本发明涉及一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的制备方法，属于生物工程领域。
发明背景
寡肽-1是由53个氨基酸组成的单链多肽，分子量是6216道尔顿，多肽中没有丙氨酸，苯丙氨酸和赖氨酸。寡肽-1通过传导信号，引起细胞内一系列生化变化，启动与细胞分裂有关的基因，使静止细胞进入细胞分裂周期，达到修补增生肌肤表层细胞，从而使细胞增殖，对受伤、受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。寡肽-1极微量即能强烈促进细胞的分裂和生长,其最大特点是能够促进细胞的增殖分化,从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。最初的寡肽-1主要被运用于医学领域，主要用于促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤、促进伤口愈合、修复肠胃道、肝脏和眼角膜的损伤等，功效十分显著。
虽然寡肽-1广泛的存在于人体体液中，但含量极低，以提取的方式获得远远不能满足于市场的需求。尽管目前已有一些寡肽-1的基因工程生产方法，但这些方法均存在着发酵液中产物浓度低，提取工艺复杂，操作成本高及收率低等缺点，因此，至今为止，尚未有一个成熟的基因工程下游生产技术来生产寡肽-1。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种方法简单、不受环境影响、周期短的利用大肠杆菌表达寡肽-1的制备方法。
为了达到上述目的，本发明采取下列措施：
一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的制备办法，生产步骤如下：
⑴工程菌发酵：
从保存的菌种管中挑取单菌落接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中达到一定的浓度，经摇床培养，按比例的接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其继续在摇床培养，之后，再按比例的接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中培养，然后温度诱导，继续培养一定时间。寡肽-1表达于菌种中。
⑵分离纯化宿主细胞的表达产物：
用冷冻离心机将发酵液离心，弃上清液保留沉淀保存备用。取适量沉淀，用数倍量的缓冲液溶解，经高压均质机处理，再用冷冻离心机将缓冲液离心，弃上清液，取沉淀用裂解液 溶解，再离心，收集上清液，用层析系统将该上清液加入扩张床中，用缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用缓冲液以一定比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰，再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将复性液液加入扩张床中，用精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用氯化钠和精氨酸缓冲液以一定比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰，洗脱液在一定温度条件下保存备用。
用层析系统将洗脱液加入到凝胶层析柱中，然后将精氨酸缓冲液洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，收集原液。
⑶冷冻干燥：
将收集液冷冻干燥，得白色干粉状寡肽-1。
具体实施方式
实施例一：
⑴工程菌发酵：
从-80℃保存的菌种管中挑取单菌落接入2-10ml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到10-200ug/ml，28—32℃，50—250rpm摇床培养8—12小时，按1—8％接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在10—200ug/ml，28—32℃，50—250rpm摇床培养8—12小时，再按1—8％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，28—32℃，100—200rpm，PH值维持7.0，培养9—11小时，然后温度诱导，继续培养2—8小时。寡肽-1表达于菌种中。
⑵分离纯化宿主细胞的表达产物：
用冷冻离心机将发酵液与2—18℃条件下以6000—12000rpm的速度离心10—30min，弃上清液保留沉淀于4℃条件下保存备用。取适量沉淀，用5倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，用高压均质机处理1-5遍，再用冷冻离心机将缓冲液于2-20℃条件下以6000-12000rpm的速度离心5-30min，弃上清液，取沉淀用10-40倍裂解液溶解，6000-12000rpm的速度离心30min，收集上清液。用层析系统将该上清液以1.5—40ml/min速度加入source 30Q离子交换扩张床中，用10mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含1M氯化钠10mMTris缓冲液以3％比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰。再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将2000—4000ml的复性液以1—40ml/min的速度加入source 30Q离子交换扩张床中，用5mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含0.15M氯化钠5mM精氨酸缓冲液以10％比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰，洗脱液于2—18℃条件下保存备用。
用层析系统将上面洗脱液以1—10ml/min的速度加到Superdex30凝胶层析柱中，然后将 5mM精氨酸缓冲液以1—10ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰。
⑶冷冻干燥：
将收集液于-35℃至-42℃下冷冻干燥，得白色干粉状寡肽-1。
实施例二：
⑴工程菌发酵：
从-80℃保存的菌种管中挑取单菌落接入8ml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50ug/ml，31℃，100rpm摇床培养10小时，按3％接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在50ug/ml，31℃，100rpm摇床培养10小时，再按3％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，31℃，200rpm，PH值维持7.0，培养10小时，然后温度诱导，继续培养4小时。寡肽-1表达于菌种中。
⑵分离纯化宿主细胞的表达产物：
用冷冻离心机将发酵液与4℃条件下以8000rpm的速度离心15min，弃上清液保留沉淀于4℃条件下保存备用。取适量沉淀，用5倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，用高压均质机处理2遍，再用冷冻离心机将缓冲液于4℃条件下以8000rpm的速度离心20min，弃上清液，取沉淀用15倍裂解液溶解，8000rpm的速度离心30min，收集上清液。用层析系统将该上清液以6ml/min速度加入source 30Q离子交换扩张床中，用10mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含1M氯化钠10mMTris缓冲液以3％比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰。再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将3000ml复性液以10ml/min的速度加入source 30Q离子交换扩张床中，用5mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含0.15M氯化钠5mM精氨酸缓冲液以10％比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰，洗脱液于4℃条件下保存备用。
用层析系统将上面洗脱液以5ml/min的速度加到Superdex30凝胶层析柱中，然后将5mM精氨酸缓冲液以5ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰。
⑶冷冻干燥：
将收集液于-40℃下冷冻干燥，得白色干粉状寡肽-1。
利用上述方法制得的寡肽-1，具有产量大(大于400mg/L)，提取工艺简单(只需要3步层析操作，较之前工艺简化1倍)，操作成本低及纯度高(98％以上)的特点，是一个较为成熟的工业化生产工艺，经济效益十分显著。