本发明涉及天然产物生物发酵技术领域，特别涉及一种富含人参皂苷RH2的发酵物的制备方法。
背景技术：
人参（Panax ginseng C. A. Mey）为五加科（Araliaceae）人参属植物，含有丰富的人参皂苷（Ginsenoside）、氨基酸、多糖及挥发油等营养成分，其中最主要的活性成分人参皂苷又可分为原人参二醇型、原人参三醇型和齐墩果烷型三种。白参经过蒸和晒的炮制后，变成红参，人参皂苷RH2是一种原人参二醇型低糖链皂苷单体，是红参中的特有成分，极其珍贵。研究表明，将人参皂苷RH2添加于化妆品中具有促进毛细血管血液循环，增加皮肤的营养供应，防止动脉硬化，调节皮肤水分平衡等作用，可延缓皮肤衰老，防止皮肤干燥脱水，增加皮肤的弹性，从而起到使皮肤光泽柔嫩，防止和减少皮肤皱纹的作用。
目前国内从红参中分离获得人参皂苷 RH2的产量极低，使得人参皂苷 RH2价格昂贵，极大的阻碍了其应用及发展。文献中报道过的人参皂苷RH2的制备方法，包括有酸水解法、碱水解法、微生物转化法、酶转化法及化学合成法等几种，但限于红参中RH2含量极低，一般红参中以干重计，每g红参中RH2含量仅为10-50ppm，因此亟待解决的关键需求是增加红参内的RH2含量，方便后期浓缩提纯。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种富含人参皂苷RH2的发酵物的制备方法，本方法解决了人参皂苷RH2产量极低的问题，并可实现绿色环保生产。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种富含人参皂苷RH2的发酵物的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
A、在无菌条件下，将人参内生真菌黑色附球孢菌（菌种编号：CICC 2616）接种到PDA培养基上，在20-30℃条件下供氧培养24-48h，氧浓度控制在0.020-0.040mol/L；将培养好的菌种接种到含有PDA培养基成分的发酵摇瓶中，置于气浴恒温振荡器内，在20-30℃，200r/min条件下供氧培养7-10d，氧浓度0.020-0.040mol/L；摇瓶培养得到菌种后，在相同条件下再次摇瓶培养，得扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基，扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基中人参内生真菌黑色附球孢菌菌浓度为1×104-1×105 CFU/mL；
B、将红参粉末和蒸馏水投入发酵罐中，投料比例为每15L蒸馏水中加入1kg红参粉末，将KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液加入发酵罐，调节发酵罐内料液pH=6.0-7.0，按每升料液3.0-5.0g的量投入纤维素酶，将料液加热至30-40℃，保温、酶解3-6h；酶解完成后，将料液加热至55-65℃灭酶活，然后降至室温；
C、无菌条件下，向反应釜内加入B步骤中初始投入红参粉末质量分数5.0-10.0%的扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基，加入B）步骤中初始投入红参粉末质量分数20.0-30.0%的MS液体培养基，所述MS液体培养基中含玉米淀粉5.0-10.0g/L，葡萄糖15.0-25.0g/L，胰蛋白胨5.0-10.0g/L；再次加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐内料液pH=6.0-8.0，温度控制在30-40℃，保温、供氧发酵36-72h，氧浓度控制在0.025-0.050mol/L，发酵完成降至室温，过滤去渣，得人参皂苷RH2发酵产物，干燥浓缩至水分含量低于0.5wt%；
D、将C步骤所得人参皂苷RH2发酵产物装入超临界萃取设备，按人参皂苷RH2发酵产物重量比的5%，加入无水乙醇（分析纯）作为夹带剂，进行萃取，将萃取产物在-50℃下冷冻干燥48h，得富含人参皂苷RH2的发酵物。
本发明方法制备的富含人参皂苷RH2的发酵物中人参皂苷RH2含量为20-25wt%，经过计算，制备后每g红参干粉的人参皂苷RH2产量为200-1000ppm，远远高出一般每g红参中10-50ppm的含量。
上述制备方法中所用黑色附球孢菌（Epicoccum nigrum）购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 2616；所用PDA培养基购于杭州百思生物技术有限公司；所用气浴恒温振荡器购于江苏杰瑞尔电器有限公司，型号SHZ-82；所用发酵罐购于南京润泽生物工程设备有限公司，型号RZY-XGX；所用红参粉末为韩国正官庄红参，自行粉碎至50目-100目；所用纤维素酶购于上海恒远生物科技有限公司，商品名Trichoderma Vride G，纯度99.99%，活力≥400u/mg；所用玉米淀粉（CAS 9005-25-8）购于阿拉丁试剂（上海）有限公司，试剂级；所用葡萄糖（CAS 50-99-7）购于阿拉丁试剂（上海）有限公司，纯度≥99.5%；所用胰蛋白胨（CAS 91079-40-2）购于阿拉丁试剂（上海）有限公司，试剂级；所用MS液体培养基为SIGMA公司生产，牌号M5519；所用真空干燥机购于常州日翔干燥设备有限公司，型号SZG-350；所用超临界CO2萃取设备购于南通杜欣新能源科技有限公司，型号DX120-50-01；所用冷冻干燥机购于美国LABCONCO公司，型号为FreeZone。
人参内生真菌是指在人参生长过程中生活在其组织内，对人参组织没有引起明显病害症状的真菌，在人参组织内代谢并产生某些特定天然产物。本发明中利用人参内生真菌黑色附球孢菌来发酵制备人参皂苷RH2，是由于黑色附球孢菌可从人参自身分离得到，具有定向生成人参皂甙RH2的性能。利用纤维素酶将原料红参粉末酶解，可以破坏其细胞壁，使红参细胞内部有效成分释放，为下一步的微生物发酵创造有利条件，能显著促进发酵效果，提高产量。利用超临界CO2萃取技术，对发酵产物进行有效分离，最后得到人参皂苷RH2含量高达20-25wt%的产物。
本发明提供了一条量产人参皂苷RH2的制备路线，利用人参内生真菌黑色附球孢菌对经酶解破壁的红参粉末进行发酵，再利用超临界CO2萃取技术，从发酵产物中分离得到高含量产物，其中人参皂苷RH2含量高达20-25wt%，回收率高于75.0%。
本发明解决了人参皂苷 RH2的产量极低的问题，本发明生产过程不引入有害溶剂，无大量废液产生，制备的富含人参皂苷RH2的发酵物质量稳定、成本低。
综上所述，本发明的有益效果如下：1. 利用人参内生真菌黑色附球孢菌发酵制备人参皂苷RH2，可有效提高红参中人参皂苷 RH2的含量极低的问题，相比从同等重量的红参的直接提取，可平均提高RH2产量20倍左右；2. 利用超临界CO2萃取技术对发酵产物进行有效分离，得到的发酵物中人参皂苷RH2的含量高达20-25wt%；本发明中制备方法工艺简便，操作简单，绿色无污染，易于规模化工业生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1：
一种富含人参皂苷RH2的发酵物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
A、在无菌条件下，将人参内生真菌黑色附球孢菌接种到PDA培养基上，在30℃条件下供氧培养36h，氧浓度0.040mol/L；将培养好的菌种接种到含有PDA培养基成分的发酵摇瓶中，置于气浴恒温振荡器内，在25℃，200r/min条件下供氧培养7d，氧浓度0.040mol/L；摇瓶培养得到菌种后在相同条件下再次摇瓶培养，得扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基,扩培后培养基中人参内生真菌黑色附球孢菌菌浓度为1*104 CFU/mL；
B、将3.0kg红参粉末与45L蒸馏水投入发酵罐中，再将KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液加入发酵罐，调节发酵罐内料液pH=6.5，按每升料液5.0g的量投入纤维素酶，将料体加热至35℃，保温，酶解3h；酶解完成后，将料液加热至55℃，灭酶活，然后降温至室温；
C、无菌条件下，向反应釜内加入B）步骤中初始投入红参粉末质量分数10.0%的扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基，加入B）步骤中初始投入红参粉末质量分数30.0%的MS液体培养基，所述MS液体培养基中含玉米淀粉8.0g/L，葡萄糖25.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L；再次加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐内料液pH=7.0，温度控制在35℃，保温、供氧发酵48h，氧浓度0.040mol/L，发酵完成降至室温，过滤去渣，得人参皂苷RH2发酵产物，干燥浓缩至水分含量低于0.5wt%；
D、将C）步骤所得人参皂苷RH2发酵产物装入超临界萃取设备，加入人参皂苷RH2发酵产物重量的5%的无水乙醇（分析纯）作为夹带剂，进行萃取，将萃取产物在-50℃下冷冻干燥48h，得富含人参皂苷RH2的发酵物12g。
本实施例制备的产物中人参皂苷RH2含量为25wt%，经过计算，每g红参干粉的人参皂苷RH2产量为1000ppm。
实施例2：
一种富含人参皂苷RH2的发酵物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
A、在无菌条件下，将人参内生真菌黑色附球孢菌接种到PDA培养基上，在20℃条件下供氧培养48h，氧浓度0.03mol/L；将培养好的菌种接种到含有PDA培养基成分的发酵摇瓶中，置于气浴恒温振荡器内，在30℃，200r/min条件下供氧培养10d，氧浓度0.03mol/L，摇瓶培养得到菌种后在相同条件下再次摇瓶培养，得扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基，扩培后培养基中人参内生真菌黑色附球孢菌菌浓度为3*104 CFU/mL；
B、将3.0kg红参粉末与45L蒸馏水投入发酵罐中，再将KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液加入发酵罐，调节发酵罐内料液pH=7.0，按每升料液4.0g的量投入纤维素酶，将料体加热至30℃，保温，酶解5h；酶解完成后，将料液加热至60℃，灭酶活，然后降温至室温；
C、无菌条件下，向反应釜内加入B）步骤中初始投入红参粉末质量分数5.0%的扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基，加入B）步骤中初始投入红参粉末质量分数20.0%的MS液体培养基，所述MS液体培养基中含玉米淀粉10.0g/L，葡萄糖15.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L；再次加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐内料液pH=6.0，温度控制在40℃，保温、供氧发酵72h，氧浓度0.050mol/L，发酵完成降至室温，过滤去渣，得人参皂苷RH2发酵产物，干燥浓缩至水分含量低于0.5wt%；
D、将C）步骤所得人参皂苷RH2发酵产物装入超临界萃取设备，加入人参皂苷RH2发酵产物重量的5%的无水乙醇（分析纯）作为夹带剂，进行萃取，将萃取产物在-50℃下冷冻干燥48h，得富含人参皂苷RH2的发酵物3.0g。
本实施例制备的产物中人参皂苷RH2含量为20wt%，经过计算，每g红参干粉的人参皂苷RH2产量为200ppm。
实施例3：
一种富含人参皂苷RH2的发酵物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
A、在无菌条件下，将人参内生真菌黑色附球孢菌接种到PDA培养基上，在25℃条件下供氧培养24h，氧浓度0.020mol/L。将培养好的菌种接种到含有PDA培养基成分的发酵摇瓶中，置于气浴恒温振荡器内，在20℃，200r/min条件下供氧培养8d，氧浓度0.020mol/L，摇瓶培养得到菌种后在相同条件下再次摇瓶培养，得扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基，扩培后培养基中人参内生真菌黑色附球孢菌菌浓度为6*104 CFU/mL；
B、将3.0kg红参粉末与45L蒸馏水投入发酵罐中，再将KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液加入发酵罐，调节发酵罐内料液pH=6.0，按每升料液3.0g的量投入纤维素酶，将料体加热至40℃，保温，酶解6h；酶解完成后，将料液加热至65℃，灭酶活，然后降温至室温；
C、无菌条件下，向反应釜内加入B）步骤中初始投入红参粉末质量分数7.5%的扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基，加入B）步骤中初始投入红参粉末质量分数25.0%的MS液体培养基，所述MS液体培养基中含玉米淀粉5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L；再次加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐内料液pH=8.0，温度控制在30℃，保温、供氧发酵36h，氧浓度0.0250mol/L，发酵完成降至室温，过滤去渣，得人参皂苷RH2发酵产物，干燥浓缩至水分含量低于0.5wt%；
D、将C）步骤所得人参皂苷RH2发酵产物装入超临界萃取设备，加入人参皂苷RH2发酵产物重量的5%的无水乙醇（分析纯）作为夹带剂，进行萃取，将萃取产物在-50℃下冷冻干燥48h，得富含人参皂苷RH2的发酵物7.10g。
本实施例制备的产物中人参皂苷RH2含量为22wt%，经过计算，每g红参干粉的人参皂苷RH2产量为520ppm。
实施例4：
一种富含人参皂苷RH2的发酵物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
A、在无菌条件下，将人参内生真菌黑色附球孢菌接种到PDA培养基上，在25℃条件下供氧培养48h，氧浓度0.03mol/L。将培养好的菌种接种到含有PDA培养基成分的发酵摇瓶中，置于气浴恒温振荡器内，在25℃，200r/min条件下供氧培养8d，氧浓度0.03mol/L，摇瓶培养得到菌种后在相同条件下再次摇瓶培养，得扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基，扩培后培养基中人参内生真菌黑色附球孢菌菌浓度为1*105 CFU/mL；
B、将3.0kg红参粉末与45L蒸馏水投入发酵罐中，再将KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液加入发酵罐，调节发酵罐内料液pH=6.5，按每升料液4.5g的量投入纤维素酶，将料体加热至35℃，保温，酶解4h；酶解完成后，将料体加热至55℃，灭酶活，然后降温至室温；
C、无菌条件下，向反应釜内加入B）步骤中初始投入红参粉末质量分数9.0%的扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基，加入B）步骤中初始投入红参粉末质量分数28.0%的MS液体培养基，所述MS液体培养基中含玉米淀粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，胰蛋白胨8.0g/L；再次加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐内料液pH=7.0，温度控制在35℃，保温、供氧发酵48h，氧浓度0.030mol/L，发酵完成降至室温，过滤去渣，得人参皂苷RH2发酵产物，干燥浓缩至水分含量低于0.5wt%；
D、将C）步骤所得人参皂苷RH2发酵产物装入超临界萃取设备，加入人参皂苷RH2发酵产物重量的5%的无水乙醇（分析纯）作为夹带剂，进行萃取，将萃取产物在-50℃下冷冻干燥48h，得富含人参皂苷RH2的发酵物10.5g。
本实施例制备的产物中人参皂苷RH2含量为24wt%，经过计算，每g红参干粉的人参皂苷RH2产量为840ppm。
实施例5：
一种富含人参皂苷RH2的发酵物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
A、在无菌条件下，将人参内生真菌黑色附球孢菌接种到PDA培养基上，在28℃条件下供氧培养36h，氧浓度0.040mol/L。将培养好的菌种接种到含有PDA培养基成分的发酵摇瓶中，置于气浴恒温振荡器内，在25℃，200r/min条件下供氧培养8d，氧浓度0.040mol/L，摇瓶培养得到菌种后在相同条件下再次摇瓶培养，得扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基，扩培后培养基中人参内生真菌黑色附球孢菌菌浓度为3*104 CFU/mL；
B、将3.0kg红参粉末与45L蒸馏水投入发酵罐中，再将KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液加入发酵罐，调节发酵罐内料液pH=6.0，按每升料液4.0g的量投入纤维素酶，将料体加热至40℃，保温，酶解6h；酶解完成后，将料体加热至65℃，灭酶活，然后降温至室温；
C、无菌条件下，向反应釜内加入B）步骤中初始投入红参粉末质量分数8.0%的扩培人参内生真菌黑色附球孢菌培养基，加入B）步骤中初始投入红参粉末质量分数27.0%的MS液体培养基，所述MS液体培养基中含玉米淀粉6.0g/L，葡萄糖20.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L；再次加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐内料液pH=7.5，温度控制在35℃，保温、供氧发酵72h，氧浓度0.050mol/L，发酵完成降至室温，过滤去渣，得人参皂苷RH2发酵产物，干燥浓缩至水分含量低于0.5wt%；
D、将C）步骤所得人参皂苷RH2发酵产物装入超临界萃取设备，加入人参皂苷RH2发酵产物重量的5%的无水乙醇（分析纯）作为夹带剂，进行萃取，将萃取产物在-50℃下冷冻干燥48h，得富含人参皂苷RH2的发酵物8.9g。
本实施例制备的产物中人参皂苷RH2含量为23wt%，经过计算，每g红参干粉的人参皂苷RH2产量为680ppm。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。