一种大鼠Rap1b基因重组腺病毒、质粒、构建方法及应用与流程

本发明属于生物技术构建领域，具体涉及一种大鼠rap1b基因重组腺病毒、质粒、构建方法及应用。
背景技术：
：基因转导技术方法是研究基因功能的重要手段。基因转导技术方法的本质就是一个我们选择研究的目的基因的功能，具体方法是将已克隆的目的基因转移至体外培养的细胞中或者体内，并且加入gfp荧光显示报告，以方便观察目的基因的过表达情况，研究该基因对相关功能的影响。从而进一步提高研究人员对目的基因的深入认识，为后续试验做好基础。目前常见的病毒载体包括逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺病毒载体等，各类载体都有自己的优缺点。肝细胞肝癌基因治疗中报告最多的一种病毒载体，采用体外制备滴度较大，装载外源基因容量最大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易该病毒引起宿主免疫反应而使转染效率下降，且大剂量静脉给予可导致严重的肝脏炎症反应，使其应用受到限制。rap是ras超家族成员之一，rap又被分成rap1和rap2。rap1又分为两个亚型：rap1a和rap1b。许多学者研究发现，rap1b引起细胞增殖、分化、转化、凋亡等生物学反应方面都发生着各种变化，rap1b的缺失可以导致细胞生长、细胞增殖及相关信号通路(erk)受阻。因此，开发rap1b基因的重组病毒质粒，在肝细胞增殖中方面具有良好的应用前景。技术实现要素：本发明的目的是提供一种大鼠rap1b基因重组腺病毒、质粒、构建方法及应用，大鼠rap1b基因重组腺病毒转染效率高，可以作为基因治疗药物，实现基因干涉。本发明提供了一种大鼠rap1b基因重组腺病毒，大鼠rap1b基因重组腺病毒质粒是先将如seqidno.1所示的rap1bcds区全长基因序列插入到pmd18-t载体中，得到重组克隆质粒pmd-rap1b；然后将重组克隆质粒pmd-rap1b用bamhi和ecori双酶切后，回收的目的基因片段插入到pshuttle-cmv-egfp重组穿梭载体中得到重组穿梭质粒pshuttle-gfp-ratrap1b；最后将重组穿梭质粒pshuttle-gfp-ratrap1b用i-ceui和i-scei双酶切后，回收的长序列片段的rap1b基因片段插入padxsi重组腺病毒骨架载体中后得到的。本发明还提供了一种上述大鼠rap1b基因重组腺病毒质粒构建方法，具体包括以下步骤：步骤1，采用基因合成技术人工合成rap1bcds区全长基因序列，所述rap1bcds区全长基因序列如seqidno.1所示；步骤2，rap1b基因的克隆将所述rap1bcds区全长基因序列与pmd18-t载体连接，然后转化入感受态大肠杆菌dh5α中，构建得到重组克隆质粒pmd-rap1b；步骤3，重组穿梭质粒的构建将重组质粒pmd-rap1b用bamhi和ecori双酶切，凝胶回收目的基因片段；将pshuttle-cmv-egfp重组穿梭载体用bamhi和ecori双酶切，cip去磷酸化，凝胶回收5.2kb的载体片段；用t4dna连接酶将目的基因片段和载体片段连接，构建得到重组穿梭质粒pshuttle-gfp-ratrap1b；步骤4，重组腺病毒质粒的构建将重组穿梭质粒pshuttle-gfp-ratrap1b用i-ceui和i-scei双酶切，凝胶回收长序列片段的rap1b基因片段；将padxsi重组腺病毒骨架载体用i-ceui和i-scei双酶切，凝胶回收长序列片段的padxsi载体片段；用t4dna连接酶将rap1b基因片段和padxsi载体片段连接，构建得到重组腺病毒质粒pad-cmv-rap1b。本发明还提供了一种利用上述大鼠rap1b基因重组腺病毒质粒制备得到的大鼠rap1b基因重组腺病毒。本发明还提供了上述大鼠rap1b基因重组腺病毒质粒在制备促进肝细胞增殖药物中的应用。本发明还提供了上述大鼠rap1b基因重组腺病毒在制备促进肝细胞增殖药物中的应用。与现有技术相比，本发明提供的一种大鼠rap1b基因重组腺病毒、质粒、构建方法及应用，具有以下有益效果：1、本发明构建的大鼠rap1b基因重组腺病毒质粒在大鼠肝脏细胞中的过表达，过表达之后，有助于探析rap1b的功能，确定其是否在动物应激发生过程中可作为一个分子开关启动动物细胞功能的改变，可以抵御应激刺激。2、本发明制备的大鼠rap1b基因重组腺病毒滴度高，能够达到1.2×1010pfu/ml，采用的是一种常用的病毒质粒，已经改造好，不致癌，不会导致肝脏炎症反应。附图说明图1是重组腺病毒质粒pad-cmv-rap1b的阳性克隆结果；其中，泳道m为marker，泳道1为阳性克隆；图2是重组腺病毒质粒pad-cmv-rap1b的阴性克隆结果；其中，泳道m为marker，泳道1为阴性克隆；图3不同病毒转染brl大鼠肝细胞系的20×倍荧光显微观察结果；其中，图3a为大鼠rap1b基因重组腺病毒组，图3b为padxsi-cmv-null空载组，图3c为对照组；图4是荧光定量pcr检测rap1bmrna表达量的结果；其中，1组表示大鼠rap1b基因重组腺病毒组，2组表示padxsi-cmv-null空载组，3组表示对照组；图5是westernblotting检测rap1b的蛋白表达的图谱；其中，1道表示大鼠rap1b基因重组腺病毒组，2道表示padxsi-cmv-null空载组，3道表示对照组；图6是westernblotting检测rap1b的蛋白表达量的分析图；其中，1组表示大鼠rap1b基因重组腺病毒组，2组表示padxsi-cmv-null空载组，3组表示对照组。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的实验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。下述实施例中bamhi酶、ecori酶、i-ceui酶、i-scei酶、连接缓冲液、酶切缓冲液(10×buffer)、ripa裂解液、bca蛋白浓度测定试剂盒均购自上海碧云天生物技术公司，rap1b单克隆抗体(mcab)、兔抗大鼠β-actin、山羊抗兔二抗igg等均购自英国abcam股份有限公司，pshuttle-cmv-egfp重组穿梭载体和padxsi重组腺病毒骨架载体均购自诺赛基因组研究中心有限公司，brl大鼠肝细胞系购自中国科学院上海细胞库，大肠埃希菌top10、感受态大肠杆菌dh5α、cbrh-7919细胞购自全氏金生物技术有限公司，hek293细胞株购自上海汉恒。本发明提供了一种大鼠rap1b基因重组腺病毒质粒，大鼠rap1b基因重组腺病毒质粒是先将如seqidno.1所示的rap1bcds区全长基因序列插入到pmd18-t载体中，得到重组克隆质粒pmd-rap1b；然后将重组克隆质粒pmd-rap1b用bamhi和ecori双酶切后，回收的目的基因片段插入到pshuttle-cmv-egfp重组穿梭载体中得到重组穿梭质粒pshuttle-gfp-ratrap1b；最后将重组穿梭质粒pshuttle-gfp-ratrap1b用i-ceui和i-scei双酶切后，回收的长序列片段的rap1b基因片段插入padxsi重组腺病毒骨架载体中后得到的。大鼠rap1b基因重组腺病毒质粒及病毒的构建具体包括：步骤1，采用基因合成技术人工合成rap1bcds区全长基因序列，所述rap1bcds区全长基因序列如seqidno.1所示；步骤2，rap1b基因的克隆将所述rap1bcds区全长基因序列与pmd18-t载体连接，然后转化入感受态大肠杆菌dh5α中，构建得到重组克隆质粒pmd-rap1b；具体为：将合成后的rap1bcds区全长基因序列、pmd18-t载体、连接缓冲溶液混合，然后16℃水浴过夜(12h)即可，该克隆步骤的具体操作步骤采用常规手段。由上海生工公司测序，测序结果应用dnastar软件进行序列分析和比对。步骤3，重组穿梭质粒的构建将重组质粒pmd-rap1b用bamhi和ecori双酶切，凝胶回收目的基因片段，其酶切体系如表1所示，酶切体系在37℃下反应1h；将pshuttle-cmv-egfp重组穿梭载体用bamhi和ecori双酶切，按照常规方法cip去磷酸化，凝胶回收5.2kb的载体片段，其酶切体系如表2所示，酶切体系在37℃下反应1h；用t4dna连接酶将目的基因片段和载体片段连接，构建得到重组穿梭质粒pshuttle-gfp-ratrap1b。表1重组质粒pmd-rap1b的酶切体系重组质粒pmd-rap1b(500ng/μl)4μlbamhi1μlecori1μl10×buffer2μlddh2o12μl总体系20μl表2pshuttle-cmv-egfp重组穿梭载体的酶切体系pshuttle-cmv-egfp重组穿梭载体(500ng/μl)4μlbamhi1μlecori1μl10×buffer2μlddh2o12μl总体系20μl步骤4，重组腺病毒质粒的构建将重组穿梭质粒pshuttle-gfp-ratrap1b用i-ceui和i-scei双酶切，凝胶回收长序列片段的rap1b基因片段，其酶切体系如表3所示，酶切体系在37℃下反应1h；将padxsi重组腺病毒骨架载体用i-ceui和i-scei双酶切，凝胶回收长序列片段的padxsi载体片段，其酶切体系如表4所示，酶切体系在37℃下反应1h；用t4dna连接酶将rap1b基因片段和padxsi载体片段连接，转化感受态大肠杆菌dh5α，构建得到重组腺病毒质粒pad-cmv-rap1b。采用质粒抽提试剂盒(axygen公司)提取重组腺病毒质粒，并采用xhoi对其酶切鉴定。xhoi对其酶切的鉴定结果如下：根据重组腺病毒质粒pad-cmv-rap1b的序列分析携带目的基因表达框的阳性克隆被xhoi酶切后应该有以下7条带组成，阳性克隆：14.5kb、11.7kb、3.2kb、2.66kb、2.47kb、1.45kb、0.6kb，参见图1，其中，泳道m为marker，泳道1为阳性克隆；没有重组的腺病毒空载体应该由以下6条带组成：阴性克隆：14.5kb、11.7kb、4.0kb、2.47kb、1.45kb、0.6kb，参见图2。表3重组穿梭质粒pshuttle-gfp-ratrap1b的酶切体系重组穿梭质粒pshuttle-gfp-ratrap1b(500ng/μl)4μli-ceui1μli-scei1μl10×buffer2μlddh2o12μl总体系20μl表4重组腺病毒质粒pad-cmv-rap1b的酶切体系重组腺病毒质粒pad-cmv-rap1b(500ng/μl)4μli-ceui1μli-scei1μl10×buffer2μlddh2o12μl总体系20μl步骤5，大鼠rap1b基因重组腺病毒的制备步骤5.1，用t4dna连接酶将穿梭质粒片段和骨架载体片段连接，转化感受态大肠杆菌dh5α，接种于含100μg/ml青霉素的lb培养基中，37℃、300rpm震荡摇菌过夜(12h)，构建得到重组腺病毒质粒pad-cmv-rap1b。通过显微镜观察，当细胞生长到对数生长期时，采用质粒抽提试剂盒大量抽提、纯化重组腺病毒质粒pad-cmv-rap1b，抽提、纯化步骤按照质粒抽提试剂盒操作说明进行，具体如下：(1)取对数生长期的菌液150ml，装入合适的离心瓶中，4500-6000rpm于4℃离心10min沉淀菌体，完全弃除上清。加入5mlbufferi，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。细菌悬液移入50ml离心管中。加入5mlbufferii，轻轻颠倒离心管6-8次，室温放置5min，使细菌完全裂解，溶液透明。加入5mlbufferiii，立即颠倒离心管6-8次，充分混匀，至白色絮状物产生。冰上放置10-15min。上述裂解液于4℃、12000-16000rpm离心15min，小心吸出上清，移入新的50ml离心管中。加入10ml异丙醇，颠倒离心管，充分混匀。冰上放置10-15min。于4℃、12000-16000rpm离心10min，小心弃去上清，倒置轻轻沥干残余液体，加入0.5mlbufferi，完全溶解沉淀团块(可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)。移入新的1.5ml离心管中，室温放置10-20min。质粒粗提物用台式离心机室温高速离心2min，上清移入新的1.5ml离心管中，得到质粒粗提液。(2)质粒纯化：取0.5ml质粒粗提液中加入100μlbufferiv(杂质清除液a)，轻轻混匀，12000rpm离心2min，将上清液转移至新的离心管中。再加入100μlbufferiv(杂质清除液a)，轻轻混匀，12000rpm离心5min，将上清液转移至新的离心管中。加入70μlbufferv(杂质清除液b)，轻轻混匀，12000rmp离心5min，将上清液转移至新的离心管中。加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm室温离心10min，弃去上清液，用70％乙醇1ml轻轻洗涤，弃去液体，室温倒置凉干5min。0.5mlte溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡或用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)。加入200μlbuffervi(杂质清除液c)，混匀后冰上放置10-30min，12000rpm室温离心10min，弃去上清液，轻轻加入1ml70％乙醇洗涤两次，室温倒置凉干5-10min使乙醇完全蒸发。加适量te(200-500μl)溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡以辅助溶解)，得到第一代毒种p1。步骤5.2，腺病毒大量扩增步骤5.2.1，培养细胞密度大于等于90％的hek293细胞，将第一代毒种p1接种于hek293细胞培养液(dmem完全培养液+10％胎牛血清，其中胎牛血清的终体积浓度为10％)内，37℃水浴培养，24h后显微镜下观察发现有60％细胞病变，46h后细胞完全病变。步骤5.2.2，收获完全病变细胞混悬液，2000rpm离心5min，离心，弃上清，加入6mlbuffer(dmem完全培养液+10％胎牛血清+2.5％甘油，其中胎牛血清的终体积浓度为10％，甘油的终体积浓度为2.5％)，混匀，交替置于-80℃和37℃条件下冻融，其中-80℃和37℃分别放置3次，3000rpm离心5min，收集上清毒液，得到第二代毒种p2。步骤5.2.3，将第二代毒种p2接种于细胞密度大于等于90％的hek293细胞中，37℃水浴培养，46h完全病变。收获完全病变细胞混悬液，2000rpm离心5分钟，离心，弃上清，加入6mlbuffer(dmem完全培养液+10％胎牛血清+2.5％甘油，其中胎牛血清的终体积浓度为10％，甘油的终体积浓度为2.5％)，混匀，交替置于-80℃和37℃条件下冻融，其中-80℃和37℃分别放置3次，3000rpm离心5min，收集上清毒液，收集第三代毒种p3。检测第三代毒种p3的滴度达到1010pfu/ml，所述第三代毒种p3即为大鼠rap1b基因重组腺病毒。-80℃保存备用。步骤5.3，第三代毒种p3鉴定步骤5.3.1，滴度检测对上述方法制备而成的大鼠rap1b基因重组腺病毒的滴度进行检测，测定重组腺病毒的a260和a280值，计算a260/a280比值，反应病毒的纯度；将重组腺病毒10倍稀释后，按下式计算病毒的颗粒滴度；采用reed-muench法测定重组腺病毒的tcid50值，并计算病毒的感染性滴度。病毒颗粒滴度(vp/ml)＝a260×稀释倍数×1.2×1010。经检测计算，大鼠rap1b基因重组腺病毒的滴度可达1.2×1010pfu/ml。步骤5.3.2，大鼠rap1b基因重组腺病毒对brl大鼠肝细胞系感染情况,取体外培养1周的brl大鼠肝细胞系，以每孔1×106个细胞接种于细胞培养6孔板，37℃、5％co2培养箱中培养过夜。共分为大鼠rap1b基因重组腺病毒组、padxsi-cmv-null空载组和对照组共三组，每组3个重复孔。大鼠rap1b基因重组腺病毒组滴加滴度为1.2×109的大鼠rap1b基因重组腺病毒5μl，padxsi-cmv-null空载组加入padxsi重组腺病毒骨架载体5μl，对照组则加入超纯水5μl，在37℃，5％co2培养箱中常规培养。培养48h后，弃去旧液，大鼠rap1b基因重组腺病毒组、padxsi-cmv-null空载组和对照组分别收样，荧光显微镜观察感染效果并拍照，结果参见图3，其中，图3a为大鼠rap1b基因重组腺病毒组，图3b为padxsi-cmv-null空载组，图3c为对照组。荧光显微镜下可见大鼠rap1b基因重组腺病毒组、padxsi-cmv-null空载组中均有绿色荧光蛋白表达，发绿色荧光的细胞占总数细胞的90％以上，对照组则观察不到荧光现象，说明构建的重组腺病毒有效的感染了brl大鼠肝细胞系，同时对细胞活性没有明显影响。下面，我们通过一些实验数据，来验证本发明大鼠rap1b基因重组腺病毒质粒的效果：一、大鼠rap1b基因重组腺病毒对大鼠肝脏细胞中rap1bmrna表达量的影响提取收集步骤5.3.2中被大鼠rap1b基因重组腺病毒感染的brl大鼠肝细胞系，利用trizol法其中总rna，并反转录试剂盒将总rna进行反转合成cdna，然后以cdna为模板，进行荧光定量pcr反应。荧光定量pcr反应体系见表5，反应液配制在冰上进行，每个模板均重复三次。荧光定量pcr引物序列如下：rap1b上游引物(如seqidno.2所示)：5′-gacaaggctttgcgttggtt-3′，rap1b下游引物(如seqidno.3所示)：5′-ttgggacatcgtcagtgtct-3′，pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸20s，45个循环。荧光定量pcr的其他步骤均按照常规方法进行，结果如图4所示，结果表明，大鼠rap1b基因重组腺病毒组表达量极显著高于padxsi-cmv-null空载组和对照组(p<0.01)，padxsi-cmv-null空载组和对照组的mrna表达量差异不显著。说明大鼠rap1b基因重组腺病毒穿透力强，可以促进动物细胞中rap1b基因的大量表达。表5荧光定量pcr扩增体系组成成分体积(μl)sybr荧光染料12.5上游引物1.0下游引物1.0模板cdna2.0无菌水8.5总体积25.0四、大鼠rap1b基因重组腺病毒对大鼠肝脏细胞中rap1b蛋白表达量的影响利用westernblot检测过表达效率，设计对照组、大鼠rap1b基因重组腺病毒组、padxsi-cmv-null空载组，每组3个重复孔。大鼠rap1b基因重组腺病毒组滴加感染复数(multiplicityofinfection，moi)为400的大鼠rap1b基因重组腺病毒，padxsi-cmv-null空载组滴加感染复数(multiplicityofinfection，moi)为400的padxsi重组腺病毒骨架载体，空白对照组则无病毒感染(添加超纯水)，培养36h后，弃掉培养基，用pbsbuffer清洗cbrh-7919细胞3次，并收集各组细胞至离心管内。向各离心管加入含0.1mmol/lpmsf的ripa裂解液(1％tritonx-100、50mmol/ltris·hclph8.0、150mmol/lnacl、0.5％sds)，吹打均匀后4℃静置20min；超声波破碎10s后，冰置30min。12000g离心2次，10min/次，弃沉淀，留上清。取5μl上清液用bca蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，结果确定上样量为60μg。将蛋白样品进行6％sds-page凝胶电泳，结束后将凝胶电转移(4℃，70v，2.5h)至pvdf膜上。最后按照常规方法进行抗原抗体反应，包括：(1)封闭：将pvdf膜浸泡在5％的脱脂奶粉中，在摇床上缓慢摇荡2h。(2)洗涤：封闭结束后，将膜放在tbst中洗涤3次，每次洗涤10min。(3)一抗的稀释：将rap1b的一抗按1:500稀释，兔抗大鼠β-actin的一抗按1:3000稀释，备用。(4)结合一抗：在孵育盒上滴加适量的稀释好的一抗，将pvdf膜正面朝下贴在一抗上，操作时注意避免气泡产生。然后在37℃轻摇孵育1h。(5)二抗的稀释：按照1:5000比例将hrp标记的二抗进行稀释，备用。(6)剪膜：因为rap1b蛋白条带的大小为21kd，而β-actin的蛋白条带大小为42kd，所以裁剪pvdf膜时以marker为参照标准，在marker大小为21～42kd左右将膜剪成上下两部分，做好标记。(7)结合二抗：将剪好的两部分pvdf膜分别放在稀释好的二抗中，37℃轻摇孵育1h。(8)洗涤：待二抗孵育结束后，将膜放在tbst中洗涤3次，每次洗涤10min。(9)hrp-ecl发光显色取适当的溶液a和溶液b按1:1的比例混合。将混合好的发光液滴加在保鲜膜上，1min后，将pvdf膜蛋白面与发光液充分接触，避免产生气泡，避光作用1min左右，将膜放在凝胶成像系统中曝光拍照。(10)蛋白条带灰度值分析应用imagej软件对结果中的蛋白条带进行灰度值分析。两组样品rap1b的蛋白表达水平以其与β-actin二者之间的灰度值比值表示。(11)统计分析试验所得数据采用spss19.0统计软件，运用配对样本t检验方法进行统计分析，试验数据用平均数±标准差表示，当p<0.05和p<0.01时分别代表两组间差异水平发生显著和极显著变化。采用westernblotting检测实验各组rap1b的蛋白表达情况，分析westernblotting结果，结果分别如图5和图6所示，图5是westernblotting检测rap1b的蛋白表达的图谱，其中，1道表示大鼠rap1b基因重组腺病毒组，2道表示padxsi-cmv-null空载组，3道表示对照组。图5中能够明显的看到rap1b蛋白条带，说明可以良好的表达rap1b蛋白，大鼠rap1b基因重组腺病毒组、padxsi-cmv-null空载组条带较弱，说明其rap1b蛋白量较低。图6是westernblotting检测rap1b的蛋白表达量的分析图，其中，1组表示大鼠rap1b基因重组腺病毒组，2组表示padxsi-cmv-null空载组，3组表示对照组。大鼠rap1b基因重组腺病毒组的rap1b蛋白表达量极显著高于空载体组和对照组(p<0.01)，padxsi-cmv-null空载组和对照组的表达量差异不显著。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。序列表<110>黑龙江八一农垦大学<120>一种大鼠rap1b基因重组腺病毒、质粒、构建方法及应用<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>555<212>dna<213>人工序列<400>1atgcgtgaatataagctagtcgttcttggctcaggaggtgttgggaagtcggctctgact60gtacagtttgttcaaggaatttttgttgaaaaatatgatcctacgatagaagattcttat120agaaagcaagttgaagtagatgcacagcagtgtatgcttgaaatcctggatactgcagga180acggagcagtttacagccatgagagatctgtacatgaagaacggacaaggctttgcgttg240gtttactccatcacagcacagtcgacatttaatgacttacaggatctaagagagcagatt300cttcgggttaaagacactgacgatgtcccaatgattctggttggtaacaaatgcgacctg360gaagacgaaagagttgtcgggaaggaacaaggtcagaacctggcaagacagtggagcaac420tgcgctttcttagagtcctccgccaagtccaagataaatgttaacgagatcttttatgac480ctagtgcggcaaattaacagaaaaaccccagtgcctgggaaggcccgcaaaaagtcatca540tgtcagctgctttaa555<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gacaaggctttgcgttggtt20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ttgggacatcgtcagtgtct20当前第1页12