一种细胞外基质蛋白肽及其提取方法和应用与流程

本发明涉及蛋白肽提取领域，具体而言，涉及一种细胞外基质蛋白肽及其提取方法和应用。
背景技术：
：相关基础研究对成纤维细胞在肿瘤过程中的作用进行了进一步研究，研究发现皮下注射致癌剂后，阳性成纤维细胞能聚积到致癌物周围，通过产生胶原来包裹致癌剂，从而阻止上皮细胞发生DNA损伤。利用小鼠特异性消除阳性成纤维细胞后，上皮细胞成为致癌剂的靶点，发生DNA损伤，并导致上皮肿瘤的发生。此外，致癌剂处理的一部分小鼠，长期“Tumorfree”,而使用胶原酶将包裹致癌剂的纤维包膜破坏后，小鼠很快发生肿瘤。该结果表明阳性成纤维细胞能通过分泌胶原，包裹致癌剂，从而阻止上皮恶变，抑制肿瘤的发生。该研究阐明了机体对抗肿瘤发生的一种新的机制。基础研究证实，肿瘤细胞在没有和(或)缺乏细胞外基质(ECM)蛋白存在时具有增殖能力。这种增殖能力反映了在整体条件下，肿瘤细胞通过侵袭和转移而存活和生长。基膜的断裂、缺失及减少破坏了基膜的完整性，使得肿瘤细胞易于穿越基质屏障。ECM的改变和重塑(Remodeling)是肿瘤侵袭和血管生成的基本条件。总之，脱落、粘附、降解、移动和增生是恶性肿瘤侵袭、转移的必然过程。细胞外基质(ECM,extracellularmatrix)蛋白和蛋白聚糖(proteoglycan)组成了基膜的网架(fyame-woyk)，主要含I型胶原(ColI)、IV胶原(ColIV)、氨基聚糖与蛋白聚糖以及弹性蛋白。某 些特定的解剖结构很少或不被肿瘤细胞侵袭，如肌腱、主动脉、角膜等。这种抗侵袭能力被认为是由于组织结构特点和分泌能包裹抑制肿瘤细胞侵袭的物质。细胞外基质蛋白肽是从牦牛最纯净的无血管结缔组织牛蹄筋分离萃取，基础及临床前研究证实能抑制酶降解的小分子量蛋白多肽，实际上是复合了多种蛋白酶抑制剂，内皮细胞生长抑制剂和重塑修复基质屏障及其它成分。能包裹肿瘤抑制发生。是肿瘤导致ECM的改变和重塑(Remodeling)重要靶点抑制剂。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种细胞外基质蛋白肽的提取方法，该方法通过将牛蹄筋破碎后，经酸碱处理后酶解而得，总蛋白质提取率≥90％；提取的细胞外基质蛋白肽中，I型胶原含量为58％-60％、IV胶原含量为30％-32％、糖蛋白(弹性蛋白)+蛋白聚糖(以氨基葡萄糖计)含量为2.9％-3.0％，L-羟脯氨酸(前胶原)含量13％-15％，肽平均分子量1200-1500道尔顿。本发明的第二目的在于提供一种所述的细胞外基质蛋白肽的提取方法提取得到的细胞外基质蛋白肽。本发明的第三目的在于提供一种所述的细胞外基质蛋白肽的提取方法提取得到的细胞外基质蛋白肽在制备治疗癌症药物中的应用。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：将牛蹄筋破碎后进行酸处理和碱处理；经中和反应后去除污水，加水进行均质，然后于70℃以上加热熬制，得到胶体；将所述胶体进行酶解，灭酶后即可得到细胞外基质蛋白肽。由于牛蹄筋质地紧密，富有弹性，其中的蛋白肽不容易提取。本发明提供的细胞外基质蛋白肽的提取方法，经过多次试验，将牛蹄筋破碎后，先经过酸处理，以将牛蹄筋中的细胞外基质蛋白释放出来；然后再经过碱处理，以进一步疏松牛蹄筋的结构，利于下一步提取；中和反应后，将处理后的牛蹄筋进行均质，得到牛蹄筋的浆状物，然后通过加热熬制，得到胶体；直接将胶体进行酶解，利于酶发挥作用，胶体中的蛋白通过充分的酶解，得到的蛋白肽的平均分子量为1200-1500道尔顿。本发明提供的细胞外基质蛋白肽的提取方法，总蛋白质提取率≥90％；提取的细胞外基质蛋白肽中，I型胶原含量为58％-60％、IV胶原含量为30％-32％、糖蛋白(弹性蛋白)+蛋白聚糖(以氨基葡萄糖计)含量为2.9％-3.0％，L-羟脯氨酸(前胶原)含量13％-15％。具体地，所述破碎是将牛蹄筋去杂后，放入高速组织捣碎机搅碎即可。高速组织捣碎机通过市售购买即可，如DS-1高速组织捣碎机。破碎后的牛蹄筋呈颗粒状，以利于下一步的处理。进一步地，所述酸处理包括浸酸和乏酸；所述碱处理包括浸碱和乏碱。其中，乏酸是将浸酸后的牛蹄筋压挤，将其中的酸液挤出即可；乏酸得到的牛蹄筋直接放入碱液中进行浸泡，浸泡后将牛蹄筋挤压，将其中的碱液挤出，即进行了乏碱的步骤。通过浸酸和乏酸，以将牛蹄筋中的细胞外基质蛋白充分释放出来；通过浸碱和乏碱，以进一步疏松牛蹄筋的结构，利于下一步的均质。为了达到更好的浸酸和浸碱的效果，优选地，所述浸酸采用质量百分数为10％～20％的稀盐酸；所述浸碱采用质量百分数为10％～20％的石灰水。更进一步地，在所述浸酸过程中，所述稀盐酸与牛蹄筋的重量比为1：1～2，所述浸酸的时间优选为50-70min；在所述浸碱过程中，所述石灰水与牛蹄筋的重量比为1：1～2,所述浸碱的时间优选为50-70min。进一步地，所述均质为：经过中和反应后的牛蹄筋与纯水按重量比为1∶2-3放入高速分散均质机进行均质；所述70℃以上加热熬制为：搅拌条件下，于温度72℃～80℃下反应5～6h，然后经过滤和浓缩得到所述胶体。其中，高速分散均质机通过市售购买即可，如FJ-200高速分散均质机。优选地，所述过滤采用离子吸附压板进行。通过离子吸附压板进行过滤，同时通过吸附去除其中的重金属离子如镉、铜、铁等等，得到的胶体质地更纯净，最终制得的细胞外基质蛋白肽口感更好。进一步地，酶解前先将所述胶体于72-75℃进行溶胶。通过加热溶胶，得到液体的溶液，以利于酶解的进行。为了使酶解的更充分，优选地，所述酶解为：溶胶后加入蛋白水解酶，调节温度为50～52℃，调节pH为8.7～9.2，反应2～3h；其中，所述胶体与所述蛋白水解酶的重量比为5000∶1～10000∶1。优选地，灭酶后还包括过滤、纳滤、灭菌、喷雾干燥以及包装即可得到细胞外基质蛋白肽成品。其中，过滤是为了去除较大颗粒的分子，通过纳滤进一步精制，再经过常规的灭菌和喷雾干燥，得到细胞外基质蛋白肽成品。本发明制得的细胞外基质蛋白肽成品口感好，服用方便，易于人体吸收。本发明还提供了由上述提取方法制得的细胞外基质蛋白肽。本发明提供的细胞外基质蛋白肽，I型胶原含量为58％-60％、IV胶原含 量为30％-32％、糖蛋白(弹性蛋白)+蛋白聚糖(以氨基葡萄糖计)含量为2.9％-3.0％，L-羟脯氨酸(前胶原)含量13％-15％，营养成分丰富。本发明制得的细胞外基质蛋白肽可直接服用，也可根据市场需求添加辅料制成各种药物剂型，如注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、乳剂、膏剂、霜剂、透皮贴剂等等，以便于服用和保存。本发明还提供了由上述提取方法制得的细胞外基质蛋白肽在制备治疗癌症药物中的应用。癌症的治疗方法，包括给予受试者有效量的细胞外基质蛋白肽。给药方式可以为口服、静脉注射或者是透皮渗透方式，施加于需要治疗的患者，具体可根据病人的病情、年龄等，由医师决定。本发明提供的细胞外基质蛋白肽经患者服用后，在体内修复基膜，包裹肿瘤，并且修复DNA损伤，达到限制肿瘤迁移以及增殖的目的，并且肿瘤细胞会逐步出现凋亡。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明提供的细胞外基质蛋白肽的提取方法，通过将牛蹄筋破碎后，经酸碱处理后酶解而得，总蛋白质提取率≥90％；其中，I型胶原含量为58％-60％、IV胶原含量为30％-32％、糖蛋白(弹性蛋白)+蛋白聚糖(以氨基葡萄糖计)含量为2.9％-3.0％，L-羟脯氨酸(前胶原)含量13％-15％，肽平均分子量1200-1500道尔顿。(2)本发明还选用了特定的酸和碱，以特定的浓度，处理特定的时间，以利于提取其中的蛋白肽。(3)本发明将牛蹄筋均质后还进行了熬制，然后经过滤和浓缩得到胶体，对胶体采用特定的条件进行酶解，使得到的肽平均分子量1200-1500道尔顿。(4)本发明过程中，过滤采用离子吸附压板进行，去除其中的重金属离子，使得到的细胞外基质蛋白肽安全，且口感好。(5)本发明提供的细胞外基质蛋白肽经癌症患者服用后，在体内修复基膜，包裹肿瘤，并且修复DNA损伤，达到限制肿瘤迁移以及增殖的目的，并且肿瘤细胞会逐步出现凋亡。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明提供的细胞外基质蛋白肽的提取方法流程示意图；图2为本发明实验例1中肿瘤模型组中的肿瘤组织侵犯包膜的活检显微图；图3为本发明实验例1中试验组中的肿瘤边缘规则，包膜完整的活检显微图；图4为本发明实验例1中肿瘤模型组中的肿瘤组织侵犯外周纤维结缔组织的活检显微图；图5为本发明实验例1中试验组中的肿瘤界限清楚有完整包膜的活检显微图；图6为本发明实验例2中的具体典型临床例患者2011-8-11的CT图；图7为本发明实验例2中的具体典型临床例患者2011-11-28的CT图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。图1为本发明提供的细胞外基质蛋白肽的提取方法流程示意图，具体通过以下实施例进行详细说明。实施例1一种细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：将牛蹄筋去杂后，放入DS-1高速组织捣碎机搅碎，破碎后的牛蹄筋浸入质量百分数为10％的稀盐酸中，浸泡70min；浸酸后进行挤压乏酸，然后放入质量百分数为10％的石灰水中，浸碱的时间为50-70min，浸碱完成后挤压乏碱；经乏碱后的牛蹄筋加酸进行中和，中和反应后去除污水，加纯水放入FJ-200高速分散均质机进行均质，牛蹄筋与纯水的重量比为1∶2；均质后在搅拌条件下，于温度72℃下反应6h，然后经离子吸附压板过滤，然后浓缩得到胶体；将胶体于72℃进行溶胶，溶胶后加入蛋白水解酶，调节温度为50℃，调节pH为8.7，反应3h；其中，胶体与蛋白水解酶的重量比为10000∶1；胶体酶解完成后，经灭酶、过滤、纳滤、灭菌、喷雾干燥以及包装即得到细胞外基质蛋白肽成品。总蛋白质提取率为92％；提取的细胞外基质蛋白肽中，I型胶原含量为58％、IV胶原含量为32％、糖蛋白(弹性蛋白)+蛋白聚糖(以氨基葡萄糖计)含量为2.9％，L-羟脯氨酸(前胶原)含量15％；细胞外基质蛋白肽的平均分子量为1500道尔顿。实施例2一种细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：将牛蹄筋去杂后，放入DS-1高速组织捣碎机搅碎，破碎后的牛蹄筋浸入质量百分数为20％的稀盐酸中，浸泡50min；浸酸后进行挤压乏酸，然后放入质量百分数为20％的石灰水中，浸碱的时间为50min，浸碱完成后挤压乏碱；经乏碱后的牛蹄筋加酸进行中和，中和反应后去除污水，加纯水放入FJ-200高速分散均质机进行均质，牛蹄筋与纯水的重量比为1∶3；均质后在搅拌条件下，于温度80℃下反应5h，然后经离子吸附压板过滤，然后浓缩得到胶体；将胶体于75℃进行溶胶，溶胶后加入蛋白水解酶，调节温度为52℃，调节pH为9.2，反应2h；其中，胶体与蛋白水解酶的重量比为5000∶1；胶体酶解完成后，经灭酶、过滤、纳滤、灭菌、喷雾干燥以及包装即得到细胞外基质蛋白肽成品。总蛋白质提取率为95％；提取的细胞外基质蛋白肽中，I型胶原含量为60％、IV胶原含量为30％、糖蛋白(弹性蛋白)+蛋白聚糖(以氨基葡萄糖计)含量为3.0％，L-羟脯氨酸(前胶原)含量13％；细胞外基质蛋白肽的平均分子量为1300道尔顿。实施例3一种细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：将牛蹄筋去杂后，放入DS-1高速组织捣碎机搅碎，破碎后的牛蹄筋浸入质量百分数为15％的稀盐酸中，稀盐酸与牛蹄筋的重量比为1：1，浸泡60min；浸酸后进行挤压乏酸，然后放入质量百分数为15％的石灰水中，石灰水与牛蹄筋的重量比为1：1，浸碱的时间为60min，浸碱完成后挤压乏碱；经乏碱后的牛蹄筋加酸进行中和，中和反应后去除污水，加纯水放入FJ-200高速分散均质机进行均质，牛蹄筋与纯水的重量比为1∶2.5；均质后在搅拌条件下，于温度75℃下反应5h，然后经离子吸附压板过滤，然后浓缩得到胶体；将胶体于73℃进行溶胶，溶胶后加入蛋白水解酶，调节温度为51℃，调节pH为9.0，反应2h；其中，胶体与蛋白水解酶的重量比为8000∶1；胶体酶解完成后，经灭酶、过滤、纳滤、灭菌、喷雾干燥以及包装即得到细胞外基质蛋白肽成品。总蛋白质提取率为94％；提取的细胞外基质蛋白肽中，I型胶原含量为60％、IV胶原含量为31％、糖蛋白(弹性蛋白)+蛋白聚糖(以氨基葡萄糖计)含量为3.0％，L-羟脯氨酸(前胶原)含量14％；细胞外基质蛋白肽的平均分子量为1200道尔顿。实施例4一种细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：将牛蹄筋去杂后，放入DS-1高速组织捣碎机搅碎，破碎后的牛蹄筋浸入质量百分数为15％的稀盐酸中，稀盐酸与牛蹄筋的重量比为1：2，浸泡60min；浸酸后进行挤压乏酸，然后放入质量百分数为15％的石灰水中，石灰水与牛蹄筋的重量比为1：2，浸碱的时间为60min，浸碱完成后挤压乏碱；经乏碱后的牛蹄筋加酸进行中和，中和反应后去除污水，加纯水放入FJ-200高速分散均质机进行均质，牛蹄筋与纯水的重量比为1∶3；均质后在搅拌条件下，于温度76℃下反应5h，然后经离子吸附压板过滤，然后浓缩得到胶体；将胶体于74℃进行溶胶，溶胶后加入蛋白水解酶，调节温度为52℃，调节pH为9.0，反应2h；其中，胶体与蛋白水解酶的重量比为7000∶1；胶体酶解完成后，经灭酶、过滤、纳滤、灭菌、喷雾干燥以及包装即得到细胞外基质蛋白肽成品。总蛋白质提取率为95％；提取的细胞外基质蛋白肽中，I型胶原含量为59％、IV胶原含量为30％、糖蛋白(弹性蛋白)+蛋白聚糖(以氨基葡萄糖计)含量为3.0％，L-羟脯氨酸(前胶原)含量14％；细胞外基质蛋白肽的平均分子量为1300道尔顿。实验例1非小细胞肺癌(Non-SmallCellLungCancer,NSCLC)是临床最常见的恶性肿瘤，大多数患者在临床诊断时已属于晚期，失去手术治疗机会，而含铂类药物联合化疗方案失败后则缺乏有效的治疗方法。因此寻找有效的治疗方法已成为NSCLC研究的热点。经基础研究表明，本发明提供的细胞外基质蛋白肽对NSCLC生长及各种恶性实体瘤有良好的抑制作用。可能会提高NSCLC临床疗效，为此进行了以下实验。1.材料1.1动物与细胞系BALB/C-nu裸鼠40只，6～8周龄，SPF级，雌雄各半，由中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤医院实验动物室繁育并提供。动物生产合格证号：京动许字(2013)第016号；动物合格证号:SCXK京2007－0005，在动物实验中心屏蔽系统辅以洁净层流柜环境中饲养。人肺 腺癌(A549)细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所检测中心常规保存并提供。1.2药物本发明实施例制得的细胞外基质蛋白肽。1.3仪器超净工作台系苏州宏瑞净化科技有限公司生产(型号SCW-CJ)；实验用离心机系江苏恒瑞制药机械有限公司生产(型号LS150)；倒置显微镜系日本NIKON株式会社生产(型号TS100)；游标卡尺系中国杭州工具量具有限公司生产(型号HGL-18-1)；奥豪斯电子精密天平系美国OHAUS公司产品(型号ARA520)；Forma恒温培养箱为美国Forma公司产品(型号3110)。2.方法2.1细胞培养与接种人源可移植性肺腺癌(A549)细胞系用含10％小牛血清的DMEM培养液培养，细胞长满单层后用0.25％胰蛋白酶消化，培养液吹打、离心，收集细胞用PSB稀释，浓度调至1×107个细胞/ml，每只小鼠以0.2ml接种于右腋皮下，待肿瘤长至体积约为1000mm3时移植。2.2造模及分组选择生长良好、瘤结无破溃的荷瘤裸鼠，拉断颈椎处死，在净化工作台内，无菌条件下完整剥离瘤结，用生理盐水洗去血渍，剪开瘤结，清除中心坏死组织，充分匀浆制备瘤细胞悬液，加生理盐水稀释细胞数至1×107个细胞/mL。取0.2ml/只，接种于裸鼠右腋窝皮下，接种在30min内完成。10天后肿瘤体积约在100-300mm3之间(16只裸鼠造模全部成功)时，根据性别分层，按肿瘤体积大小随机分为肿瘤模型组和试验组，每组8只，称体重标号。2.3给药剂量与方法给药剂量均采用人与动物剂量换算法确定。①肿瘤模型组，生理盐水每天0.2ml/10g灌胃；②试验组包括试验组1-4，分别对应食用实施例1-4制得的细胞外基质蛋白肽，每个试验组中，细胞外基质蛋白肽按7.875g/kg/d(成人治疗量63g/70kg/d换算)给药，生理盐水配置浓度为5.625mg/ml，每天0.2ml/10g灌胃；分组当天开始给药，每天一次，连续14天。2.4计算方法药物处理前、后每4天用毫米游标卡尺测量肿瘤长、宽最大垂直直径。按如下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长径×肿瘤短径2/2。用药结束后2天处死裸鼠，取出肿瘤，称重。按如下公式计算肿瘤抑制率：抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。2.5统计方法采用SPSS13.0统计软件进行数据处理。干预治疗前后小鼠体重以及肿瘤体积以sx±表示，并采用t检验，组间比较采用F检验，当p<0.05时被认为有统计学意义；肿瘤抑制率以百分率表示。3.结果3.1一般性观察实验前各组裸鼠一般状况良好，实验结束时40只裸鼠全部存活。动态观察发现，模型对照组裸鼠觅食、饮水正常，但活动减少，反应较迟钝；试验组裸鼠觅食、饮水、活动等状况良好。3.2肿瘤体积变化从分组用药开始到实验结束，移植瘤体积变化见表1。表1实验各组肿瘤体积的动态变化(sx±)与肿瘤模型组比P＜0.01从表1中可见，从第4天开始，试验组肿瘤体积与模型组相比，有统计学意义(P＜0.01)，并具有明显的抑制作用。3.2肿瘤抑制率不同组别肿瘤重量以及计算得到的肿瘤抑制率如表2所示。表2实验各组肿瘤重量及抑瘤率(sx±)分组N瘤重g肿瘤抑制率(％)肿瘤模型组81.59±0.45-试验组180.88±0.3344.65试验组280.90±0.3443.40试验组380.89±0.3244.02试验组480.88±0.2844.65与模型组比P＜0.01。细胞外基质蛋白肽单独使用时抑瘤率达到40％以上，与模型组相比，有统计学意义(P＜0.01)，同时说明细胞外基质蛋白肽对A549生长有明显的抑制效果。4.活检镜下包膜评价对不同组别的肿瘤于显微镜下进行活检观察，结果如图2-图5所示。图2为肿瘤模型组中的肿瘤组织侵犯包膜的活检显微图；图3为试验组中的肿瘤边缘规则，包膜完整的活检显微图；图4为肿瘤模型组中的肿瘤组织侵犯外周纤维结缔组织的活检显微图；图5为试验组中的肿瘤界限清楚有完整包膜的活检显微图。不同试验组中肿瘤的活检显微图结果一致。从图2-5可以看出，细胞外基质蛋白肽干预组中，肿瘤边缘规则，肿瘤界限清楚，有完整包膜；而对照组中的肿瘤组织侵犯包膜以及浸润外周纤维结缔组织。说明本发明提供的细胞外基质蛋白肽对人肺腺癌生长抑制作用，为进一步深入研究细胞外基质蛋白肽抗肿瘤及重建肿瘤基质屏障提供依据。非小细胞肺癌属常见高发恶性肿瘤，对放化疗敏感性较差，是目前研究的重点。本发明提供的细胞外基质蛋白肽可能通过重建肿瘤基质屏障，抑制了癌细胞的增殖、移行等侵袭能力，下调VEGF、上调TIMP-2的表达，抑制肿瘤微血管的生成，降低肿瘤微血管密度；影响内皮细胞的增殖，减少肿瘤细胞的血供。本试验例将人源可移植性肺腺癌(A549)细胞系经传代培养后，以BALB/c-nu祼鼠进行肿瘤移植，并以细胞外基质蛋白肽进行干预性治疗，通过观察抑瘤率及活检镜下包膜评价单用细胞外基质蛋白肽对A549移植瘤生长抑制作用。实验室裸鼠模型试验发现，治疗组与对照组比较，皮下肿瘤生长明显受抑，肺转移受抑，并能明显抑制根治切除术后的复发转移，病理示肿瘤包膜完整，光滑。肿瘤血管明显 受抑，细胞凋亡明显较多。可见，本发明提供的细胞外基质蛋白肽具有很好的抑制癌的生长和转移的效果。实验例2实施例1-4制得的细胞外基质蛋白肽成品可以直接食用，也可通过添加药学上可接受的辅料加工成其他药物剂型，如注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、乳剂、膏剂、霜剂、透皮贴剂等。本实验例中，以实施例1-4制得的细胞外基质蛋白肽成品进行临床食疗效果的验证。1.病例入选标准：在2008年4月至2014年3月为354例癌症患者进行了细胞外基质蛋白肽食疗，每次10g，每天5-6次；并将这些病例进行了统计。2.临床资料：随访率达97.7％，平均随访时间47.7个月(25.0～83.9个月)。其中男性占82.8％(293例)；女性占17.2％(61例)，平均年龄49.3岁(14～71岁)。3.分组方法：所有病例分为六组：按照肿块大小分为三期：①早期，肿块直径＜3厘米；②中期，肿块直径＞3厘米，出现或者可能出现淋巴结转移；③晚期，肿块直径＞3厘米，已经出现淋巴结和其他器官转移；按照以前治疗情况，每期分为两类：①未经过手术、放疗、化疗者，称之为A。②经过手术、放疗、化疗之一的治疗者，称之为B。统计生存率，结果如表3所示。表3生存率临床统计例数1年3年5年早期A53100％100％100％早期B90100％97.7％94.4％中期A62100％96.8％80.6％中期B11496.5％85％74.5％晚期A2692.3％68.8％53.8％晚期B966.7％22.2％11.1％总病例35497.5％89.8％87.3％从表3可以看出，早期患者的食疗效果，优于中期、晚期的癌症患者；无论早期、中期、晚期的癌症患者，未经过手术、放疗、化疗者，使用细胞外基质蛋白肽的效果，优于经过手术、放疗、化疗患者。具体典型临床例：肺腺癌伴胸腔积液患者女性，34岁。患者于2011年7月份无明显诱因出现右侧胸痛，呈持续性痛，无发热盗汗及胸闷气紧，无头晕头疼，无恶心呕吐及其他不适。曾在当地医院治疗(具体治疗不详)，症状无明显好转。于20011-7-9至2011-7-13进行胸部CT示右侧胸腔积液。胸水检查示：见腺癌细胞。于2011-7-15日转入于某肿瘤医院行胸腔穿刺抽液及行一程化疗，化疗方案为：培美曲塞+顺铂；化疗过程顺利。于2011-8-11进行第二程化疗，入院后完善相关检查，胸部CT示：右肺上叶见一不规则中度强化影，右侧胸腔大量积液，胃小弯淋巴结肿大；行胸腔穿刺抽液及对症支持治疗，予以吉西他滨+顺铂方案行二程化疗，患者除中度厌食及疲乏外，其他症状好转，于2011-8-25出院。出院二周余右胸又出现持续性疼痛并有牵扯感，到当地县医院胸腔X光扫示：右侧胸腔大量积液。遂放弃第三程化疗，于2011-9-18开始食用本发明提供的细胞外基质蛋白肽进行食疗控制胸水和病情。由于患者疲乏、消瘦、厌食、咳嗽、脱发、右胸持续性疼痛并牵扯感明显，采用以下方式进行：一、用苹果+白萝卜等鲜榨汁口服升提胃气，增强消化吸收功能、激活吞噬细胞活性；二、每天口服60克本发明提供的细胞外基质蛋白肽重建基质屏障(ECM，包围圈)，修复侵袭破溃的胸膜和结节；三、喝小米粥等粗粮，过午不食，保持气化和吸收；四：喝鲤鱼牛肉汤增强营养；五：严格遵守饮食禁忌等。20余天后症状好转。坚持约70天后于2011-11-28进行CT检查；图6为2011-8-11的CT图；图7为2011-11-28的CT图，两者对比可知：患者右肺上叶片块影较前缩小、浅薄，纵隔窗大小约2.5*1.4cm，其周围支气管扩张，并见斑片状模糊影分布。右肺上叶尖段纵隔旁可见一小结节，较前稍缩小。右肺中叶少许条索状影，边界清。双肺纹理粗乱，肺透亮度增高。双肺门未见增大。纵膈内未见肿大淋巴结。右侧胸腔积液已吸收，左侧胸腔未见积液。取得了显著的好转现象。肺癌的细胞分为两大型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌，非小细胞肺癌(NSCLC)又可以分为鳞癌、腺癌、大细胞等亚型。小细胞肺癌的特点是多见男性青少年，生长快，18天倍增一次，放化疗非常敏感，停药易复发，非常容易脑转移，化疗必须做到12次以上且愈后不佳。得了肺癌是不幸的，但得了肺腺癌是不幸中的不幸，肺腺癌的特点是多见女性和不抽烟的男性，小腺癌，大转移，转移早，复发快，脑转移，骨转移，非常容易出现胸水，放化疗不敏感，预后差，死亡率高。本患者穿刺抽液病理诊断是肺腺癌，胸膜转移已有大量的癌性胸水。两次穿刺抽液并两次化疗，而反复大量胸水未能控制(化疗不敏 感)，并出现肺实质性损伤(慢性支气管炎、肺气肿征象，右肺中叶少许纤维灶等)副作用。临床表明本发明提供的细胞外基质蛋白肽对恶性实体瘤的基质屏障重建(包裹修复)，肿块缩小，像良性肿瘤一样边缘光滑、轮廓清晰，对控制病情进展意义重大。病理显示，癌症发生时，窦壁胶原及层连蛋白的阳性表达明显增强，且呈不同程度的片状缺失或消失，在低分化癌组织中尤为明显。基膜的断裂、缺失及减少破坏了作为屏障的完整性，使得肿瘤细胞易于穿越基膜屏障进入血管循环及侵袭其他器官。本发明提供的细胞外基质蛋白肽经癌症患者服用后，在体内修复基膜，包裹肿瘤，并且修复DNA损伤，达到限制肿瘤迁移以及增殖的目的，并且肿瘤细胞会逐步出现凋亡。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页1 2 3