所述发酵过程中的第一发酵阶段以及后一个发酵阶段之间选择性地流加一定的培养基来提高柠檬酸发酵强度，提高了发酵中后期柠檬酸菌种的代谢能力，从而进一步缩短了生产周期，提高产量的目的。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明提供的一种生物发酵法制备柠檬酸的方法，本发明缩短了柠檬酸发酵周期，产酸量高，同时利用高粱秸秆作为发酵基质，成本低廉。
根据本发明提供的一种生物发酵法制备柠檬酸的方法，包括如下步骤：
步骤（1）取发酵培养基原料：按照重量百分比取各原料备用，其中：高粱秸秆水解液8-12%，果糖1-4%，玉米浆提取物1-3%，贝壳粉0.02%，硫酸钠0.02%，磷酸二氢钾0.01%；
步骤（2）制备发酵培养基：将高粱秸秆水解液，果糖，玉米浆提取物，贝壳粉，硫酸钠以及磷酸二氢钾按照比例混合，搅拌均匀，然后在温度80-100℃、维持时间15-20分钟进行灭菌处理，再降温至30℃，制得发酵培养基；
步骤（3）发酵制备柠檬酸：发酵菌种按照7％的接种量接入发酵培养基中，发酵42小时，得到柠檬酸发酵液。
所述发酵分连续的多阶段进行，包括第一发酵阶段和第二发酵阶段，
在第一发酵阶段中，向发酵罐中流加柠檬酸发酵培养基流加发酵菌种种子液，发酵菌种种子液由公知技术值得；
提高调整培养基和种子液的流加速率，进入第二发酵阶段，当发酵液中柠檬酸的酸度为大于150g/l，且残果糖含量为1-4g/l时，停止发酵。
优选地，所述第一发酵阶段发酵完成时，发酵液中的柠檬酸的酸度为50-100g/l，还果糖浓度为40-70g/l。
优选地，所述提高调整培养基和种子液的流加速率为0.6kg/小时。
优选地，所述在第一发酵阶段和第二发酵阶段之间补充发酵培养基。
优选地，所述高粱秸秆水解液制备方法为：将高粱秸秆粉碎，过150-200目筛，然后添加两倍重量的浓度为10-12的氨水，220rpm搅拌水解7-9小时，最后添加盐酸，调节溶液的ph为6.9-7.0，即可。
优选地，所述贝壳粉的细度为100-120目。
优选地，所述玉米浆提取物的制备方法为：将玉米粉碎，高温消毒，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡1.5小时，随后添加占玉米1%重量份的α-淀粉酶，升温至60℃，水解45min，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即可。
优选地，所述玉米为鲜玉米。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
（1）本发明缩短了柠檬酸发酵周期，产酸量高，同时利用高粱秸秆作为发酵基质，成本低廉，开创了一条利用废弃生物水解的碳氮源生产柠檬酸的创新技术，大大降低了成本，提高了企业利润；
（2）本发明对高粱秸秆废弃物进行了粉碎和水解处理，使得氮、磷、钾、钙、镁以及纤维素多糖等得到有效利用；玉米含有大量的淀粉，脂肪，糖以及维生素等，但是菌株利用率较低，通过处理后，提高了各养分的浸出率，菌株利用率大大提高；
（3）本发明在发酵过程中的第一发酵阶段将发酵培养基和培养成熟的发酵菌种的种子液连续流加到发酵罐中，从而达到连续发酵的目的，降低发酵周期；在所述发酵过程中的第一发酵阶段以及后一个发酵阶段之间选择性地流加一定的培养基来提高柠檬酸发酵强度，提高了发酵中后期柠檬酸菌种的代谢能力，从而进一步缩短了生产周期，提高产量的目的。
实施例1
本实施例提供的一种生物发酵法制备柠檬酸的方法，包括如下步骤：
步骤（1）取发酵培养基原料：按照重量百分比取各原料备用，其中：高粱秸秆水解液9%，果糖3%，玉米浆提取物2%，贝壳粉0.02%，硫酸钠0.02%，磷酸二氢钾0.01%；
步骤（2）制备发酵培养基：将高粱秸秆水解液，果糖，玉米浆提取物，贝壳粉，硫酸钠以及磷酸二氢钾按照比例混合，搅拌均匀，然后在温度90℃、维持时间19分钟进行灭菌处理，再降温至30℃，制得发酵培养基；
步骤（3）发酵制备柠檬酸：发酵菌种按照7％的接种量接入发酵培养基中，发酵42小时，得到柠檬酸发酵液。
所述发酵分连续的多阶段进行，包括第一发酵阶段和第二发酵阶段，
在第一发酵阶段中，向发酵罐中流加柠檬酸发酵培养基流加发酵菌种种子液，发酵菌种种子液由公知技术值得；
提高调整培养基和种子液的流加速率，进入第二发酵阶段，当发酵液中柠檬酸的酸度为155g/l，且残果糖含量为4g/l时，停止发酵。
所述第一发酵阶段发酵完成时，发酵液中的柠檬酸的酸度为60g/l，还果糖浓度为60g/l。
所述提高调整培养基和种子液的流加速率为0.6kg/小时。
所述在第一发酵阶段和第二发酵阶段之间补充发酵培养基。
所述高粱秸秆水解液制备方法为：将高粱秸秆粉碎，过170目筛，然后添加两倍重量的浓度为11的氨水，220rpm搅拌水解7-9小时，最后添加盐酸，调节溶液的ph为6.9，即可。
所述贝壳粉的细度为110目。
所述玉米浆提取物的制备方法为：将玉米粉碎，高温消毒，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡1.5小时，随后添加占玉米1%重量份的α-淀粉酶，升温至60℃，水解45min，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即可。
所述玉米为鲜玉米。
本实施例的发酵方法与现有的间歇发酵方法相比较：
本实施例将8×105-12.5×105l的发酵培养基发酵至柠发酵液中柠檬酸的酸度为155g/l，且残果糖含量为4g/l时，发酵所需的时间为55小时；
间歇发酵方法将同等体积相同组分的发酵培养基发酵至柠檬酸的酸度为155g/l，且残果糖含量为4g/l时，发酵所需的时间为71小时。
实施例2
本实施例提供的一种生物发酵法制备柠檬酸的方法，包括如下步骤：
步骤（1）取发酵培养基原料：按照重量百分比取各原料备用，其中：高粱秸秆水解液12%，果糖1%，玉米浆提取物3%，贝壳粉0.02%，硫酸钠0.02%，磷酸二氢钾0.01%；
步骤（2）制备发酵培养基：将高粱秸秆水解液，果糖，玉米浆提取物，贝壳粉，硫酸钠以及磷酸二氢钾按照比例混合，搅拌均匀，然后在温度100℃、维持时间15分钟进行灭菌处理，再降温至30℃，制得发酵培养基；
步骤（3）发酵制备柠檬酸：发酵菌种按照7％的接种量接入发酵培养基中，发酵42小时，得到柠檬酸发酵液。
所述发酵分连续的多阶段进行，包括第一发酵阶段和第二发酵阶段，
在第一发酵阶段中，向发酵罐中流加柠檬酸发酵培养基流加发酵菌种种子液，发酵菌种种子液由公知技术值得；
提高调整培养基和种子液的流加速率，进入第二发酵阶段，当发酵液中柠檬酸的酸度为160g/l，且残果糖含量为2g/l时，停止发酵。
所述第一发酵阶段发酵完成时，发酵液中的柠檬酸的酸度为100g/l，还果糖浓度为40g/l。
所述提高调整培养基和种子液的流加速率为0.6kg/小时。
所述在第一发酵阶段和第二发酵阶段之间补充发酵培养基。
所述高粱秸秆水解液制备方法为：将高粱秸秆粉碎，过200目筛，然后添加两倍重量的浓度为10的氨水，220rpm搅拌水解9小时，最后添加盐酸，调节溶液的ph为6.9，即可。
所述贝壳粉的细度为120目。
所述玉米浆提取物的制备方法为：将玉米粉碎，高温消毒，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡1.5小时，随后添加占玉米1%重量份的α-淀粉酶，升温至60℃，水解45min，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即可。
所述玉米为鲜玉米。
本实施例的发酵方法与现有的间歇发酵方法相比较：
本实施例将8×105-12.5×105l的发酵培养基发酵至柠檬酸的酸度为160g/l，且残果糖含量为2g/l时，发酵所需的时间为54小时；
间歇发酵方法将同等体积相同组分的发酵培养基发酵至柠檬酸的酸度为160g/l，且残果糖含量为2g/l时，发酵所需的时间为73小时。
实施例3
本实施例提供的一种生物发酵法制备柠檬酸的方法，包括如下步骤：
步骤（1）取发酵培养基原料：按照重量百分比取各原料备用，其中：高粱秸秆水解液8%，果糖4%，玉米浆提取物1%，贝壳粉0.02%，硫酸钠0.02%，磷酸二氢钾0.01%；
步骤（2）制备发酵培养基：将高粱秸秆水解液，果糖，玉米浆提取物，贝壳粉，硫酸钠以及磷酸二氢钾按照比例混合，搅拌均匀，然后在温度80℃、维持时间20分钟进行灭菌处理，再降温至30℃，制得发酵培养基；
步骤（3）发酵制备柠檬酸：发酵菌种按照7％的接种量接入发酵培养基中，发酵42小时，得到柠檬酸发酵液。
所述发酵分连续的多阶段进行，包括第一发酵阶段和第二发酵阶段，
在第一发酵阶段中，向发酵罐中流加柠檬酸发酵培养基流加发酵菌种种子液，发酵菌种种子液由公知技术值得；
提高调整培养基和种子液的流加速率，进入第二发酵阶段，当发酵液中柠檬酸的酸度为165g/l，且残果糖含量为1g/l时，停止发酵。
所述第一发酵阶段发酵完成时，发酵液中的柠檬酸的酸度为50g/l，还果糖浓度为70g/l。
所述提高调整培养基和种子液的流加速率为0.6kg/小时。
所述在第一发酵阶段和第二发酵阶段之间补充发酵培养基。
所述高粱秸秆水解液制备方法为：将高粱秸秆粉碎，过150目筛，然后添加两倍重量的浓度为12的氨水，220rpm搅拌水解7小时，最后添加盐酸，调节溶液的ph为7.0，即可。
所述贝壳粉的细度为100目。
所述玉米浆提取物的制备方法为：将玉米粉碎，高温消毒，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡1.5小时，随后添加占玉米1%重量份的α-淀粉酶，升温至60℃，水解45min，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即可。
所述玉米为鲜玉米。
本实施例的发酵方法与现有的间歇发酵方法相比较：
本实施例将8×105-12.5×105l的发酵培养基发酵至柠檬酸的酸度为165g/l，且残果糖含量为1g/l时，发酵所需的时间为56小时；
间歇发酵方法将同等体积相同组分的发酵培养基发酵至柠檬酸的酸度为165g/l，且残果糖含量为1g/l时，发酵所需的时间为72小时。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。