一种利用茶多酚调控红曲霉产红曲色素的方法与流程

本发明属于微生物发酵领域，更具体地，本发明涉及一种利用茶多酚调控红曲霉产色素的方法。

背景技术：

红曲霉(monascus)是一种小型丝状腐生真菌，在发酵过程中能够产生具有生理活性的次级代谢产物，包括红曲色素、洛伐他汀类化合物（monacolink）、γ-氨基丁酸（gaba）、麦角甾醇、生物黄酮等，具有诸多保健功效。在这些次级代谢产物当中最独特，且功能最丰富的成分是红曲色素。它颜色鲜亮、对蛋白质着色能力强，大量研究数据表明红曲色素具有抑菌防腐、抗氧化、抗炎症、降血脂、调节血糖、预防动脉硬化等生理活性。

茶多酚又名茶单宁、茶鞣质，是从天然植物茶叶中提取的多羟基酚类及其衍生物的混合物。其具有多种生物活性，包括抗氧化、抗肥胖、防辐射、抗菌消炎等，在各领域具有广阔的应用前景和开发价值。

在许多研究或专利中，利用茶多酚的抗氧化性作为红曲色素的护色剂，或者在发酵过程加入其他抗氧化剂，未见有关茶多酚调控红曲霉菌发酵过程提高红曲色素产量的相关专利或研究。本发明利用茶多酚调控红曲霉发酵过程中红曲色素的产量，在提高产品整体价值的同时，也为后续红曲色素产业化的发展奠定基石。

技术实现要素：

为了提高红曲色素的产量，本发明提供了一种利用茶多酚调控红曲霉发酵过程中产红曲色素的方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

一种利用茶多酚调控红曲霉产红曲色素的方法，包括如下步骤：

（1）菌株活化

取红曲霉菌株于无菌条件下转接到pda斜面培养基中培养，得到的斜面红曲霉菌株在无菌条件下于pda平板转接扩大培养；

（2）孢子悬浮液的制备

将培养好的平板上的红曲霉菌株用孢子洗脱液洗下孢子，振荡、过滤后，得到均一的孢子悬浮液；

（3）红曲种子液的制备

将孢子悬浮液接种到种子培养基中，在一定条件下培养后制得种子液；

（4）发酵

将制备好的种子液接种到发酵培养基中进行液态或固态发酵，得到发酵红曲，其中发酵培养基成分包括茶多酚；

（5）发酵液指标测定

测定发酵液的色价、桔霉素和菌体生物量等。

所述的pda培养基配方为：称取去皮的马铃薯200g、切丁后加水煮沸30min以上，然后用8层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、琼脂18g，溶解、混匀后，蒸馏水定容至1000ml，分装后于121℃灭菌20min。

所述的斜面和平板培养条件为：28～34℃下培养4～8天。

所述的孢子洗脱液为浓度0.85wt.%的生理盐水且振荡时间为10～30min。

所述的孢子悬浮液中孢子浓度为10⁵～10⁹个/ml。

所述的种子培养基组成为：籼米粉30.00～40.00g/l，葡萄糖10.00～15.00g/l，黄豆粉10.00～15.00g/l，硝酸钠0.80～1.2g/l，磷酸二氢钾0.80～1.20g/l，七水合硫酸镁0.20～0.80g/l，其余为去离子水，121℃灭菌20min。

所述的孢子悬浮液接种量为5～10%（v/v），培养条件为28～34℃、150～250rpm条件下培养1～5天。

所述的发酵培养基组成为：味精15.00～25.00g/l，硫酸铵7.00～12.00g/l，籼米粉20.00～40.00g/l，七水合硫酸镁0.40～1.00g/l，磷酸二氢钾2.00～9.00g/l，一水合硫酸锰0.03～0.09g/l，葡萄糖10.00～18.00g/l，茶多酚0.10～3.00g/l，其余为去离子水，ph自然，于121℃灭菌20min。

所述的发酵培养基的接种量为5～10%（v/v），培养条件为28～34℃、150～250rpm条件下培养4～10天。

本发明中红曲霉色价的测定：

取5ml发酵液在4500r/min，10min条件下离心，得到的菌体沉淀用70%乙醇混匀后超声20min，之后于60℃条件下抽提2h，在4500r/min，10min条件下转速下离心得到上清液，上清液经70%乙醇稀释至适当倍数，用分光光度计分别在波长为410nm、465nm和510nm测定其吸光度值od410、od465和od510，分别乘以稀释倍数即为黄色素色价、橙色素色价和红色素色价。总色价=黄色素色价+橙色素色价+红色素色价。

本发明中红曲霉桔霉素的测定：

采用高效液相色谱法测定发酵物中的桔霉素含量，具体方法参考国家标准《红曲产品中桔青霉素的测定》gb/t5009.222-2008。

本发明中红曲霉菌体生物量的测定：

取5ml发酵物在4500r/min，10min条件下离心，收集的菌体用蒸馏水清洗数次，然后放置于烘箱中过夜烘干至恒重。在分析天平中称重即可得到菌体的干重。

本发明的显著优点在于：本发明利用茶多酚调控红曲霉发酵过程中红曲色素的产量，在提高产品整体价值的同时，也为后续红曲色素产业化的发展奠定基石。添加茶多酚发酵得到的红曲色素总量有显著提高，而桔霉素含量基本不变。

附图说明

图1红曲霉菌株fzu-mp1501在实施例1中的发酵结果。

图2红曲霉菌株fzu-mp1501在实施例2中的发酵结果。

图3红曲霉菌株l在实施例3中的发酵结果。

具体实施方式

实施例1

红曲霉菌株fzu-mp1501（专利201610872709.x中已公开）是本研究所从福建红曲中分离纯化得到的，经鉴定属于紫色红曲霉。

pda培养基配方为：称取去皮的马铃薯200g、切丁后加水煮沸30min以上，然后用8层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、琼脂18g、溶解、混匀后，蒸馏水定容至1000ml，分装后于121℃灭菌20min。

种子培养基组成为：籼米粉35.00g/l，葡萄糖12.00g/l，黄豆粉12.00g/l，nano31.00g/l，kh2po41.00g/l，mgso4·7h2o0.50g/l，其余为去离子水，121℃灭菌20min。

发酵培养基组成为：味精22.33g/l，硫酸铵9.72g/l，籼米粉30.00g/l，磷酸二氢钾3.00g/l，一水合硫酸锰0.07g/l，七水合硫酸镁0.70g/l，葡萄糖12.50g/l，茶多酚2.33g/l，其余为去离子水，ph自然，于121℃灭菌20min。

其具体步骤如下：取红曲霉菌株fzu-mp1501于无菌条件下转接到pda斜面培养基中培养3d，得到的斜面红曲霉菌株在无菌条件下于pda平板培养6d，所述的斜面和平板培养条件为：30℃下培养6天；用孢子洗脱液洗下孢子，得到浓度为10⁷个/ml的孢子悬浮液，以10%（v/v）的接种量接种到种子培养基，30℃、200rpm条件下培养2d，得到种子液；以5%（v/v）的接种量将种子液接种到发酵培养基，培养条件为30℃、200rpm条件下培养7天培养6d，得到发酵液，测定色价、桔霉素和生物量，结果如附图1所示。

由图1可以看到，茶多酚对红曲霉液态发酵过程中色素产量的影响效果很大，比不添加茶多酚的红曲霉液态发酵的色素提高了1倍以上，而二者的生物量和桔霉素含量差别不大。

实施例2

红曲霉菌株fzu-mp1501（专利201610872709.x中已公开）是本研究所从福建红曲中分离纯化得到的，经鉴定属于紫色红曲霉。

pda培养基配方为：称取去皮的马铃薯200g、切丁后加水煮沸30min以上，然后用8层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、琼脂18g、溶解、混匀后，蒸馏水定容至1000ml，分装后于121℃灭菌20min。

种子培养基组成为：籼米粉30.00g/l，葡萄糖10.00g/l，黄豆粉10.00g/l，硝酸钠0.80g/l，磷酸二氢钾0.80g/l，七水合硫酸镁0.20g/l，其余为去离子水，121℃灭菌20min。

发酵培养基组成为：味精18.00g/l，硫酸铵7.32g/l，籼米粉25.00g/l，磷酸二氢钾2.50g/l，一水合硫酸锰0.05g/l，七水合硫酸镁0.50g/l，葡萄糖10.00g/l，茶多酚1.60g/l，其余为去离子水，ph自然，于121℃灭菌20min。

其具体步骤如下：取红曲霉菌株fzu-mp1501于无菌条件下转接到pda斜面培养基中培养3d，得到的斜面红曲霉菌株在无菌条件下于pda平板培养6d，所述的斜面和平板培养条件为：28℃下培养4天；用孢子洗脱液洗下孢子，得到浓度为10⁹个/ml的孢子悬浮液，以5%（v/v）的接种量接种到种子培养基，培养条件为28℃、150rpm条件下培养2天，得到种子液；以10%（v/v）的接种量将种子液接种到发酵培养基，培养条件为32℃、150rpm条件下培养4天，得到发酵液，测定色价、桔霉素和生物量，结果如附图2所示。

由图2可以看到，添加茶多酚的红曲霉液态发酵后色素产量比不添加茶多酚的红曲霉液态发酵的色素提高了约65%，而二者的生物量和桔霉素含量差别不大。

实施例3

本实施例用到的菌株红曲霉菌株l在专利中201310034337.x已公开。

pda培养基配方为：称取去皮的马铃薯200g、切丁后加水煮沸30min以上，然后用8层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、琼脂18g、溶解、混匀后，蒸馏水定容至1000ml，分装后于121℃灭菌20min。

种子培养基组成为：籼米粉40.00g/l，葡萄糖15.00g/l，黄豆粉15.00g/l，硝酸钠1.2g/l，磷酸二氢钾1.20g/l，七水合硫酸镁0.80g/l，其余为去离子水，121℃灭菌20min。

发酵培养基组成为：味精25.00g/l，硫酸铵12.00g/l，籼米粉32.00g/l，磷酸二氢钾3.20g/l，一水合硫酸锰0.08g/l，七水合硫酸镁0.80g/l，葡萄糖15.00g/l，茶多酚3.00g/l，其余为去离子水，ph6.5，于121℃灭菌20min。

其具体步骤如下：取红曲霉菌株l于无菌条件下转接到pda斜面培养基中培养3d，得到的斜面红曲霉菌株在无菌条件下于pda平板培养6d，所述的斜面和平板培养条件为：34℃下培养8天；用孢子洗脱液洗下孢子，得到浓度为10⁵个/ml的孢子悬浮液，以10%（v/v）的接种量接种到种子培养基，培养条件为34℃、250rpm条件下培养4天，得到种子液；以5%（v/v）的接种量将种子液接种到发酵培养基，培养条件为28℃、250rpm条件下培养8天，得到发酵液，测定色价、桔霉素和生物量，结果如附图3所示。

由图3可以看到，添加茶多酚的红曲霉液态发酵后色素产量比不添加茶多酚的红曲霉液态发酵的色素提高了约85%，二者的桔霉素含量和生物量差别不大。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。